組織化學技術免疫組化

組織化學技術免疫組化第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日1．發(fā)展簡史——1941年Coons首先用熒光素標記抗體—檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功?！?0年代Nakane建立酶標抗體技術——鐵蛋白標記Ab技術?！?0年代Stemberger改良上述技術，建立辣根過氧化物酶——抗體過氧化物酶（PAP

）技術，使免疫細胞化學得到廣泛應用。第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日——80年代Hsu等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡技術相繼問世。——90年代分子雜交技術、原位雜交技術、免疫細胞化學分類方法迅速發(fā)展?！?000年各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組化技術成為當今生物醫(yī)學中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應用范圍深達醫(yī)學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日2．免疫組織化學的技術分類（1）根據(jù)染色方式分成：①貼片染色②漂浮染色（2）根據(jù)Ag—Ab結合方式分成：①直接法②間接法③多層法第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）按標記物的性質(zhì)分成：①免疫熒光技術（免疫熒光法）②免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD

法、ABC法）③免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）3．標記物（1）必要性：組織細胞內(nèi)Ag—Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日（2）常用標記物①熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，

FITC）——熒光顯微鏡下呈綠色熒光四乙基羅達明（rho—damineRB200）

——熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光②酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④鐵蛋白金等：主要應用于免疫電鏡。其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日4．應用

凡是組織細胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學方法顯示，因而目前在基礎與臨床科研中被廣泛應用。最近幾年，分子生物學研究異常活躍，但最終還要歸到形態(tài)上來。用免疫組織化學方法對所研究的大分子分子進行定位，進而深入研究其功能。第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日一、免疫組織化學技術（一）染色方法1．直接法熒光素直接標記特異性抗體（—抗）上，標記抗體與抗原結合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測抗原?！髅笜丝贵w要顯示后鏡檢。第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日直接法優(yōu)點：簡單，時間短，特異性強。

缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟）。

應用：基本不用了?。〉诰彭?，共四十一頁，2022年，8月28日2．間接法

熒光素標記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的IgG抗體）?！@色后鏡檢

特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體→鑒定多種抗原。第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日3．非標記Ab橋法：“橋法”是酶標記抗體的改進，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。（1）單橋法第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日(2)雙橋法在三抗之后，將二抗和三抗再重復一次，可增大染色強度。★特別提示：注意動物種屬關系4．PAP法（過氧化物酶—抗過氧化物酶法

Peroxidaseanti—peroxidasemethod，PAP法）

~是橋法的改良，既先形成PAP復合物→抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP復合物。第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日

該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。5．ABC法（親和素—生物素—過氧化物酶復合物法，Avidin—biotin—peroxidaseComplexmethod，ABC法）

Avidin：親和素，一種糖蛋白，其上有4個與生物素相結合的位點。

Biotin：生物素—維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日（1）ABC復合物的制備：ABC法與PAP法的區(qū)別是：以ABC復合物代替PAP復合物。第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日（2）ABC法反應原理第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日6．SP或SAP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵

白素或過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染

色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-

vidin/alkalinephosphatase）※該法是ABC法基礎上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，而后再結合PO。它有4個亞基可與生物素結合，靈敏特異，背景低，成本低。第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日

現(xiàn)在還有plus盒。優(yōu)點是：更簡便，放大倍數(shù)↑，等電點中性更適合組織。分子量小，穿透力↑，原理保密。7．蛋白A—金法（Protein—Agoldmethod）

~多用于電鏡8．雙重組化染色法

應用雙重免疫組織化學激素可在同一張切片，同一細胞或亞細胞結構內(nèi)同時顯示兩種不同的抗原。第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日9．免疫金—銀染色法（Immunogold—silverstainingIGSS）（二）固定——見前述注意事項：1．固定劑的選擇：因組織而不同，注意質(zhì)量和性能。2．固定方式的選擇：①浸漬固定（參考文獻）②灌注固定（+后固定）③蒸汽固定第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日（三）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）1．切片脫蠟入水，入PAS洗三次/15分鐘。2．封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用新配置的0.3％H2O2

（在PAS或0.05Tris—HCL緩沖液PH7.6中或甲醇中）室溫，30分鐘。3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分鐘。4．減少非特異性著色第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日

用稀釋20倍的正常血清（產(chǎn)生二次抗體動物血清！），室溫，30分鐘。5．滴加第一抗體，4℃過液或室溫5′~1hour。6．0.1MPBS，洗三次，每次5分鐘。7．滴加第二抗體，室溫15′~60′。8．0.1MPBS洗凈，洗三次，每次5分鐘。9．滴加ABC復合物，室溫15~60分鐘。10．0.1MPBS洗三次，每次5分鐘。第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日11．0.05MTris–HCL5~10分鐘，此步可省略。12．DAB—H2O2

顯色：用0.01％H2O2的DAB溶液，室溫5~30分鐘，隨時鏡檢（DAB用時新配）13．自來水洗凈。14．用Mayer蘇木精或0.5％甲基綠，復染胞核（可不染）。15．常規(guī)脫水、透明、封固、鏡檢。結果：棕褐色反應產(chǎn)物代表抗原X的定位。第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日（四）免疫組化染色基本技術及注意事項1．實驗計劃①根據(jù)課題的內(nèi)容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若

PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復合物。②若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日③選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。2．Ab稀釋度

（如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：①應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。如：工作液濃度為1∶1000，可選1∶5001∶1000，1∶1500試驗；若:1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日

原液的保存（—20℃）凍存——應選最佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20℃）于冰箱備用。④關于Ab保存應參照說明書。（3）Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內(nèi)進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性?！⒎茿b濃度越高越好。第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日3．Ab滴片技術

——所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。［注意］滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要領：甩凈組織周圍的水。4．PBS洗滌技術（1）洗滌的目的①保證離子濃度和PH值。②減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日Ab滴片圖示：（2）方法：洗三次，每次5分鐘。5．Ab孵育技術（1）必須在濕盒內(nèi)進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日（2）溫度與時間4℃：過液，＞1637℃：1hor參考說明書6．光鏡控制顯色方法（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時間的關系，室溫最宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。（五）對照組和染色結果的評價第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日

從表上可以看出，只有6，7實驗結果有意義。1～5均因?qū)φ战M的結果已否定Ab的特異性or因IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗or換用Ab?！锍鲜鰧φ战Y果分析之外，還必須從以下幾個方面綜合評價：第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日1．陽性染色特點①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區(qū)別）②染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色彌散性均勻）2．組織切片制作過程的影響①固定不良—非特異性染色，顯示不均。②邊緣干燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。3．人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日陽性對照：用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果，標為陽性對照。

陰性對照：用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日▲染色失敗的幾種原因：（1）所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內(nèi)。全部（－）原因可能：①染色未完全嚴格按照操作步驟進行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2

量少或失效；⑤復染或脫水劑使用不當?shù)谌捻?，共四十一頁?022年，8月28日（2）所有切片均呈陽性反應，原因可能是：①切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。②緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不徹底。③使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長。④抗體溫育的時間過長。⑤H2O2

濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）所有切片背景過深，原因可能是：①未加酶消化處理切片。②切片或涂片過厚。③漂洗不夠。④底物呈色反應過久。⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。⑥使用全血清抗體稀釋不夠。第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。最常見的原因是：標本的固定和處理不當。二、免疫電鏡技術

前言：

免疫電鏡技術又稱電子顯微鏡免疫細胞化學技術。是免疫細胞化學與電鏡技術相結合的產(chǎn)物，即在電鏡下對細胞內(nèi)抗原做定性或定量的研究。其中免疫鐵蛋白技術，免疫膠體金技術，免疫酶細胞化學技術等，皆為常用技術第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日※免疫細胞化學技術——細胞水平（光鏡分辨率）※電鏡免疫細胞化學技術——超微結構水平（電鏡分辨率）（一）組織固定與取材要求：即要求保持良好的超微結構，又要求保