近五年來茶葉生物化學研究進展,生物化學論文

近五年來茶葉生物化學研究進展,生物化學論文茶葉生物化學是研究茶樹生命化學的科學，在生物化學與分子水平討論茶樹生命的本質，研究茶樹十分是茶樹新梢中分子的構造與功能、物質代謝與調節(jié)，及其在生命活動中的作用；研究茶樹新梢的化學分子在加工及貯藏經過中的轉化規(guī)律以及對茶葉品質及茶葉健康功能的影響；茶葉生物化學是茶學發(fā)展的基礎科學。茶葉生物化學的研究成果為茶樹栽培和育種、茶葉加工及深加工、茶葉貿易和文化提供了堅實的理論根據(jù)。茶葉生物化學研究的不斷深切進入為茶產業(yè)的發(fā)展提供了動力源泉。作為葉用植物，茶樹新梢是茶樹代謝最為旺盛的部位之一，在次級代謝上有其獨特性，詳細表如今新梢含有極其豐富的兒茶素、咖啡堿和茶氨酸等特征性次級代謝產物上，因此它們在茶樹體內的生物合成及其在制茶經過中的轉化等機制研究是茶葉生物化學的核心問題。近年來，茶樹功能基因、次級代謝關鍵酶及基因、茶葉代謝譜、茶葉功能成分與健康等的相關研究呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。本文就近五年來茶葉生物化學研究主要的進展內容綜述如下。1茶樹次級代謝途徑的研究植物次級代謝是植物在進化中與環(huán)境互相作用的結果。與其他植物比，茶樹次級代謝的特點是，富含兒茶素、咖啡堿和茶氨酸等特征性次級代謝產物。近年來，茶樹次級代謝研究主要集中在這些特征性次級代謝產物兒茶素、咖啡堿和茶氨酸的代謝途徑中的關鍵酶及相關基因的研究，已獲得一些重大進展。1.1茶樹中兒茶素代謝相關研究進展兒茶素類物質〔黃烷-3-醇〕對茶葉品質和健康成效的奉獻度極高，其代謝十分是合成代謝一直是茶樹次級代謝研究的重中之重。兒茶素由莽草酸途徑合成而來，近年來兒茶素B環(huán)5羥基化途徑和C環(huán)沒食子?；緩揭殉蔀閮翰杷仡惢衔锖铣纱x研究中的重點[1].2004年，Punyasiri等的研究表示清楚，在茶樹兒茶素合成途徑中，EC和EGC是由花白素經花青素合成酶〔ANS〕和花青素復原酶〔ANR〕的二步催化構成[2],而不是由兒茶素和沒食子兒茶素直接表構而成，但兒茶素的沒食子?；芯窟€是空白。新近夏濤研究小組發(fā)現(xiàn)，酯型兒茶素合成以非酯型的EC和EGC為前體，牽涉兩步合成反響，即沒食子酸首先在沒食子?；?1-O--D-葡萄糖基轉移酶〔UGGT〕催化下，被活化構成1-O-沒食子酰--葡萄糖〔G〕，以此作為活化的酰基供體〔1-O-Glcesters〕，再在1-O-沒食子?；?-D-葡萄糖-O-沒食子?；D移酶〔ECGT〕作用下，將沒食子?；D移到順式非酯型兒茶素的C環(huán)3位上而構成酯型兒茶素ECG和EGCG〔圖1〕[3].除此之外，該研究組還發(fā)現(xiàn)了高活力的酯型兒茶素水解酶〔GCH〕，該酶可能屬于單寧酶類，可水解酯型兒茶素為沒食子酸和非酯型兒茶素。兒茶素還可進一步聚合構成原花青素〔PAs〕，在茶樹根和莖中大量積累，而葉片中含量很低[4].上述研究結果為茶樹酯型兒茶素的合成與轉化提供了較為清楚明晰的途徑。兒茶素代謝途徑遭到多種轉錄因子的調控。安徽農業(yè)大學茶葉研究小組發(fā)現(xiàn)相關轉錄因子MYB、WD40和bHLH等介入了茶樹中多酚類物質的代謝調控[5].除此之外，還對茶樹發(fā)育相關和組織特異性相關的酚類物質積累形式、63個酚類物質合成相關構造基因和轉錄因子基因表示出形式進行了相關分析[6].利用體外表示出手段〔原核與真核〕，對酚類物質合成關鍵酶基因CAD〔肉桂醇脫氫酶〕、ANR1、ANR2、DFR1、DFR2、LCR1、F3H、F35H、MYB5功能進行了有效鑒定。Umar等[7]利用茶樹F3H、DFR和LCR構建了大腸桿菌基因工程菌，以圣草酚〔3，4，5,7-四羥基黃烷酮〕為底物合成了EC、ECG、〔+〕-C和CG.茶樹中兒茶素的合成代謝還遭到外界環(huán)境的影響。Rani等對茶樹兒茶素合成途徑中的關鍵基因F3H、DFR、ANS和ANR的表示出，以及干旱、脫落酸、赤霉素、傷害處理對其表示出影響進行了研究分析[8].劉仲華研究組以白化茶樹品種為研究對象，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸裂解酶〔PAL〕基因和黃酮醇合成酶〔FLS〕基因表示出與兒茶素濃度呈負相關，而黃烷酮-3-羥化酶〔F3H〕基因表示出呈正相關[9].夏濤等發(fā)現(xiàn)大田遮蔭處理可使茶樹酚類物質中的黃酮醇、原花青素合成顯著下降；但兒茶素和木質素總量稍下降，而對EGCG含量影響最小[10].進一步發(fā)現(xiàn)黑暗培養(yǎng)的茶愈傷組織移至光下培養(yǎng)后，木質素、花青素、兒茶素的積累量明顯增加。與黑暗處理相比，弱光處理后茶籽苗中非酯型兒茶素含量增加，酯型兒茶素積累卻顯著下降[11].1.2茶樹中咖啡堿代謝相關研究進展咖啡堿〔1,3,7-三甲基黃嘌呤〕代謝與腺嘌呤核苷酸代謝密切相關。茶樹咖啡堿主要在幼嫩葉片和茶花中進行生物合成，合成部位可能在葉綠體。2000年，Kato等從茶樹葉片中純化出咖啡堿生物合成關鍵酶咖啡堿合成酶〔3-NMT+7-NMT〕，并對該酶基因進行克隆和測序[12].植物體內咖啡堿生物合成的核心途徑為：黃嘌呤核苷7-甲基黃嘌呤核苷7-甲基黃嘌呤可可堿咖啡堿，華而不實包括3步由N-甲基轉移酶催化的轉甲基化反響和1步由核糖核苷水解酶催化的脫核苷反響〔圖2[13]〕；而咖啡堿的降解主要途徑為咖啡堿茶葉堿3-甲基黃嘌呤黃嘌呤尿酸尿囊素尿囊酸尿素NH3+CO2[13].近年來相關研究主要集中在咖啡堿代謝途徑中關鍵酶及其基因的的克隆、構造與功能的關系以及表示出調控機制等。通過克隆源自咖啡的黃嘌呤核苷甲基轉移酶基因〔CaXMT1〕和源自茶樹的咖啡堿合成酶基因〔TCS1〕導入酵母中進行組合表示出后，飼喂黃嘌呤核苷〔XR〕和SAM,成功合成了咖啡堿[14].劉祥琦通過疑似N-甲基核苷水解酶基因〔STx〕的克隆和大腸桿菌表示出發(fā)現(xiàn)該酶具有催化XR脫核糖反響的功能[15].金基強等從白葉一號茶樹中，獲得了6種NMTs的基因組DNA全長，發(fā)現(xiàn)了3種TCS3、TCS4和TCS5基因[16].魏艷麗從茶樹中克隆出了AMP脫氨酶基因的cDNA全長〔GenBank:AGJ84350.1〕[17].由于一些特殊人群對咖啡堿敏感，低咖啡堿茶樹品種的選育一直是科研工作者的目的之一。Mohanpuria等采用RNAi技術培育出TCS基因沉默的轉基因茶樹植株，咖啡堿和可可堿的含量與對照比分別下降了44%~61%和46%~67%;同時，還利用農桿菌侵染導入RNAi片段，使得茶樹幼苗新梢中咖啡堿和可可堿含量最高分別下降了67%和61%[18-19].1.3茶樹中茶氨酸代謝相關研究進展茶氨酸〔N-乙基--L-谷氨酰胺〕系茶樹特征性非蛋白質氨基酸，主要通過茶氨酸合成酶TS催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，現(xiàn)已在Genebank登錄的TS基因有3條〔DD410895,DD410896、JN226569〕。盡管這些基因序列和植物中的谷氨酰胺合成酶〔GS〕序列高度同源，但通過大腸桿菌和擬南芥體外功能驗證實驗已先后證明其具有GS所不具備的體外合成茶氨酸的能力[20].TS1主要在根部和葉部高表示出；TS2在盛花期表示出量最高；TS3的表示出量在單芽萌發(fā)階段和主側根中最高〔結果未發(fā)表〕。茶氨酸的合成具有明顯的時空特異性，介入多個器官的氮素貯藏與轉運，遭到復雜的分子調控。茶氨酸的合成還遭到眾多生物和非生物因素的調控。鹽脅迫、外源施加ABA、NO等激素信號分子也會促進茶樹體內茶氨酸大量積累，講明茶氨酸與茶樹抵御逆境脅迫息息相關，通過染色體步移技術克隆到TS基因的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)多個響應光調節(jié)、激素調節(jié)和逆境脅迫等的順式作用元件，若對其進行深切進入研究與驗證，將有助于解析茶樹體內大量積累茶氨酸的生物學意義[21].1.4茶樹萜烯類香氣物質代謝研究進展茶鮮葉中含有30余種糖苷態(tài)萜烯類香氣物質，如芳樟醇及其氧化物和香葉醇等。這些揮發(fā)性萜類及其糖苷的含量和水解對成品茶的香氣類型有重要影響。植物經2-C-甲基-D-蘚糖醇-4-磷酸〔MEP〕和甲羥戊酸〔MVA〕途徑合成萜烯類物質。單萜和倍半萜合成酶是揮發(fā)性萜類化合物生物合成途徑中的關鍵酶；糖基轉移酶可能與茶鮮葉中糖苷態(tài)萜類香氣化合物的合成和積累有關；而糖苷水解酶則催化糖苷態(tài)香氣物質的水解，導致香氣物質的釋放[22].Yang等[23]對茶樹中的香氣物質生物合成途徑進行了系統(tǒng)總結，如此圖3所示。茶樹中萜烯類物質合成途徑中的相關酶基因報道較少，而更多地側重在糖苷水解酶相關基因的研究。陳亮等研究發(fā)現(xiàn)，8個品種中茶樹-葡萄糖苷酶基因表示出量是-櫻草糖苷酶的2.4~45.6倍，但-葡萄糖苷酶活性測定結果與基因表示出量之間的相關性不明顯[24].1.5茶樹基因組研究進展當代生物技術的迅猛發(fā)展為茶樹次生代謝的研究提供了重要的技術手段和方式方法。固然茶樹次級代謝的分子生物學研究起步較晚，但當前還是茶葉學科中最活潑踴躍和進展最快的一個領域。在這里領域中業(yè)已分離和挑選出茶樹特征性次級代謝物的相關功能基因，并對其功能進行了研究。在茶樹分子生物學研究中，AFLP、RAPD、RFLP和EST-SSR等技術等已成功應用于茶樹DNA分子標記，構建了茶樹次級代謝物差減雜交cDNA文庫、龍井43新梢和幼根的cDNA文庫和阿薩姆雜交種TV-1嫩梢的cDNA文庫[25];并利用cDNA芯片技術獲得了安吉白茶不同白化期的671個差異表示出基因[26].Wu等利用454測序技術對茶樹葉部的轉錄組進行了研究，獲得了25637個編碼基因〔unigene〕和3767個EST-SSRs標記[27].李娜娜等利用Solexa法對福鼎大白茶和小雪芽品種葉部的轉錄組進行了研究，獲得了79797個unigenes和6439個SSRs標記[28].2018年，安徽農業(yè)大學茶葉重點實驗室啟動茶樹基因組研究計劃，對2個栽培種和1個古茶樹進行了45倍深度基因組測序，獲得了基因和分子標記信息，為茶樹基因組序測序方式方法和材料選擇上提供了重要根據(jù)；同時進行了茶樹全器官轉錄組與功能表示出譜研究[29];以茶樹帶芽莖段為外植體建立了離體再生體系[30].這些研究結果為進一步揭示茶樹優(yōu)質、高產和抗逆的分子機理提供了重要的基礎數(shù)據(jù)與平臺。2茶樹次級代謝譜的研究進展近年來，茶樹次級代謝的研究還具體表現(xiàn)出在特征性次級代謝物的代謝譜研究上，包括特異性種質資源代謝譜、茶葉加工經過代謝譜和環(huán)境以及農藝措施對茶樹代謝譜影響等相關研究。2.1特異性種質資源代謝譜的研究張凱等[31]在川渝地區(qū)11種野生大茶樹中發(fā)現(xiàn)南川1號中EGCG含量大于13%,南川1號和2號中咖啡堿含量高于5%和咖啡堿含量僅有0.32%的黃山苦茶等特異性資源。謝吉林等[32]研究了滇西南茶區(qū)的468份曬青毛茶樣品，發(fā)現(xiàn)咖啡堿含量春茶最高，夏秋茶依次下降，且咖啡堿的含量與游離氨基酸總量存在顯著相關。貴州綠茶樣品中兒茶素和咖啡堿含量分別在9.14%~27.28%和1.08%~3.33%之間[33].Kilel等[34]發(fā)現(xiàn)，與中國的Hanlu種和日本的Yabukita種相比，肯尼亞12個紫芽葉品系綠茶中總多酚含量更高層次，10個品系茶氨酸較高。從紫色芽葉中還分離鑒定了7種花色素物質，華而不實錦葵素的含量最為豐富。在同一品種中，兒茶素含量和花青素含量存顯著負相關[35].Wang等[36]通過119份茶樹種質資源研究發(fā)現(xiàn)，阿薩姆種中-胡蘿卜素和葉黃素含量最高。2.2茶葉加工和貯藏經過中代謝譜的變化王秀梅[37]研究發(fā)現(xiàn)，祁門紅茶加工揉捻經過中醇類和醛類香氣成分大幅增加，而酮類和烷烴類變化不明顯；多糖類含量呈下降趨勢，單糖含量略有增加；生物堿基本保持不變，枯燥后氨基酸含量變化明顯。陳紅霞對普洱茶渥堆發(fā)酵經過進行檢測發(fā)現(xiàn)，在渥堆發(fā)酵經過中，兒茶素類、黃酮醇類和茶氨1主體，酯型兒茶素和茶氨酸中無檢出，纈氨酸含量持續(xù)增加；嘌呤堿中的咖啡堿和可可堿含量無顯著改變，而黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、甜菜堿等含量則不斷增加。除此之外，姜姝等和呂昌勇還分別對普洱茶不同發(fā)酵時期微生物群落的宏轉錄組和宏基因組學進行了研究。Ku等[39]利用LC-PDA-ESI/MS技術比擬了不同貯藏年限的18種普洱生茶和12種普洱熟茶中的代謝譜，發(fā)現(xiàn)木麻黃素、三沒食子酰葡萄糖、綠原酸、EGC、ECG、EGCG和茶沒食子素在生茶中含量較高，而熟茶中GA含量較高；生茶中，隨著貯藏年限的增加，EGCG、ECG、EGC、奎寧酸、綠原酸和木麻黃素顯著降低，而GA顯著增加；而不同貯藏年限的熟茶間主要化合物差異不明顯。曹艷妮[40]用SDE-GC-MS比擬了10種普洱生茶和熟茶的香氣，發(fā)現(xiàn)生茶獨有組分13種，而熟茶獨有組分有36種；生茶以具有木香、花香的萜烯類和具有強烈新鮮香氣的二氫獼猴桃內酯為主，而熟茶則以具有霉味和陳香的甲氧基苯類為主。近年來，兒茶素物質在黑茶加工經過中的轉化產物遭到了十分關注。經渥堆發(fā)酵后的黑茶中出現(xiàn)了很多構造奇特的兒茶素類衍生物。據(jù)報道，普洱茶中的這類衍生物包括普洱茶素A〔1〕和B〔2〕，普洱茶素I-VIII〔3-10〕等新化合物，以及表兒茶素-[7,8-bc]-4-〔4-羥苯基〕-二氫-2〔3H〕-吡喃酮〔11〕和cinchonainlb〔12〕等[41-42].茯磚茶中發(fā)現(xiàn)的兒茶素衍生物則包括新化合物茯磚素A-F〔13-18〕，plancholA〔19〕，文冠木素〔20〕，teadenolA〔21〕等〔圖4〕[43-44].普洱茶中主要是兒茶素A環(huán)通過碳碳鍵連接新的基團，而茯磚茶中的衍生物則主要是兒茶素B環(huán)裂環(huán)后的產物。這很可能是源于兩種黑茶中不同的微生物優(yōu)勢菌群。2.3農藝措施對茶樹代謝譜的影響楊亦揚等[45]利用1H-核磁共振〔1H-NMR〕的代謝組學非靶標分析與HPLC定量分析結合，研究了不同施氮水平對白天和夜晚茶樹新梢代謝譜的差異，表示清楚晝夜主要差異組分為茶氨酸、谷氨酸、葡萄糖、蔗糖、EC和GC;而不同施氮水平對天冬氨酸和兒茶素組分影響顯著。Yang等[46]利用UPLC-TOF-MS、CE-TOF-MS〔毛細管電泳飛行質譜聯(lián)用〕、HPLC和GC-MS等技術，對遮蔭3周后的藪北種新梢進行化學分析后發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性脂肪酸衍生物〔如：2-己醛、2-戊烯-1-醇、3-己烯醇乙酯、〔Z〕-3-己烯-1-醇、壬醛、壬醇和辛醇〕和苯丙素類/苯環(huán)型揮發(fā)物〔VPBs,如苯甲醛、水楊酸甲酯、苯甲醇、2-苯乙醇〕等顯著提高；而〔S〕-芳樟醇、順式或反式芳樟醇氧化物〔呋喃型和吡喃型〕、橙花醇、香葉醇、-萜品醇和橙花叔醇等萜烯類香氣組分和糖苷類香氣前體變化不顯著；進一步研究發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理后VPBs合成的上游前導物如莽草酸、預苯酸和苯丙酮酸含量顯著降低，但VPBs合成另一前導物氨基酸中的絕大多數(shù)氨基酸〔含L-苯丙氨酸〕的含量則顯著增加；生物堿中的咖啡堿含量增加，而可可堿含量降低；遮蔭處理除琥珀酸和GABA略有降低外，對TCA循環(huán)其他代謝物無明顯影響；兒茶素含量顯著下降。3茶葉品質化學研究進展近年來，隨著茶葉分析技術的快速發(fā)展，茶葉品質化學的研究得到進一步加強。3.1兒茶素氧化縮聚產物的研究茶鮮葉中兒茶素在紅茶和黑茶的加工經過中發(fā)生了劇烈的氧化聚合和縮合反響，產生了茶黃素、茶紅素和茶褐素等氧化產物。Sang等[47]綜述了茶葉成分化學及其生化轉化，兒茶素不僅可發(fā)生2聚合反響生成茶黃素，而且茶黃素還可進一步與兒茶素反響，構成具有2個或3個苯駢卓酚酮構造的化合物，如此圖5.這些結果表示清楚茶黃素類可進一步介入茶紅素的構成。據(jù)報道，茶紅素主要由分子量在2100Da下面的化合物聚合而成，這些化合物主要由兒茶素及其沒食子酸酯、酚酸和茶黃素等組成，并且可能是多羥基化的寡聚體[48].3.2茶葉苦澀味研究我們國家生產的大部分夏季綠茶滋味較春茶偏苦澀。2005年德國學者Scharbert和Hofmann通過對紅茶內含成分的分離和測定，結合感官分析，確定了引起紅茶中澀味的主要物質為EGCG和黃酮醇苷，苦味物質是EGCG和咖啡堿[49].宛曉春研究組收集測定了我們國家綠茶主產區(qū)160個春季和夏季綠茶樣品中主要呈味成分，并結合感官定量評定法和數(shù)據(jù)判別分析，發(fā)現(xiàn)夏季綠茶中茶多酚和咖啡堿含量較高，而茶氨酸和其他氨基酸含量偏低，這可能是導致夏季綠茶苦澀味側重的主要原因[50].在加工經過中，通過改良攤放工藝、殺青工藝、揉捻工藝以及添加外源酶等可減輕成品茶的苦澀味。3.3茶葉香氣化學的研究袁海波等、施夢南和龔淑英以及Yang等對茶葉香氣物質的生物合成、加工經過對成茶香氣構成的影響、茶葉香氣的特征和茶葉香氣的分析檢測方式方法等方面，進行了較為系統(tǒng)的綜述。Yang等[23]歸納總結了茶湯中部分特征性香氣物質的香型及閾值〔表1〕。3.4茶葉化學品質差異研究李萬春[51]利用衍生化GC/MS方式方法，對18個烏龍茶〔12個鐵觀音和2個水仙〕、3個綠茶、1個白茶和2個紅茶樣品進行了代謝譜〔糖類、有機酸、氨基酸和咖啡堿〕分析，結果表示清楚鐵觀音和水仙能清楚分類，紅茶和其他茶類差異最大。Zhang等[52]應用GC-TOF-MS和LC-Q-TOF-MS技術檢測了12種綠茶、12種烏龍茶和9個紅茶的代謝譜，分別獲得1812和2608個特征峰，在3類茶挑選出90種存在顯著差異的化合物，華而不實包含兒茶素、氨基酸、糖、有機酸和黃酮苷類等成分。葉茂[53]比擬發(fā)現(xiàn)了22種普洱茶的化學成分與1種西湖龍井和1種立頓紅茶有顯著差異，且不同品種、產地、