熒光定量課程學(xué)習(xí)

內(nèi)容miRNA的特點(diǎn)及檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)第1頁(yè)/共50頁(yè)第一頁(yè)，共51頁(yè)。microRNA第2頁(yè)/共50頁(yè)第二頁(yè)，共51頁(yè)。長(zhǎng)度20～24nt單鏈小分子RNA與目標(biāo)基因3’端非編碼區(qū)的識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合導(dǎo)致目標(biāo)基因mRNA分子穩(wěn)定性下降，半衰期變短，或mRNA分子結(jié)構(gòu)變化（5‘脫帽），從而表達(dá)水平下降。3’AAAAAAAA5’capmiRNA作用靶點(diǎn)編碼區(qū)mRNAmicroRNA分子功能第3頁(yè)/共50頁(yè)第三頁(yè)，共51頁(yè)。microRNA的來(lái)源第4頁(yè)/共50頁(yè)第四頁(yè)，共51頁(yè)。miRNA前體與成熟體第5頁(yè)/共50頁(yè)第五頁(yè)，共51頁(yè)。靶點(diǎn)識(shí)別–不嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)一個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)基因一個(gè)基因可受多個(gè)miRNA調(diào)控60%人類(lèi)蛋白基因受miRNA調(diào)控第6頁(yè)/共50頁(yè)第六頁(yè)，共51頁(yè)。miRNA與siRNA的異同分子形式無(wú)區(qū)別，都是由Dicer產(chǎn)生的~22nt小分子分子功能近似，都導(dǎo)致目標(biāo)基因表達(dá)水平下降，但通常siRNA效果更劇烈產(chǎn)生來(lái)源不同miRNA有其基因，內(nèi)源性表達(dá)siRNA多數(shù)情況下為人工外源導(dǎo)入第7頁(yè)/共50頁(yè)第七頁(yè)，共51頁(yè)。miRNAsiRNAmiRNA與siRNA的異同第8頁(yè)/共50頁(yè)第八頁(yè)，共51頁(yè)。miRNA檢測(cè)與定量經(jīng)典方法:放射標(biāo)記Northern雜交第9頁(yè)/共50頁(yè)第九頁(yè)，共51頁(yè)。miRNA芯片–基因表達(dá)譜

基本原理：某物種全部已知miRNA集中于一張芯片，點(diǎn)雜交檢測(cè)各miRNA豐度所回答的問(wèn)題：哪些miRNA是你所應(yīng)該關(guān)注的優(yōu)點(diǎn)：高通量，全景觀察缺點(diǎn)：敏感度、特異性均有限，適用于初篩需后續(xù)驗(yàn)證：熒光定量PCR第10頁(yè)/共50頁(yè)第十頁(yè)，共51頁(yè)。第11頁(yè)/共50頁(yè)第十一頁(yè)，共51頁(yè)。Pre-miRNA檢測(cè)必要性：不排除miRNA從前體到成熟體，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到核外的過(guò)程中存在調(diào)控機(jī)制的可能。第12頁(yè)/共50頁(yè)第十二頁(yè)，共51頁(yè)。SpecificmiRNAquantificationby

realtimePCR–waytogo關(guān)鍵難點(diǎn)豐度低解決辦法:小RNA提取太短解決辦法:加長(zhǎng)序列高度相似miRNA之間難以區(qū)分解決辦法:特殊設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法；小心設(shè)計(jì)引物與反應(yīng)優(yōu)化第13頁(yè)/共50頁(yè)第十三頁(yè)，共51頁(yè)。解決miRNA豐度難題

基本原理影響RNA分子與硅膠柱結(jié)合的因素離液劑chaotropicagent，如鹽酸胍離子強(qiáng)度，如NaCl

小分子有機(jī)溶劑，如乙醇精心調(diào)整各組份配比，達(dá)成大、小RNA與硅膠柱結(jié)合的區(qū)分條件，分離去除大分子量RNA，富集小分子量RNA小RNA提取

第14頁(yè)/共50頁(yè)第十四頁(yè)，共51頁(yè)。M123M：Marker#1：康為柱式分離的小片段RNA#2：康為柱式分離的總RNA#3：沉淀法得到的總RNA提取小分子量RNA第15頁(yè)/共50頁(yè)第十五頁(yè)，共51頁(yè)。成熟miRNAqPCR檢測(cè)

-Poly(A)加尾法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接，高效。一次逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA可用于多個(gè)目標(biāo)分子的檢測(cè)。第16頁(yè)/共50頁(yè)第十六頁(yè)，共51頁(yè)。成熟miRNAqPCR檢測(cè)–莖環(huán)法優(yōu)點(diǎn)：特異引物逆轉(zhuǎn)錄，理論上效率更高，檢測(cè)更靈敏缺點(diǎn)：莖環(huán)引物設(shè)計(jì)復(fù)雜；特異引物逆轉(zhuǎn)錄不便多基因檢測(cè)第17頁(yè)/共50頁(yè)第十七頁(yè)，共51頁(yè)。檢測(cè)方法選擇依樣本特性，檢測(cè)目標(biāo)多寡而定康為技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)舉例：復(fù)旦大學(xué)某客戶miRNA芯片提示10個(gè)miRNA在病人與正常人之間有顯著差異表達(dá)要求從66個(gè)外周血RNA樣本中檢測(cè)這10個(gè)miRNA加尾法，5個(gè)目標(biāo)獲得良好檢測(cè)莖環(huán)法，4個(gè)目標(biāo)獲得良好檢測(cè)1個(gè)目標(biāo)的檢測(cè)很難，嘗試多種引物設(shè)計(jì)，調(diào)整反應(yīng)體系第18頁(yè)/共50頁(yè)第十八頁(yè)，共51頁(yè)。康為miRNA產(chǎn)品小RNA提取試劑盒加尾法miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒

CW0627

CW2141

CW2142第19頁(yè)/共50頁(yè)第十九頁(yè)，共51頁(yè)?？禐閙iRNA檢測(cè)服務(wù)

全套miRNA檢測(cè)：從生物樣本到數(shù)據(jù)莖環(huán)法miRNA檢測(cè)引物：定制第20頁(yè)/共50頁(yè)第二十頁(yè)，共51頁(yè)。(RealtimeQuantitativePCR)miRNA的特點(diǎn)及檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)容

第21頁(yè)/共50頁(yè)第二十一頁(yè)，共51頁(yè)。PCR：

偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrology第22頁(yè)/共50頁(yè)第二十二頁(yè)，共51頁(yè)。PCR：理想與現(xiàn)實(shí)起點(diǎn)定量終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量檢測(cè)：

--起點(diǎn)量是樣本中未經(jīng)PCR放大之前的模板量--具有重現(xiàn)性，誤差小--“加入了500個(gè)拷貝”終點(diǎn)定量檢測(cè)：-終點(diǎn)產(chǎn)物量經(jīng)過(guò)PCR放大的DNA量--不恒定，誤差大--“生成了500，0000，0000個(gè)拷貝”第23頁(yè)/共50頁(yè)第二十三頁(yè)，共51頁(yè)。擴(kuò)增曲線--Ct值：模板DNA量越多，熒光強(qiáng)度達(dá)到檢測(cè)域值所需的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。確定模板初始數(shù)量？

第24頁(yè)/共50頁(yè)第二十四頁(yè)，共51頁(yè)。Real-timePCR:

檢測(cè)原理非特異性熒光標(biāo)記：

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

RQReporterQuencherRQ第25頁(yè)/共50頁(yè)第二十五頁(yè)，共51頁(yè)。5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。SYBRGreenI工作原理第26頁(yè)/共50頁(yè)第二十六頁(yè)，共51頁(yè)。

Taqman工作原理

在退火過(guò)程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’

外切酶活性剪切成片斷游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光在延伸過(guò)程中，探針部分與靶序列分離熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。第27頁(yè)/共50頁(yè)第二十七頁(yè)，共51頁(yè)。

染料法與探針?lè)▽?duì)比探針?lè)ㄌ禺愋愿?-與探針與特異靶序列結(jié)合對(duì)模板有選擇性--可進(jìn)行多重PCR反應(yīng)成本高--不同靶基因需要合成不同探針

染料法通用性好--對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性使用方便，成本低--僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物有假陽(yáng)性現(xiàn)象--通過(guò)融解曲線判斷第28頁(yè)/共50頁(yè)第二十八頁(yè)，共51頁(yè)。Real-timePCR

應(yīng)用基因表達(dá)分析--相對(duì)定量：基因表達(dá)量的差異--絕對(duì)定量：樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）基因型分析--SNP檢測(cè)等位基因檢測(cè)甲基化檢測(cè)第29頁(yè)/共50頁(yè)第二十九頁(yè)，共51頁(yè)。

基因表達(dá)分析檢測(cè)

testsample處理樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因totalRNAcDNAcalibratorsample對(duì)照樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因qPCR以各自樣本中內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)桿，比較兩樣本中目的基因的相對(duì)豐度。數(shù)據(jù)分析qPCRcDNAtotalRNA第30頁(yè)/共50頁(yè)第三十頁(yè)，共51頁(yè)。

內(nèi)參基因的選擇

特點(diǎn)選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA等--文獻(xiàn)檢索--實(shí)驗(yàn)篩選選擇多個(gè)備選內(nèi)參基因，以備選內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為均一化標(biāo)準(zhǔn)

內(nèi)參基因HousekeepingGene--RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同，用于定量分析的樣本初始濃度不同。對(duì)樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。不同環(huán)境，不同器官、組織、細(xì)胞類(lèi)型之間，表達(dá)量相對(duì)恒定。第31頁(yè)/共50頁(yè)第三十一頁(yè)，共51頁(yè)。HousekeepingGene

康為產(chǎn)品不同豐度：高豐度

ACTB、GAPDH中等豐度

beta2M低豐度

HPRT1不同物種：人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚(yú)、甘蔗等第32頁(yè)/共50頁(yè)第三十二頁(yè)，共51頁(yè)。基因表達(dá)分析檢測(cè)樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCR內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇第33頁(yè)/共50頁(yè)第三十三頁(yè)，共51頁(yè)。樣本處理與RNA提取外界刺激

–

10分鐘

–

可檢測(cè)的表達(dá)改變樣品離開(kāi)定義環(huán)境–

2分鐘內(nèi)

–固定、裂解細(xì)胞RNA樣本保存液Trizol超純RNA提取試劑盒RNA的評(píng)價(jià)與鑒定

-完整性

-純度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物設(shè)計(jì)

-以RNA作PCR陰性對(duì)照

CW0580

CW0592

CW0581

CW2090A第34頁(yè)/共50頁(yè)第三十四頁(yè)，共51頁(yè)。

RT-qPCR一步法還是兩步法？?jī)刹椒ǎ翰襟E多但靈活多樣。cDNA可長(zhǎng)期保留，檢測(cè)多個(gè)基因，便于反應(yīng)條件的優(yōu)化。

推薦：工作的初期階段，以及單個(gè)樣本多個(gè)靶基因檢測(cè)。一步法：簡(jiǎn)單、靈敏度高，有效減少實(shí)驗(yàn)操作誤差和污染。每次只能做一個(gè)基因。

推薦：工作的成熟階段，以及多個(gè)樣本單個(gè)靶基因檢測(cè)。第35頁(yè)/共50頁(yè)第三十五頁(yè)，共51頁(yè)。

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測(cè)其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測(cè)靈敏度是否足夠？逆轉(zhuǎn)錄酶SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）引物特異性反應(yīng)效率OligodT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高

CW0741

CW0743第36頁(yè)/共50頁(yè)第三十六頁(yè)，共51頁(yè)?？傇瓌t與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（80–300bp)推薦做跨intron設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則EXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA第37頁(yè)/共50頁(yè)第三十七頁(yè)，共51頁(yè)。反應(yīng)條件優(yōu)化內(nèi)參基因–

目的基因

--融解曲線：?jiǎn)我惶禺愋援a(chǎn)物--擴(kuò)增曲線：Ct值--標(biāo)準(zhǔn)曲線：擴(kuò)增效率盡量高，目的基因盡可能接近內(nèi)參基因第38頁(yè)/共50頁(yè)第三十八頁(yè)，共51頁(yè)。反應(yīng)條件優(yōu)化融解曲線分析--單一特異性產(chǎn)物

將溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)第39頁(yè)/共50頁(yè)第三十九頁(yè)，共51頁(yè)。

圖2Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer278%-4.00

圖1Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer195.36%-3.43標(biāo)準(zhǔn)曲線分析--擴(kuò)增效率盡量高--目的基因盡可能接近內(nèi)參基因

10%以內(nèi)反應(yīng)條件優(yōu)化第40頁(yè)/共50頁(yè)第四十頁(yè)，共51頁(yè)。反應(yīng)條件優(yōu)化擴(kuò)增曲線分析--Ct值第41頁(yè)/共50頁(yè)第四十一頁(yè)，共51頁(yè)。MasterMix的應(yīng)用--熱啟動(dòng)酶化學(xué)修飾，常溫下完全沒(méi)有聚合酶活性，熱復(fù)活需95℃10分鐘

--GoldStar、HotStar非化學(xué)修飾（Oligo修飾、抗體修飾、Mg2+螯合物）熱復(fù)活僅需95℃幾十秒--FastStar--Buffer反應(yīng)增強(qiáng)劑

--減少引物二聚體，進(jìn)一步提高反應(yīng)特異性

--對(duì)于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率穩(wěn)定劑--dNTP第42頁(yè)/共50頁(yè)第四十二頁(yè)，共51頁(yè)。MasterMix的應(yīng)用ROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應(yīng)恒定發(fā)射熒光信號(hào)用于校正因信號(hào)檢測(cè)器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。需參照儀器要求選擇。第43頁(yè)/共50頁(yè)第四十三頁(yè)，共51頁(yè)。

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體）技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陰性對(duì)照

熒光定量PCR體系第44頁(yè)/共50頁(yè)第四十四頁(yè)，共51頁(yè)。2-ΔΔCt法滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近-正負(fù)10%2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率基本為90%-110%

相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析1、目標(biāo)基因的CT值-內(nèi)參基因的CT值2、待測(cè)樣本的ΔCT值-對(duì)照樣本的ΔCT值3、計(jì)算表達(dá)水平比率：2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值2-△△Ct

法

目的基因內(nèi)參基因目的基因-內(nèi)參基因△Ct待測(cè)樣本-對(duì)照樣本△△Ct倍數(shù)值fold2-△△Ct

對(duì)照樣本30.48523.6256.8601待測(cè)樣本27.02522.664.365-2.4955.63728第45頁(yè)/共50頁(yè)第四十五頁(yè)，共51頁(yè)。Troubleshooting

常見(jiàn)問(wèn)題

可能原因

解決方法Housekeepinggene無(wú)信號(hào)RNA降解用新鮮組織提取RNAHousekeepinggene有信號(hào)而目標(biāo)基因無(wú)信號(hào)1.目的基因表達(dá)低。逆轉(zhuǎn)錄效率不高2.PCR引物不良1.富集mRNA2.在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。3.嘗試不同PCR引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，考慮不同剪接體。4.嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。Housekeepinggene反應(yīng)效率正常,但目標(biāo)基因放大效率不高PCR引物不良重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，考慮不同剪接體目標(biāo)基因表達(dá)豐度在樣本之間異常一致RNA被基因組DNA污染使用跨intron引物用DNase處理RNA確保RNA陰性對(duì)照表現(xiàn)陰性溶解曲線出現(xiàn)雜峰出現(xiàn)非特異PCR產(chǎn)物出現(xiàn)引物二聚體嘗試不同PCR引物嘗試不同熱循程序，升高復(fù)性溫度修改儀器設(shè)置，將檢測(cè)溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈溫度與PCR特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。陰性對(duì)照在30個(gè)循環(huán)以內(nèi)出現(xiàn)信號(hào)試劑被污染注意區(qū)分信號(hào)是來(lái)自引物二聚體還是PCR產(chǎn)物查找，替換污染試劑2.使用UNG系統(tǒng)。第46頁(yè)/共50頁(yè)第四十六頁(yè)，共51頁(yè)。

熒光定量產(chǎn)品--染料法FastSYBRMixtureUltraSYBRMixtureGoldStarTaq特異性強(qiáng)靈敏度高Ct值更低線性范圍更廣定量更準(zhǔn)確反應(yīng)速度快比普通反應(yīng)可節(jié)省約40分鐘適合于普通和快