第十一講蛋白質(zhì)的測定

第十一講蛋白質(zhì)的測定第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日教學內(nèi)容了解蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)系數(shù)、氨基酸和氨基酸態(tài)氮的概念，凱氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸態(tài)氮的測定原理；掌握凱氏定氮法和雙指示劑甲醛滴定法、電位滴定法。第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日自學引導題1、蛋白質(zhì)系數(shù)是如何計算出來的？2、蛋白質(zhì)的測定方法有哪些？國家標準是哪一種方法？第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日6.1概述(1)蛋白質(zhì)的生理功能(2)蛋白質(zhì)含量的測定意義(3)蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)(4)蛋白質(zhì)的測定方法(5)蛋白質(zhì)系數(shù)第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日2004/4安徽阜陽劣質(zhì)奶粉致大頭娃娃171,13人死頭臉胖大，四肢細短，體重比出生時還輕205個奶粉品46個不合格生產(chǎn)廠家的55種奶粉。分布8個省，其中蛋白質(zhì)含量低于5%的有31種，最少的僅為0.37%，第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日（1）蛋白質(zhì)的生理功能蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎維持人體的酸堿平衡、水平衡遺傳信息的傳遞物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關。

6.1概述第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日

(2)蛋白質(zhì)含量的測定意義人體重要的營養(yǎng)物質(zhì),食品的營養(yǎng)指標。合理開發(fā)利用食品資源、優(yōu)化食品配方、指導經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控制、提高和監(jiān)督產(chǎn)品質(zhì)量。第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)是復雜的含氮有機化合物，分子量很大。組成：20種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結合起來化學元素：C、H、O、N（P、S、Cu、Fe、I）；官能基團：肽鍵、氨基酸殘基、酸堿基因、芳香基團結論：含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機化合物的主要標志。(3)蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日

可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，如含氮、肽鍵、折射率等；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性或堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。目前蛋白質(zhì)測定最常用的方法是凱氏定氮法，通過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量。(4)蛋白質(zhì)的測定方法第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)系數(shù)：每份氮素相當于的蛋白質(zhì)的份數(shù)。一般蛋白質(zhì)含氮為16%，所以1份氮素相當于6.25份蛋白質(zhì)。此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用F表示。不同的蛋白質(zhì)由于氨基酸的構成比例及方式不同，含氮量不同。不同種類的食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。(5)蛋白質(zhì)系數(shù)第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日不同產(chǎn)品的蛋白質(zhì)系數(shù)(F)

玉米、雞蛋、青豆等：6.25

花生：5.46

大米：5.95

大豆及制品：5.71

小麥：5.70

牛乳及制品：6.38第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日(1)

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。從消耗的標準酸計算出總氮量，再折算為粗蛋白含量。常量凱氏定氮法

1、通過學習覬氏定氮法的原理，我們可知道操作分為哪幾個大的步驟？2、加入硫酸鉀、硫酸銅的作用是什么？自學引導第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日

1、消化

反應方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。

濃硫酸又具有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫：

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應方程式如下：

2、蒸餾

2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日3、吸收

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進行吸收：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O4、滴定

待吸收完全后，再用鹽酸標準溶液滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日

準確稱取均勻的固體樣品0.5～3g,或半固體樣品2～5g,或吸取溶液樣品15～25ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45°角傾斜置電爐上，在通風櫥內(nèi)加熱消化。(2)測定方法①

樣品消化第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日若無通風櫥可于瓶口倒插入一口徑適宜的干燥管，用膠管與水力真空管相連接，利用水力抽除消化過程所產(chǎn)生的煙氣。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日注意問題：①加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸；②消化開始時不要用強火，要控制好熱源，并注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全；第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日③樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過程中產(chǎn)生大量泡沫；④消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日②蒸餾、吸收第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日按圖裝好蒸餾裝置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶內(nèi)預先裝有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示劑5~6滴）。第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日注意問題：安裝的裝置應整齊美觀、協(xié)調(diào)，儀器各部件應在同一平面內(nèi)平行或垂直。不能漏氣。第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日要注意控制熱源使蒸汽產(chǎn)生穩(wěn)定，不能時猛時弱，以免吸收液倒吸；蒸餾前加堿量應使消化液呈深藍色或產(chǎn)生黑色沉淀。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日3、滴定將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標準溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。

注意問題：所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日（3）試劑消化用：①濃硫酸②硫酸鉀③硫酸銅蒸餾用：④40%氫氧化鈉溶液第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日吸收用：⑤4%硼酸滴定用：⑥0.1000mol/LHCl標準溶液⑦0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度其反應式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日硫酸銅的作用

催化作用、指示作用（消化完全指示：藍綠色；蒸餾時堿性反應完全指示：變深藍色或產(chǎn)生黑色沉淀）第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

說明事項：

蒸餾過程應注意接頭處無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關閉電源，絕不能先關閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測定的定型儀器——微量凱氏定氮器。第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日6.3氨基酸態(tài)氮的測定為提高蛋白質(zhì)的生理效價而進行食品氨基酸互補和強化的理論，對食品加工工藝的改革，對保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日

氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品的質(zhì)量指標，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指標之一，其中的含氮量可直接測定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。氨基酸態(tài)氮反映的是樣品中游離氨基酸的總量。第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日氨基酸態(tài)氮的測定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日6.4.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結合，從而破壞內(nèi)鹽。這樣就可以用強堿標準溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸的總量。第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日（2）操作：用中性紅作指示劑，先測定其它游離酸的含量再用百里酚酞作指示劑測定氨基酸和游離酸的總含量。（3）方法適用范圍淺色樣品第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日(4)操作方法

移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至由紅色變?yōu)殓晟珵榻K點；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別紀錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日式中

c——氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL;m——測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

(5)結果計算

氨基酸態(tài)氮

（%）第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日6.4.2電位滴定法(1)原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的電極插入被測液中，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點。(2)儀器酸度計（附磁力攪攔器）；第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日(3)試驗步驟①樣品處理吸取樣品液于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中,加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開動磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當。用標準緩沖液校正好酸度計，然后將電極清洗干凈，再插入到上述樣品液中，用NaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2,記下消耗的NaOH溶液體積。第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日②氨基酸的滴定在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,記下消耗的NaOH溶液體積。第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日③空白滴定吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標準溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積。操作說明：第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的NaOH溶液體積不用于計算。第二步滴定才是測定氨基酸，用消耗的NaOH溶液體積進行計算。第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日

（V1-V2）×C×0.014氨基酸態(tài)氮%=————————————×100m×20/100V1---醬油稀釋液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標準溶液的體積mLV2---空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標準溶液的體積mLC---NaOH標準溶液的濃度mol/Lm---吸取的醬油的質(zhì)量g0.014---氮的毫摩爾質(zhì)量g/mmol（4）結果計算第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日作業(yè)現(xiàn)抽取南寧醬油廠生產(chǎn)的塑料袋裝鐵鳥牌醬油1袋（規(guī)格500mL）（生產(chǎn)日期20050520），要求測定氨基酸態(tài)氮含量。某檢驗員按密度瓶法測定了該醬油的相對密度為1.128，然后吸取醬油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中,加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開動磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當。用pH6.18的標準緩沖液校正好酸度計，然后將電極清洗干凈，再插入到上述醬油液中，用0.0498mol/L

NaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2,消耗的NaOH溶液體積為2.21mL。第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,消耗的NaOH溶液體積為9.12mL。吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標準溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積為1.36mL。

1、請問在測定過程中為什么要加入中性甲醛？

2、計算該次氨基酸態(tài)氮含量測定結果。

3、該檢驗員按同樣的方法另作了4次測定，結果分別為0.49%,0.36%,0.50%,0.52%，請你寫一份完整的檢驗評價報告。第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日相關知識點回顧：一、可疑值的取舍

Q檢驗法：當測定次數(shù)較少時,Q檢驗法是一種常用的簡便方法。該法是將測定值按大小順序排列,由可疑值與其相鄰值之差的絕對值除以極差,求得Q值。第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日

Q值愈大,表明可疑值離群愈遠,當Q值超過一定界限時應舍去可疑值。下表為不同置信度時的Q值。當計算值大于或等于表中值時,該可疑值應舍去,否則應予保留。第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日

例如,平行測定鹽酸濃度(mol/L),結果為0.1014,0.1021,0.1016,0.1013。試問0.1021在置信度為90%時是否應舍去。第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日

查表,當n=4,Q0.90=0.76。因Q<Q0.90,故0.1021不能舍去。當測定次數(shù)在3-10次之間時，最好用Q檢驗法。第五十頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、對方法相對標準偏差的要求，一般主要取決于被測對象的含量，含量越高要求相對標準偏差越低，例如，大于10%的含量相對標準偏差一般不大于1%，隨著含量的降低，相對標準偏差可逐步增加，5%，10%，20%，30%甚至50%。生產(chǎn)工藝有特殊要求的，由技術條件決定。

第五十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日習題講解：解：1、加入中性甲醛是為了固定氨基酸中的氨基，使羧基顯示出酸性，才能進行氨基酸測定。2、依據(jù)題意，醬油的相對密度d420=1.128,取樣體積V＝5.00mL醬油的質(zhì)量m＝d420×V＝1.128×5.00＝5.64g第五十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日醬油稀釋液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標準溶液的體積V1＝9.12mL空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標準溶液