植病研究法細菌病害的研究法

第一節(jié)植物病原細菌的鑒定1．細菌病害標(biāo)本的檢查(1)癥狀的觀察植物細菌病害表現(xiàn)各種類型的癥狀，不同屬的細菌侵染植物后引起的癥狀有所不同。棒形桿菌屬細菌主要引起萎蔫，假單胞菌屬細菌主要引起葉斑和葉枯（少數(shù)枝枯、蔫萎和軟腐），黃單胞菌屬細菌主要引起葉斑和葉枯，土壤桿菌屬細菌主要引起瘤腫（少數(shù)其他畸形），歐文氏菌屬細菌主要引起軟腐（少數(shù)蔫萎和枝枯）。這樣的區(qū)分雖然不是絕對的，但是指出它們之間的關(guān)系，在診斷上是很有意義的。許多細菌性病害的病斑帶有水漬狀，有時可以作為診斷的特征，但并不是所有細菌病害都是這樣。病部有時有菌膿排出。菌膿灰白色到黃色，珠狀或其他形狀，干燥后在表面形成菌膜。第1頁/共57頁第一頁，共58頁。第二節(jié)病原細菌的分離培養(yǎng)植物病原細菌一般都是用稀釋分離法。病原細菌在組織中的數(shù)量很大，稀釋培養(yǎng)可以使病原細菌與雜菌分開，形成分散的菌落，容易分離得到純培養(yǎng)。組織分離法對病原細菌是不適用的，原因是它不能使病原細菌與雜菌分開，雜菌生長快，會抑制病原細菌的生長。稀釋分離有以下兩種方法。第2頁/共57頁第二頁，共58頁。1.培養(yǎng)皿稀釋分離法

取滅菌的培養(yǎng)皿3個，每個培養(yǎng)皿中加滅菌水0.5ml，切取約4mm見方的小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過3次以后，移在第一個培養(yǎng)皿的水滴中。用滅菌的玻棒將病組織研碎，靜置10～15min，使組織中的細菌流入水中(配成懸浮液)，然后用滅菌的移植環(huán)從第一個培養(yǎng)皿中移植3環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，充分混合后再移植3環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。然后，將溶化的瓊膠培養(yǎng)基冷卻到45℃左右，倒在三個培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，在適溫下培養(yǎng)。培養(yǎng)皿用記號筆注明分離材料、日期和稀釋編號。第3頁/共57頁第三頁，共58頁。細菌懸浮液的配法有時影響分離的效果。一般植物病原細菌，用滅菌水稀釋是適宜的。有時改用滅菌的生理食鹽水(0.85%的NaCl)或肉汁凍培養(yǎng)液稀釋比較好。如水稻白葉枯病細菌，用蛋白胨水或粘土懸浮液稀釋的，培養(yǎng)后形成菌落的數(shù)目比用清水稀釋的多。粘土的作用大致是細菌團聚在土粒上，更容易形成菌落。第4頁/共57頁第四頁，共58頁。第5頁/共57頁第五頁，共58頁。2.平板劃線分離法

取小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過2次以后，放在滅菌載玻片上的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移植環(huán)蘸取以上組織液在瓊膠平板上劃線培養(yǎng);先在平板的一側(cè)順序劃3～5條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°將移植環(huán)滅菌后,從第二條線末端，順序劃出3-5條線。目的都是使細菌分開形成分散的菌落。

第6頁/共57頁第六頁，共58頁。劃線分離法的關(guān)鍵是要等到瓊膠平板表面的冷凝水完全消失后才能劃線，否則細菌將在冷凝水中流動而影響形成單個分散的菌落。為了加快消除冷凝水，可以將培養(yǎng)皿在37℃的溫箱中放一二天，或者在無菌的條件下，將培養(yǎng)皿的蓋打開，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿斜靠在蓋上，在50℃的干燥箱中干燥30min。第7頁/共57頁第七頁，共58頁。第8頁/共57頁第八頁，共58頁。植物病原細菌的分離還需注意：

[1]分離材料新鮮

要從新鮮的標(biāo)本和新的病斑分離。存放太久的標(biāo)本，其中病原細菌的生活力減弱，而腐生性細菌則滋長很快，從這種組織分離到的大都是腐生菌。分離用的標(biāo)本最好是夾在吸水紙中郵寄，放在塑料袋中保濕是不適宜的。

標(biāo)本保存的時間較長而不容易直接分離成功，可以經(jīng)過接種后再分離.例如，分離軟腐病細菌時，由于腐爛組織中往往雜有大量的腐生菌，可以挑取少許腐爛組織針刺接種在相應(yīng)的健全組織上，發(fā)病以后再從接種的組織上分離。第9頁/共57頁第九頁，共58頁。[2]適宜的培養(yǎng)基

分離失敗的原因，有時是由于培養(yǎng)基不適宜。一般來說，寄生性細菌對培養(yǎng)基的要求要比腐生性細菌嚴格。同時，一種適宜于純培養(yǎng)的培養(yǎng)基(細菌群集沒有其他雜菌干擾)，不一定適宜于分離(細菌分散而單獨存在，同時還可能有雜菌干擾)。因此，分離時要選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，有時要用選擇性培養(yǎng)基。但有時失敗的原因不是培養(yǎng)基的成分不適宜，而是由于培養(yǎng)基的酸度不適當(dāng)或存放的時間太長。因此，在滅菌后和使用前，最好是再核對一下培養(yǎng)基的酸度。

第10頁/共57頁第十頁，共58頁。二、分離培養(yǎng)基（1）通用培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基（2）屬和種的選擇性培養(yǎng)基[1]土壤桿菌屬(Agrobacterium)一般是用甘露糖醇培養(yǎng)基

甘露糖醇15g硝酸鈉(NaNO3)5g硝酸鈣[Ca(NO3)z·4Hz0320mg磷酸氫二鉀(K2HPO4)2g氯化鋰(LiCl)6g硫酸鎂(MgSO4·7H20)0.2g溴百里酚藍0.1g瓊膠15g蒸餾水1000ml

滅菌后酸度是pH7.2，培養(yǎng)基呈深藍色。土壤桿菌屬細菌的菌落圓形、凸起、發(fā)亮，最初淺藍色，以后深綠色。溴百里酚藍抑制革蘭氏反應(yīng)陽性的細菌，氯化鋰抑制假單胞菌屬細菌。以上培養(yǎng)基，已有選擇性培養(yǎng)基的作用，以甘露糖醇作為碳源是它的特點。第11頁/共57頁第十一頁，共58頁。[2]假單胞菌屬(Pseudomonas)沒有特殊的營養(yǎng)要求，許多培養(yǎng)基都可用于分離。常用的培養(yǎng)基有：①甘油酪朊水解物培養(yǎng)基

甘油10ml蔗糖10g酪朊水解物1g氯化銨(NH4c1)5g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)2.3g硫酸十二烷基鈉0.6g瓊膠15g蒸餾水1000ml|pH值6.8由于培養(yǎng)基中含有十二烷基硫酸鈉，已經(jīng)有一定的選擇性。②金氏培養(yǎng)基B(King‘smediumB)，分離有熒光的假單胞菌

蛋白胨20.0g甘油10.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.5g瓊膠15.0g蒸餾水1000mlpH7.2。

熒光假單胞菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生可擴散的青或褐色的色素，紫外線照射顯示青到藍色。此培養(yǎng)基也可用于歐文氏菌屬(Erwinia)細菌的分離。第12頁/共57頁第十二頁，共58頁。③Kelmen(1954)TTC培養(yǎng)基：

蛋白胨10.0g酪朊水解物1.0g葡萄糖5.0g瓊膠15.0g蒸餾水1000mlpH7.0分裝100ml，滅菌后。加過濾滅菌的1%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液到滅菌冷卻到55℃的培養(yǎng)基中，使?jié)舛茸詈筮_到0.005%。青枯菌P.solanacearum

培養(yǎng)2天后，致病力強的野生型菌落白色，或中間有一淡紅色點的菌落；致病力弱或喪失致病力的菌落深紅色，邊緣帶藍色。第13頁/共57頁第十三頁，共58頁。[3]黃單胞菌屬(Xanthomonas)①蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基(Aaywood1960)

蔗糖2.0%蛋白胨0.5%磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.05%

硫酸鎂(MgSO4·7H20)0.025%瓊膠1.5%蒸餾水1000mlpH7.2～7.4這是分離Xanthomonas屬細菌最常用的培養(yǎng)基，也適用于假單胞菌屬、歐文氏菌屬和有些棒桿菌屬的細菌，②SX瓊膠培養(yǎng)基(SchaadandWhite，1974)

可溶性淀粉10g牛肉浸膏5g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2g瓊膠15g蒸餾水1000ml

適用于分離可以水解淀粉的X.campestris的致病變種。必要時還可以加1%甲基紫B的20%的酒精溶液lml，甲基綠的1%水溶液2ml，和環(huán)己酰亞胺250mg，提高它的選擇性。

第14頁/共57頁第十四頁，共58頁。[4]歐文氏菌屬(Erwinia)前面介紹的培養(yǎng)基有許多也適用于歐文氏菌屬，以下是對歐文氏菌具有特色的結(jié)晶紫聚果膠培養(yǎng)基。將攪碎器預(yù)加熱，加500ml煮沸的蒸餾水，將以下成分依次加入，低速攪拌:

結(jié)晶紫的10%水溶液1.0mllmol/L氫氧化鈉(NaOH)4.5ml氯化鈣(CaCl2·2H2O)新鮮配制的1%水溶液4.5ml瓊膠2g硝酸鈉(NaNO3)1.0g隨后將聚果膠酸鈉加入，高速攪拌15s，分裝三角瓶滅菌后要立即倒入培養(yǎng)皿，制成平板干燥后使用。歐文氏菌屬細菌有分解果膠酶活性的，形成中間有凹陷的菌落。第15頁/共57頁第十五頁，共58頁。[5]棒形桿菌屬(Clavibacter)此屬細菌有些是難培養(yǎng)的。酵母葡萄糖礦物鹽瓊膠培養(yǎng)基(YGM)是很好的一種。

酵母浸膏2.0g葡萄糖2.．5g磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.25g磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.25g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1g硫酸錳(MnSO4)0.15g氯化鈉(NaCl)0.05g

硫酸鐵(FeSO4·7H2O)0.005g瓊膠15.0g蒸餾水1000ml適用于分離棒桿菌．也適用于Xanthomonas。第16頁/共57頁第十六頁，共58頁。第三節(jié)培養(yǎng)性狀

培養(yǎng)性狀對細菌的鑒定是很重要的。不同屬的植物病原細菌，它們的培養(yǎng)性狀顯然不同。不同種的植物病原細菌，很難根據(jù)它們的培養(yǎng)性狀區(qū)別，但可以作為最后鑒別的參考

1.培養(yǎng)性狀的描述培養(yǎng)性狀要分別在培養(yǎng)液、瓊膠斜面和瓊膠平板上觀察。描述時，要指明培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等。第17頁/共57頁第十七頁，共58頁。[1]培養(yǎng)液培養(yǎng)性狀

肉汁凍培養(yǎng)液常常用來觀察培養(yǎng)性狀。培養(yǎng)性狀主要是指生長量、表面生長情況、色素的產(chǎn)生、有無沉淀和特殊氣味等。表面的生長情況包括是否形成菌膜和菌環(huán)以及它們的厚度、細菌是否形成團狀的漂浮物。培養(yǎng)液表面下生長的情況包括混濁程度，是均勻的云霧狀還是形成團粒狀和片狀的菌團。底部的性狀則指有無沉積物和沉積物的形狀。第18頁/共57頁第十八頁，共58頁。[2]瓊膠斜面培養(yǎng)性狀

斜面的培養(yǎng)性狀:生長量的多少、菌苔的形狀、顏色光澤和粘度，以及培養(yǎng)基的顏色和有無特殊的氣味等。細菌學(xué)上往往將菌苔的形狀分為絲狀、念珠狀、薄膜狀、分枝狀和根狀等。菌苔的表面有光滑的、不平整的和有皺褶的。菌苔的顏色也不同，質(zhì)地有粘質(zhì)的、膜質(zhì)的或蠟質(zhì)的。菌苔有透明的、半透明或不透明的，表面有暗色的或發(fā)亮的。第19頁/共57頁第十九頁，共58頁。[3]瓊膠平板培養(yǎng)性狀

了解平板上菌落的特征，有助于判斷分離是否正確和挑取所需的菌落。瓊膠平板上菌落的觀察主要是：形狀和大小、顏色和光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣的形狀、透明度和粘度、培養(yǎng)基顏色的變化等。

第20頁/共57頁第二十頁，共58頁。2.細菌的色素非水溶性色素:不能擴散到培養(yǎng)基中，所以菌落表現(xiàn)不同的顏色，而培養(yǎng)基則不改變顏色。黃單胞菌屬的細菌能夠形成非水溶性的黃色素，所以菌落是黃色的。

不能將形成黃色菌落的植物病原細菌都當(dāng)作黃單胞菌屬的細菌。如玉米蔫萎病細菌，曾經(jīng)分在黃單胞菌屬中，但是根據(jù)它的黃色素與黃單胞菌屬的細菌顯然不同，現(xiàn)在已經(jīng)分在泛生菌屬(Pantoea)。歐文氏菌屬的細菌，除去有些可產(chǎn)生非水溶性的藍色素外，有的也能產(chǎn)生非水溶性的黃色素，菌落也呈黃色。有些棒桿菌屬細菌也能形成黃色菌落。

第21頁/共57頁第二十一頁，共58頁。水溶性色素:

擴散到培養(yǎng)基中就能使培養(yǎng)基變色，其中有些色素是熒光性的。假單胞菌屬細菌能否產(chǎn)生熒光性色素，是很重要的分類特征。色素的產(chǎn)生與培養(yǎng)基有關(guān)，如在新鮮牛肉配成的培養(yǎng)基上，熒光性色素的產(chǎn)生要比用牛肉浸膏配成的更為明顯。為了測定假單胞菌屬細菌色素的產(chǎn)生，可用特殊的如金氏培養(yǎng)基,有兩種配方：

第22頁/共57頁第二十二頁，共58頁。

培養(yǎng)基I培養(yǎng)基Ⅱ蛋白胨2g2g硫酸鉀(K2SO4)lg一甘油1g1g氯化鎂(MgCl2)0.14g一磷酸氫二鉀(K2HPO4)一0.15g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)一0.15g瓊膠(水洗)2g2g蒸餾水100ml100ml

酸度調(diào)節(jié)到pH7.2。培養(yǎng)基I適用于觀察非熒光性色素，培養(yǎng)基Ⅱ適用于觀察熒光性色素。熒光性色素的產(chǎn)生可以直接觀察或用紫外線照射觀察。第23頁/共57頁第二十三頁，共58頁。四、細菌的計數(shù)細菌的繁殖量、植物接種和血清學(xué)方面的研究都要求知道細菌的數(shù)量。細菌計數(shù)的方法有：

①測數(shù)器計數(shù)法；

②混濁度計數(shù)法；

③平板菌落計數(shù)法。前兩種方法是計數(shù)活的和死的細菌的總數(shù)，后一種方法是測定活細菌數(shù)目。第24頁/共57頁第二十四頁，共58頁。（1）測數(shù)器計數(shù)法紐鮑爾(Neubauer)血球計數(shù)板是常用的一種。它是一塊很厚的載玻片，上面劃有每邊長為O.05mm的小方格，方格的深度是0.1mm。測數(shù)時，先將蓋玻片放在計數(shù)計上有刻度的位置，從蓋玻片的一側(cè)加小滴適當(dāng)稀釋的孢子懸浮液，然后在顯微鏡下觀察每小格中孢子的數(shù)目；觀察80小格，以它的平均數(shù)乘以4000000，就是每毫升懸浮液中孢子的數(shù)目。第25頁/共57頁第二十五頁，共58頁。第26頁/共57頁第二十六頁，共58頁。第27頁/共57頁第二十七頁，共58頁。測定時注意事項：（1）取待測稀釋菌懸液向血球計數(shù)板加樣前，須將菌懸液充分搖勻。（2）加樣過程中，應(yīng)避免將菌液滴在蓋玻片（3）由于菌體在計數(shù)室中處于不同空間位置，須在不同焦距下才能觀察到，故觀察時須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，計數(shù)菌液中全部菌體，盡量避免遺漏。第28頁/共57頁第二十八頁，共58頁。實驗步驟1、鏡檢計數(shù)室：對計數(shù)室進行鏡檢，若內(nèi)有污物，清洗后才能計數(shù)。2、加樣液：先在血球計數(shù)板兩個計數(shù)室部位加蓋玻片，再用無菌玻棒或滴管沾取待測菌懸液稀釋液（已搖勻），從蓋玻片邊緣滴加，使菌液沿縫隙靠毛細作用自行進入計數(shù)室內(nèi)。靜置5min。3、顯微鏡計數(shù)：將血球計數(shù)板置于載物臺上，先用低倍鏡觀察，后換高倍鏡觀察計數(shù)。位于格線上菌體只計上邊線和左邊線上的，如果出芽酵母芽體大小達到母細胞一半時，可計作兩個菌體。選擇五個視野，在每個視野內(nèi)任意選擇五個小方格計數(shù)，求出每個小方格菌體數(shù)量平均值。4、根據(jù)公式計算每ml菌液含菌數(shù)。5、測量完畢后，取下蓋玻片用水沖洗血球計數(shù)板（嚴禁用硬物刷洗），晾干，放入盒內(nèi)保存。第29頁/共57頁第二十九頁，共58頁。(2)混濁度計數(shù)法測定懸浮液中細菌、酵母菌或孢子的數(shù)目，可先測定它的混濁度，然后與標(biāo)準(zhǔn)比較而后決定數(shù)目。麥法蘭云度計可作為混濁度的比較標(biāo)準(zhǔn)。測定混濁度更精確的方法是用光度計。測定無色細菌懸浮液，一般是用波長450nm的光，或者用藍色濾色片；如是有色的肉汁凍培養(yǎng)液，則用波長650nm的光較好，或用橙紅色濾色片。第30頁/共57頁第三十頁，共58頁。(3)平板菌落計數(shù)法

將細菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細菌懸浮液，分別在瓊膠平板上培養(yǎng)，從形成菌落的數(shù)目和稀釋度，可算出每毫升中細菌數(shù)：

第31頁/共57頁第三十一頁，共58頁。細菌懸浮液一般都是按10倍的比例稀釋，稀釋以后，每管中吸lml或0.1ml加到滅菌的培養(yǎng)皿中，然后加溶化并冷卻到50℃左右的瓊膠培養(yǎng)基，充分混合后培養(yǎng)，計算平板上菌落的數(shù)目。還有一種方法是先制成瓊膠平板，取稀釋的懸浮液加在平板上，然后用滅菌的“L”形玻棒將菌液涂勻，培養(yǎng)后計算菌落數(shù)目。涂抹法的好處是細菌都在平板的表面，可以避免培養(yǎng)基中下層細菌的生長條件不同的影響。一般是只將3個稀釋度較高的(如5、6、7三管)培養(yǎng)測定，這要根據(jù)具體情況決定。由于細菌懸浮液是成10倍稀釋的，前一個稀釋度在瓊膠平板上菌落的數(shù)目大致是后一個稀釋度的10倍，如果差別很大，說明實驗有差錯。第32頁/共57頁第三十二頁，共58頁。平板菌落測數(shù)法雖然比較費時，但是不需要特殊的設(shè)備，并且所測定的是活的細菌。平板菌落測數(shù)法測得菌落的數(shù)目，一般都要低于實際數(shù)目。由此可見，平板菌落計數(shù)法測定的是可形成菌落單元(colonyformingunit，CFU)并不是細菌的數(shù)目。當(dāng)然CFU和實際數(shù)之間是成正相關(guān)的。第33頁/共57頁第三十三頁，共58頁。第四節(jié)致病性的測定病株上分離到的細菌，確定它的致病性，是一種細菌病害鑒定的關(guān)鍵。一般來說，致病性的和腐生性的細菌是很難從形態(tài)和其他細菌學(xué)性狀上區(qū)別的。黃單胞菌屬的植物病原細菌是比較容易鑒別的一類。這類細菌大都是致病性的，有很明顯的形態(tài)特征(單根極鞭)，菌落的性狀也比較典型。而其他幾個屬的植物病原細菌，尤其是假單胞菌屬細菌，就沒有這樣明顯的特征可以作為初步鑒別的依據(jù)。因此，一般的工作順序是先確定致病性，完成符合柯赫法則的要求，然后再進行其他細菌學(xué)測定。在致病性沒有確定前就進行一系列的細菌生理生化學(xué)測定，最后可能發(fā)現(xiàn)分離到的并不是真正的病原細菌。因此，寧可多花些時間確定致病性。進度似乎較慢，事實上可能更快一些。第34頁/共57頁第三十四頁，共58頁。1．過敏性反應(yīng)——致病性的初步測定為了確定分離到的大量菌種哪些是致病性的，用常規(guī)接種方法比較費事，有的要經(jīng)過相當(dāng)長的時間。用植物的過敏性反應(yīng)，來快速篩選致病性細菌。方法是將濃度107/ml的細菌的懸浮液注射在煙草葉片的細胞間致病性細菌往往在6-24h內(nèi)就在注射點周圍出現(xiàn)過敏性枯斑，而腐生性細菌則不表現(xiàn)這種反應(yīng)。注射Pseudomonas屬細菌的，一般在6-l0h即出現(xiàn)枯斑，注射

Xanthomonas屬細菌的要10-24h。注射的植物要在光照良好的溫室中培養(yǎng)，溫度在25-35℃間，由于枯斑的出現(xiàn)很快，因此也可用離體葉片接種的方法，溫度和光照便于控制。第35頁/共57頁第三十五頁，共58頁。除去煙草外，其他植物也能用來測定過敏性反應(yīng)，如棉苗的子葉可以測試水稻白葉枯病細菌，酸漿屬植物可用來測定歐文氏菌屬的細菌等。蠶豆葉片也是很好的試驗材料。過敏性反應(yīng)的測定只能作為一種參考性狀，以此可以初步區(qū)別分離到的菌種是否為致病性的，但是它的適用范圍還要經(jīng)過更多的實踐經(jīng)驗。因此，致病性的最后確定，一般還要用常規(guī)的接種方法。第36頁/共57頁第三十六頁，共58頁。2．常規(guī)接種技術(shù)（1）接種物的準(zhǔn)備

繁殖的細菌一般都配成懸浮液接種，有時也可直接用來接種。至于測定菌系致病性的強弱和比較品種抗病性的差異等，則規(guī)定一定的濃度為妥，濃度太低有時接種不易成功。針對不同的病原細菌和實驗的要求，經(jīng)過實踐確定適當(dāng)?shù)臐舛?，一般可用每毫升?億個細菌(3×l08CFU/m1)的菌液。接種用的細菌要注意菌齡，菌齡老則細菌致病力顯著減退，接種后甚至不發(fā)病。第37頁/共57頁第三十七頁，共58頁。(2)各種類型細菌病害的常用接種方法[1]葉斑病和葉枯病的接種葉斑和葉枯是最常見的細菌病害，接種的方法很多，但不外乎使細菌從傷口或氣孔等自然孔口侵入葉片。由于植物病原細菌不能從表皮直接侵入，也不像真菌那樣以孢子萌發(fā)形成的芽管從氣孔侵入，因此要求在接種的時候就有較多的細菌進入氣孔內(nèi)。針刺接種噴霧接種高壓噴霧接種摩擦接種接種方法第38頁/共57頁第三十八頁，共58頁。1)針刺接種

針刺接種是很有效的接種方法，為了測定分離到的細菌的致病性，一般都先試用這種方法。比較簡單的辦法是：用接種針從瓊膠斜面上挑取少許細菌直接穿刺葉片接種。為了提高接種效率，可以將許多針固定在橡皮塞或軟木塞上，蘸取細菌懸浮液接種，一般稱為多針接種法。針刺接種后的植物，不一定要求保濕，但有時保濕的效果要好一些。第39頁/共57頁第三十九頁，共58頁。2)噴霧接種

將細菌懸浮液噴布葉面是常用的接種方法，在葉背更好。懸浮液的濃度一般是106～107CFU/ml，有時濃度高一些更好。植物在接種后要保濕24-48h左右，如接種前也保濕24h，使氣孔張開，則效果更好。大田噴霧接種，保濕是很困難的，因此多半是在傍晚進行。由于噴霧接種的細菌只有很少一部分能夠從氣孔進入葉片內(nèi)，接種的效率較低；為了提高接種的效率，噴霧時可以在細菌懸浮液中加適當(dāng)?shù)恼共紕?，如吐?0或各種洗滌劑等。吐溫的用量在0.1％～1.0％左右。第40頁/共57頁第四十頁，共58頁。3)高壓噴霧接種

細菌懸浮液用高壓噴霧方法接種，會有較大量的細菌進入組織內(nèi)。噴過的葉組織，充水而呈水漬狀，有利于細菌的蔓延，接種的效率高，并且發(fā)病一般也較重。許多細菌病害在暴風(fēng)雨后迅速蔓延，可以說是天然的高壓噴霧接種造成的。接種細菌懸浮液的濃度，一般不宜超過5×106CFU/ml；溫室接種的植物，接種后一般保濕24-48h，有時不保濕也能發(fā)病。高壓噴霧也適用于大田接種，在每4000ml左右稀釋的細菌懸浮液中，還可加容量15ml的金剛砂(600目)，加壓206841～413682Pa在傍晚接種。接種后不保濕，方法與汁液傳染的植物病毒病的大田接種相似。第41頁/共57頁第四十一頁，共58頁。4)摩擦接種少量植物接種，可以在葉片上撒少量金剛砂(600目)，然后用紗布蘸取細菌懸浮液(濃度約107CFU/m1)在表面輕輕摩擦接種。葉斑和葉枯類型的細菌病害，還可以用將細菌懸浮液注射到葉片組織或灌注在心葉中(如玉米的喇叭口)的方法接種。有些在維管束組織中蔓延很快的葉枯病(如水稻白葉枯病和玉米細菌性葉枯病),可以用在細菌懸浮液中浸過的剪刀剪葉的方法接種第42頁/共57頁第四十二頁，共58頁。[2]腫瘤和莖稈枝條病害的接種

腫瘤和莖桿枝條病害的接種，一般都是用針刺或注射的方法接種[3]腐爛病的接種

腐爛病一般都是用針刺或注射的方法接種。塊根和塊莖還可以剖開或切成薄片，在切面上滴細菌懸浮液接種。植物病原細菌很少引起根腐(塊根除外)，但莖腐還是常見的。[4]蔫萎病的接種蔫萎病的接種可以采用針刺、注射、蘸或灌注土壤等方法接種，使細菌侵入到寄主維管束組織中。第43頁/共57頁第四十三頁，共58頁。第五節(jié)細菌的形態(tài)革蘭氏染色法

革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。它的機制還不完全了解一種解釋是堿性染料可以穿過細胞壁與細胞原生質(zhì)的酸性成分起作用，加碘以后形成復(fù)合體。革蘭氏反應(yīng)陽性的細菌，它的細胞壁阻止褪色劑對復(fù)合體中染料的提取，所以不褪色。革蘭氏反應(yīng)陰性的細菌，可能由于細胞壁中含有較多的類脂物，可以被褪色劑溶解，因而染料可被提取而褪色。還有一種解釋認為碘液是起染媒劑的作用，與結(jié)晶紫以及細胞中核糖核和鎂離子形成復(fù)合體，這種復(fù)合體不容易被褪色。革蘭氏染色反應(yīng)陰性的細菌不形成這的復(fù)合體，結(jié)晶紫就容易褪色除去。方法及其他注意事項(略)第44頁/共57頁第四十四頁，共58頁。結(jié)果:

陽性菌——紫色

陰性菌——紅色結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染涂片固定由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。第45頁/共57頁第四十五頁，共58頁。Figure1-Gram+Figure2-Gram-第46頁/共57頁第四十六頁，共58頁。鞭毛染色

植物病原細菌的染色，除去革蘭氏染色外，最重要的是鞭毛染色。鞭毛的有無、數(shù)目和著生部位是重要的分類和鑒定性狀。一種植物病原細菌，經(jīng)過革蘭氏染色和鞭毛染色，大致已經(jīng)可以確定它的屬。細菌的鞭毛很細(只有0.02～0.03μm)，一般光學(xué)顯微鏡看不清，鞭毛上沉積了染劑后才能看到，這是所有鞭毛染色法的根據(jù)。由于染劑也可以在載玻片上沉積，所以要用非常清潔的載玻片。染劑處理的時間很重要，處理時間太短，鞭毛上沒有足夠的沉積物就看不清楚；處理時間太長，載玻片上的沉積物太多則影響檢查。第47頁/共57頁第四十七頁，共58頁。(1)載玻片的準(zhǔn)備鞭毛染色要用新的或沒有損傷的載玻片，先在濃鉻酸洗滌液中浸24h，清水洗過后用蒸餾水洗，再在95%的酒精中浸過后，將玻片通過火焰幾次，到載玻片邊緣的火焰呈桔黃色為止。通過火焰的載玻片，放在多層吸水紙上任其冷卻。洗凈的載玻片也可以浸在盛有95%5酒精的扁平染色皿中，使用前再通過火焰燒去酒精，檢驗是否潔凈的標(biāo)準(zhǔn)是在載玻片上加1滴蒸餾水，如果水滴很快而且均勻地擴散開來，表示載玻片是清潔適用的。第48頁/共57頁第四十八頁，共58頁。(2)細菌懸浮液的配制

配制細菌懸浮液時要注意菌齡，最好是用在斜面上培養(yǎng)18～24h的，但生長較慢的(如黃單胞桿菌屬)細菌，可用適當(dāng)延長到36-48h的。染色前，菌種每隔一二天移植一次，必要時可連續(xù)進行幾次，以增強細菌的活性。配制的時候，在培養(yǎng)斜面上加滅菌水3-5ml(可根據(jù)濃度增減)靜置(可以稍加搖動，但不要振動)一定時間，細菌就散開而形成懸浮液。放置的時間一般是5-30min，產(chǎn)生膠質(zhì)的細菌則需要30min或更久一些。放置時間太長，細菌的鞭毛可能會脫落。染色前，可先用懸滴法觀察細菌是否運動。第49頁/共57頁第四十九頁，共58頁。(3)涂片涂片的方法是用微吸管或移植環(huán)取懸浮液1滴或2～3滴加在潔凈的載玻片上；立即將玻片直立，使菌液流下，玻片上即遺留一條或兩三條細菌懸浮液膜。最好是從懸浮液中活動的細菌較多的上層取樣。載玻片保持直立使菌液干燥，鞭毛染色的玻片都不通過火焰固定直接染色。(4)染色