人胰島素基因的人工合成及轉(zhuǎn)化銀耳的研究

本文格式為Word版，下載可任意編輯——人胰島素基因的人工合成及轉(zhuǎn)化銀耳的研究用PCR法合成人胰島素基因，克隆到pUC18載體上，經(jīng)測(cè)序表明其堿基序列與人胰島素基因的序列完全一致。本測(cè)驗(yàn)還構(gòu)建了銀耳表達(dá)載體，由限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)（Restrictionenzyme-mediatedDNAIntegration,REMI）轉(zhuǎn)化銀耳芽孢。隨機(jī)挑取21個(gè)抗性菌落，轉(zhuǎn)管繁殖2代后檢測(cè)其GUS活性，測(cè)驗(yàn)結(jié)果：18個(gè)菌株陽(yáng)性，3個(gè)菌株陰性。從這21個(gè)菌株中選取10個(gè)菌株，提取染色體DNA，用人胰島素基因、GUS基因和Tnos序列的特異引物舉行PCR，結(jié)果說明，這10菌株都能擴(kuò)增出相應(yīng)長(zhǎng)度的特異片段，證領(lǐng)略它們是人胰島素基因轉(zhuǎn)化子。

人胰島素；基因合成；基因轉(zhuǎn)化；銀耳；芽孢

S567.34;TQ460.72A

糖尿病是人類的主要慢性疾病之一，胰島素是針對(duì)糖尿病的特效藥，開展人胰島素基因工程研究具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。銀耳是出名的食藥用菌，其子實(shí)體和芽孢均可食用，具有二型性（芽孢與菌絲）生活史，芽孢的生長(zhǎng)特性與酵母菌好像，可作為外源基因轉(zhuǎn)化研究材料。我們?cè)O(shè)想將銀耳作為生物回響器，舉行人胰島素生產(chǎn)。為此開展了人胰島素基因的人工合成，構(gòu)建了表達(dá)載體，并舉行了轉(zhuǎn)化銀耳的研究，獲得初步結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要材料

銀耳(Tremellafuciformis)芽孢菌株Tr21、質(zhì)粒pUC18、pBI121和E.coliJM109由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心測(cè)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pCAMBIA1301由華南農(nóng)大郭麗瓊女士惠贈(zèng)。

Taq酶、限制性內(nèi)切酶、DNALigationKitVer.2、PCRFragmentRecoveryKit等均購(gòu)自TaKaRa公司（大連）。單鏈寡核苷酸及引物也由TaKaRa公司（大連）合成。X-gluc為上海生工產(chǎn)品。

完全培養(yǎng)基(CM)：麥芽糖10g，葡萄糖10g，蛋白胨4g，磷酸二氫鉀0.46g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂1g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然。

再生培養(yǎng)基(RM)：含0.6mol/L氯化鉀的完全培養(yǎng)基。

選擇培養(yǎng)基(SM)：含50μg/mL潮霉素的再生培養(yǎng)基。

LB選擇性培養(yǎng)基（LBS）：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.0。滅菌后參與抗生素（LBS1為氨芐青霉素，LBS2為卡那霉素）溶液至終濃度為20μg/mL。

藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基（LBS2-gal）：在LBS2培養(yǎng)基平板上，參與40μL20mg/mLX-gal和4μL200mg/mLIPTG，涂布平勻，涼干。

1.2基因的合成

根據(jù)人胰島素基因的序列，分別合成長(zhǎng)度為69、66、66、71個(gè)堿基的4個(gè)寡核苷酸鏈，編號(hào)依次為IF1、IF2、IF3、IF4（圖1）。以IF1和IF2、IF3和IF4互為模板和引物分別舉行第一次PCR回響，補(bǔ)平各片段。第一次PCR回響的體系為25μL,寡核苷酸鏈濃度為10pmol，dNTP為250μmol，Taq酶3U(選用BBI生產(chǎn)的PfuDNAPolymerase，該酶的PCR產(chǎn)物3’無突出的dA)?；仨憲l件為：94℃變性1min，42℃退火10min，72℃延遲1min，5個(gè)循環(huán)。把第一次PCR回響產(chǎn)物混合，立刻舉行其次次PCR回響，以IF1-2和IF3-4互為模板和引物舉行PCR補(bǔ)平未端。其次次PCR回響條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性1min，50℃退火5min，72℃延遲1min，10個(gè)循環(huán)。取其次次PCR產(chǎn)物1μL作為模板，參與兩端引物（BF和AR）各50pmol，dNTP200μmol,Taq酶3U，加H2O至50μL舉行第三次PCR。BF堿基序列為：5’-CGGGATCCATGTTCGTTAACC-3’，AR的堿基序列為：5’-TAGCGAGCTCTTAGTTGCAGTAG-3’。第三次PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min，94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延遲90s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，結(jié)果72℃補(bǔ)平10min。第三次PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇(參與等體積無水乙醇)沉淀后溶解于10μLTE中,獲得合成人胰島素基因。

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1.3基因克隆

按文獻(xiàn)［1］的方法提取pUC18質(zhì)粒DNA。

合成人胰島素基因(即第三次PCR產(chǎn)物)、pUC18質(zhì)粒DNA分別用BamHI和SacI雙酶切。酶切回響如下：取2μgDNA于PCR管中，參與10×KBuffer5μL、BamHI4U、加無菌雙蒸水至50μL,30℃水浴1h。經(jīng)乙醇沉淀后，參與10×LBuffer5μL、SacI4U、加無菌雙蒸水至50μL,37℃水浴1h。酶切產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后溶解于10μL的TE中。

在PCR管中參與合成的人胰島素DNA200ng、pUC18（BamHI/SacI酶切后）50ng、ddH2O2μL，按DNALigationKitVer.2說明書舉行連接。連接液全量轉(zhuǎn)化至E.coliJM109。

LBS1平板上的抗性菌落提取質(zhì)粒后，用pUC18的BamHI/SacI兩側(cè)的特異引物（F:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，R:5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG）舉行PCR，檢測(cè)是否含有插入片段。重組質(zhì)粒定名為pUC-BCA8。PCR回響的組成（終濃度）如下：質(zhì)粒DNA2ng/μL，dNTP200μmol/L，引物F0.4μmol/L，引物R0.4μmol/L，1×buffer，TaqPolymerase0.025U/μL。加雙蒸餾水至50μL。

PCR條件:94℃預(yù)變性1min,94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延遲1min,35個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)平5min。

1.4表達(dá)載體構(gòu)建

銀耳表達(dá)載體構(gòu)建的技術(shù)路線如圖2所示。按文獻(xiàn)［1］的方法提取質(zhì)粒pBI121和pCAMBAI1301，分別用HindⅢ和EcoRI酶切。酶切回響如下：在PCR管中參與質(zhì)粒DNA10μg、10×KBuffer5μL、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHI各10U，加雙蒸水補(bǔ)至50μL，37℃回響4h。取酶切產(chǎn)物10μL舉行瓊脂糖(1%)電泳，用PCRFragmentRecoveryKit切膠分別回收pBI121的約3Kb的DNA片段（InsertDNA）和pCAMBAI1301的大片斷（HostDNA）。在PCR管中參與InsertDNA150ng、HostDNA50ng、ddH2O2μL，按DNALigationKitVer.2說明書舉行連接。連接液按文獻(xiàn)［1］的方法全量轉(zhuǎn)化E.coliJM109，涂布LBS2-gal平板過夜培養(yǎng)菌體,挑揀白色菌落，提取質(zhì)粒后用上述方法舉行EcoRI/HindIII雙酶切，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)插入片斷大小。重組質(zhì)粒定名為pCB。

按文獻(xiàn)［1］的方法分別提取pUC-BCA8和pCB質(zhì)粒DNA。分別取pUC-BCA8和pCB質(zhì)粒DNA10μg，按“1.4”的步驟舉行BamHI和SacⅠ雙酶切。取10μL酶切液舉行瓊脂糖電泳，用PCRFragmentRecoveryKit切膠回收雙酶切后pUC-BCA8質(zhì)粒的小片段DNA（BCA）和pCB的大片段DNA（HostDNA）。用DNALigationKit將BCA和HostDNA連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109，涂布LBS2平板過夜培養(yǎng)菌體。從轉(zhuǎn)化的平板上挑揀單菌落，提取質(zhì)粒后用BamHI/SacI雙酶切驗(yàn)證。

1.5轉(zhuǎn)化方法

按文獻(xiàn)［2］的方法制備銀耳芽孢的原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體用TPB（0.6MKCl，25mMCaCl2）懸浮(109/mL)，分裝成0.1mL,參與質(zhì)粒pCB-BCA28DNA1μL（30μg/μL），混勻，參與內(nèi)切酶到終濃度0.5U/μL，混勻，冰浴5min。參與20μLPEG4000/S（40%PEG4000，0.6MKCl，25mMCaCl2），混勻，冰浴5min。再參與1mLPEG4000/S，混勻，于25℃水浴處理1h，水浴后40℃熱激20min，4000r/min（1067×g）離心10min原生質(zhì)體，加再生培養(yǎng)基1mL,并涂RM和SM平板，每皿涂布0.1mL。25℃恒溫培養(yǎng)10d后挑取抗性菌落。

本測(cè)驗(yàn)設(shè)5個(gè)限制性內(nèi)切酶處理，即分別用HindⅢ、EcoRI、BamHI、BstEII、BstXI舉行REMI轉(zhuǎn)化。

1.6轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)與鑒定

1.6.1銀耳芽孢染色體DNA提取

按文獻(xiàn)［3］的方法提取銀耳芽孢染色體DNA。

1.6.2轉(zhuǎn)化子的GUS檢測(cè)

按文獻(xiàn)［4］的方法，略有修改。

在滅菌過的0.2mLPCR管中參與0.1mL滅菌的磷酸緩沖液（pH7.0），在超凈工作臺(tái)用接種環(huán)挑取銀耳芽孢轉(zhuǎn)化子洗入離心管中，4000r/min（889×g）離心10min，棄上清液，再用滅菌的磷酸緩沖液洗滌2次，棄上清液，參與0.5mg/mL的X-gluc溶液0.1mL，置于25℃回響5d，查看顏色變化，并拍照。

1.6.3轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

使用引物BF和AR對(duì)轉(zhuǎn)化子的BCA基因舉行PCR擴(kuò)增。

PCR組分(終濃度)：模板DNA25ng/μL，dNTP100μmol/L，BF0.2μmol/L，AR0.2μmol/L，1×buffer，TaqPolymerase0.05U/μL。加雙蒸餾水至50μL。

PCR條件：94℃預(yù)變性10min，94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延遲90s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，結(jié)果72℃延遲10min。

使用引物F（5’-TATGAACTGTGCGTCACAGC-3’）和引物B（5’-AGCATCTCTTCAGCGTAAGG-3’）對(duì)轉(zhuǎn)化子的GUS基因舉行PCR擴(kuò)增。

PCR組分(終濃度)：模板DNA50ng/μL，dNTP100μmol/L，引物F0.2μmol/L，引物B0.2μmol/L，1×buffer，TaqPolymerase0.05U/μL。加雙蒸餾水至50μL。

PCR條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延遲90s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，結(jié)果72℃延遲10min。

使用引物TnosF（5’-GATCGTTCAAACATTTGGCA-3’）和TnosR（5’-CCCGATCTAGTAACATAGAT-3’）對(duì)轉(zhuǎn)化子的Tnos終止子舉行PCR擴(kuò)增。

PCR組分(終濃度)：模板DNA25ng/μL，dNTP100μmol/L，TnosF0.2μmol/L，TnosR0.2μmol/L，1×Buffer，TaqPolymerase0.05U/μL。加雙蒸餾水至50μL。

PCR條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延遲90s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，結(jié)果72℃延遲10min。

1.7人胰島素基因的測(cè)序

本研究獲得的帶有人胰島素基因的質(zhì)粒pUC-BCA8和pCB-BCA28囑托寶生物公司舉行測(cè)序驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1人胰島素基因的合成與克隆

采用寡核苷酸鏈合成與PCR技術(shù)結(jié)合的方案，先合成IF1、IF2、IF3和IF4寡核苷酸鏈，引物之間互為模板與引物舉行三次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)過BamHI/SacI酶切后插入pUC18，在含氨芐青霉素平板上隨機(jī)挑揀4個(gè)單菌落，提取質(zhì)粒，以pUC18的BamHI/SacI兩端的引物（引物F和引物R）舉行PCR驗(yàn)證。取一個(gè)經(jīng)PCR驗(yàn)證后的陽(yáng)性克?。╬UC-BCA8）囑托TaKaRa公司以引物F和引物R舉行序列測(cè)定，結(jié)果說明，其堿基序列與人胰島素基因的序列完全一致。

2.2人胰島素基因的銀耳表達(dá)載體構(gòu)建

在植物的轉(zhuǎn)化研究中，潮霉素（hptII）和卡那霉素(Kam)的抗性基因常作為篩選標(biāo)記，GUS酶基因那么作為報(bào)告基因。本測(cè)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)定并證領(lǐng)略銀耳對(duì)潮霉素敏感、對(duì)卡那霉素有較強(qiáng)的抗性，銀耳沒有GUS酶活性。質(zhì)粒pBI121和pCAMBIA1301是植物常用的轉(zhuǎn)化載體，也有用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的報(bào)道(Bhairi&Staples,1992,Chenetal，2000)[5,6]。本測(cè)驗(yàn)把pBI121用HindⅢ和EcoRI雙酶切，回收帶有35S啟動(dòng)子、Tnos終止子及GUS基因的片段，置換插入pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pCB（圖2）。PCB帶有pBI121片段，該片段中的GUS基因兩側(cè)有多個(gè)單酶切位點(diǎn)，可用于外源基因的置換。重組質(zhì)粒pCB的HindⅢ/EcoRI雙酶切驗(yàn)證如圖3所示。測(cè)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，即可從pCB切出3kb左右的片段。

用BamHI/SacI雙酶切處理pUC-BCA8和pCB，把pUC-BCA8小片段與pCB大片段連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，從轉(zhuǎn)化的平板上挑揀單菌落，提取質(zhì)粒后，用BamHI/SacI雙酶切處理，電泳結(jié)果如圖4所示，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。獲得的重組質(zhì)粒定名為pCB-BCA28（圖5）。取一個(gè)pCB-BCA28克隆囑托TaKaRa公司舉行序列測(cè)定，結(jié)果說明，BCA片段的堿基序列與pUC-BCA8的序列完全一致。

2.3人胰島素基因轉(zhuǎn)化銀耳

限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（Restrictionenzyme-mediatedDNAIntegration,REMI）是Schiestl于1991年[7]創(chuàng)造的一種外源DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，后經(jīng)不斷的研究與提升，使轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高。SatoT（1998）[8]在香菇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中參與50U的限制性內(nèi)切酶SalI，轉(zhuǎn)化率提高了10倍，達(dá)成每微克DNA6個(gè)轉(zhuǎn)化子。本測(cè)驗(yàn)用HindⅢ、EcoRI、BamHI、BstEII、BstXⅠ介導(dǎo)轉(zhuǎn)化攜帶人胰島素基因的質(zhì)粒pCB-BCA28(圖5)，結(jié)果說明，上述5種內(nèi)切酶都可以用于pCB-BCA28轉(zhuǎn)化銀耳芽孢，可獲得大量的轉(zhuǎn)化子（圖6）。

2.4轉(zhuǎn)化子的GUS檢測(cè)

分別從上述5個(gè)處理的轉(zhuǎn)化平板中隨機(jī)挑揀單菌落，移植到CM培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)2代后，以E.coliDH5α為陽(yáng)性對(duì)照、銀耳芽孢Tr21為陰性對(duì)照，測(cè)定21個(gè)轉(zhuǎn)化菌株的GUS活性。測(cè)驗(yàn)結(jié)果見表1和圖7，除了用BamHI介導(dǎo)的三個(gè)轉(zhuǎn)化子（BCA-10、BCA-12、BCA-14）沒有檢測(cè)到GUS活性外，其它18個(gè)轉(zhuǎn)化子都有GUS活性。

2.5轉(zhuǎn)化子的分子驗(yàn)證

由于人胰島素基因很小，僅有177bp，很難舉行Southern雜交。為此，我們應(yīng)用BCA基因、載體pCB-BCA28上的GUS基因和Tnos序列的特異引物對(duì)抗性菌株舉行PCR驗(yàn)證。

從上述21個(gè)轉(zhuǎn)化子中選擇10菌株提取染色體DNA，分別用BCA、GUS和Tnos基因的特異引物舉行PCR，以質(zhì)粒pCB-BCA28為陽(yáng)性對(duì)照、銀耳芽孢Tr21染色體DNA為陰性對(duì)照、不加任何模板為空白對(duì)照，檢測(cè)這10個(gè)菌株的染色體DNA是否帶有BCA、GUS和Tnos序列。測(cè)驗(yàn)結(jié)果如圖8（BCA基因）、圖9（GUS基因）和圖10（Tnos序列）所示。陰性對(duì)照Tr21的染色體DNA沒有BCA同源序列，質(zhì)粒pCB-BCA28和10個(gè)轉(zhuǎn)化子都有177bp的擴(kuò)增片段。

檢測(cè)結(jié)果說明，空白對(duì)照沒有擴(kuò)增出任何片段，說明PCR回響是穩(wěn)當(dāng)?shù)?；陰性?duì)照沒有任何擴(kuò)增片段，而10個(gè)轉(zhuǎn)化子都擴(kuò)增出BCA、GUS和Tnos的特異片段，片段長(zhǎng)度與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照一樣，說明這10個(gè)轉(zhuǎn)化菌株染色體DNA帶有這些外源序列，即它們是真正的轉(zhuǎn)化子。

3議論

Southern雜交是外源基因轉(zhuǎn)化常用的鑒定方法，它不但可以檢測(cè)出外源基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞或組織，還可檢測(cè)出整合的拷貝數(shù)，但是，該方法技術(shù)繁雜，檢測(cè)本金較高，并且對(duì)于較短的基因片段難以檢出。目前大量測(cè)驗(yàn)室通常先舉行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性株系再舉行Southern雜交，降低測(cè)驗(yàn)費(fèi)用。

本測(cè)驗(yàn)的GUS活性檢測(cè)結(jié)果說明，BCA-10、BCA-12和BCA-14沒有GUS活性。但是，BCA-10和BCA-14的GUS基因PCR檢測(cè)結(jié)果卻是陽(yáng)性（BCA-12沒有檢測(cè)），說明GUS基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞但沒有表達(dá)，是否由于整合位置與GUS基因表達(dá)有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。

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