動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體 課件 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)（第2課時）第2章二動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體本節(jié)聚焦1、什么是動物細(xì)胞核移植技術(shù)？2、動物體細(xì)胞核移植的基本過程是什么？3、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景有哪些？4、怎樣理性看待體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題？融合細(xì)胞細(xì)胞融合37℃40min正在融合的細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記膜蛋白人細(xì)胞小鼠細(xì)胞回顧-必修一：細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)1970年，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：

使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。2.結(jié)果：

融合后形成的雜交細(xì)胞就有原來兩個細(xì)胞的遺傳信息。3.原理：

細(xì)胞膜具有一定的流動性與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同1.概念：使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。2.結(jié)果：形成的雜交細(xì)胞具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息。3.原理：細(xì)胞膜具有一定的流動性4.誘導(dǎo)融合的常用方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法。與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同動物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)融合方法5.動物細(xì)胞融合的過程：細(xì)胞膜融合一、動物細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞核融合細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞融合的實(shí)質(zhì)6.動物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：兩個或多個細(xì)胞核融合為一個細(xì)胞核4.方法與植物原生質(zhì)體融合的方法相同物理方法：電融合法、離心法化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法一、動物細(xì)胞融合技術(shù)思考：19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。肺結(jié)核病人病理切片一、動物細(xì)胞融合技術(shù)4.方法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)一、動物細(xì)胞融合技術(shù)PEG融合法PEG可以使原生質(zhì)體的膜位降低，然后，原生質(zhì)通過鈣離子交聯(lián)促進(jìn)凝聚。另外，由于PEG的脫水作用，擾亂了分散在原生質(zhì)膜表面的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的排列，提高了脂質(zhì)顆粒的流動性，從而促進(jìn)原生質(zhì)體融合。擴(kuò)展電融合法，是指利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)，是最常采用的物理誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法電融合法5.優(yōu)點(diǎn)突破有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細(xì)胞融合都已獲得成功。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)6.應(yīng)用①研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。②利用動物細(xì)胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。比較項目細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)手段用途植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合總結(jié)：動、植物細(xì)胞雜交技術(shù)比較細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動性纖維素酶、果膠酶去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。用胰蛋白酶使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合。離心、電刺激、振動、聚乙二醇。特有:滅活病毒?？朔h(yuǎn)源雜交不親和，獲得雜種植株。獲得雜種細(xì)胞、制備單克抗體。1.定義：

機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的，能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。2.抗體的分布：（1）血清（主要）（2）組織液及外分泌液（如乳汁中，為新生兒提供抗體）3.機(jī)體通過什么免疫過程分泌抗體？體液免疫抗體二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用4.傳統(tǒng)抗體的生產(chǎn)方法缺點(diǎn)：制備的抗體一般為多克隆抗體，產(chǎn)量低、純度低，特異性差向動物反復(fù)注射某種抗原使動物產(chǎn)生抗體從動物血清中分離所需抗體二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用注射注射每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，克隆單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群，就可以獲取純度高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體。由于增殖能力有限，體外培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞難以大量制備單抗有限稀釋克隆化培養(yǎng)二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計了一個極富創(chuàng)造性的試驗(yàn)方案：解決米爾斯坦【英國】科勒【德國】抗體二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用注射到腹腔注射抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞誘導(dǎo)融合抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長多輪次的克隆化培養(yǎng)和抗體檢測體外大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體注射到腹腔注射抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞誘導(dǎo)融合抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長多輪次的克隆化培養(yǎng)和抗體檢測體外大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體B淋巴細(xì)胞依靠細(xì)胞表面受體與抗原（固定在固相載體上）結(jié)合。取出固相載體，再將與抗原結(jié)合的B林巴細(xì)胞從固相載體上沖洗下來。

（由于B細(xì)胞表面受體還在，所以此處得到的并不是漿細(xì)胞）同一種抗原可能與多種抗體與結(jié)合。因此，可能存在多種B淋巴細(xì)胞都可以依靠其細(xì)胞表面受體與同一種抗原結(jié)合。注射到腹腔注射抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞誘導(dǎo)融合抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長多輪次的克隆化培養(yǎng)和抗體檢測體外大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體HAT培養(yǎng)基上只有雜交瘤細(xì)胞可以生長增殖。機(jī)理可以自行查詢。若雜交瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)，得到的是能與特定抗原結(jié)合的多種抗體。此處將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，雖然接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個培養(yǎng)孔只有一個雜交瘤細(xì)胞，這樣每個孔培養(yǎng)得到的抗體就是單抗。注射到腹腔注射抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞誘導(dǎo)融合抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長多輪次的克隆化培養(yǎng)和抗體檢測體外大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體部分雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)過程種可能失去增殖或分泌抗體的能力，因此需要多輪抗體檢測和克隆化培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的穩(wěn)定的既能增殖又能分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。進(jìn)行誘導(dǎo)融合后，培養(yǎng)基中會有幾種細(xì)胞？思考15種骨髓瘤+B細(xì)胞骨髓瘤+骨髓瘤B細(xì)胞+B細(xì)胞B細(xì)胞(未融合)骨髓瘤(未融合)如何篩選出所需的雜交瘤細(xì)胞？思考2選擇培養(yǎng)基二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用1．DNA的合成有D途徑和S途徑兩種途徑，其中D途徑是在

葉酸的輔助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途徑是利用酶，催化次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）生成相應(yīng)的核苷酸。2．已知氨基蝶呤（A）是葉酸的拮抗物；實(shí)驗(yàn)所用的骨髓瘤細(xì)胞缺乏S途徑中的酶。拓展二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（A）合成DNAD途徑S途徑D途徑氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3如何得到能夠產(chǎn)生所需的單一抗體的雜交瘤細(xì)胞？思考3

使用96孔板培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，盡可能每一個孔只接種一個雜交瘤細(xì)胞，即將單個雜交瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，通過克隆化培養(yǎng)+抗體檢測，即可獲得大量產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用克隆化培養(yǎng)、抗體檢測？多孔細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞①將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。②然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。③陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。檢測原理？抗原—抗體雜交技術(shù)思考4如何大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，獲得所需抗體？將抗體檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而獲得大量單克隆抗體。體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔內(nèi)二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用從已免疫小鼠的脾臟中取B淋巴細(xì)胞小鼠腹腔多種雜交細(xì)胞抗體檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞融合選擇培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體體外細(xì)胞培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)與抗體檢測二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用本節(jié)小結(jié)項目第一次篩選第二次篩選（需要多次篩選）篩選原因方法篩選結(jié)果誘導(dǎo)融合后得到多種雜交細(xì)胞，還有未融合細(xì)胞等用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜種細(xì)胞才能生長。篩選出融合的雜種細(xì)胞選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞。用96孔板培養(yǎng)，在每個孔中盡量接種一個雜交瘤細(xì)胞的情況下進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)過多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。篩選出分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用【培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法比較】項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低規(guī)模小，產(chǎn)量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用比較項目植物體細(xì)胞雜交單克隆抗體的制備原理融合前的處理誘導(dǎo)手段結(jié)果應(yīng)用共同點(diǎn)細(xì)胞膜的流動性，細(xì)胞的全能性。細(xì)胞膜的流動性。纖維素酶、果膠酶去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。用胰蛋白酶使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合。離心、振動、電刺激，聚乙二醇。特有:滅活病毒?？朔h(yuǎn)源雜交不親和，獲得雜種植株。診斷試劑；用于治療疾病、運(yùn)載藥物雜種植株大量的單克隆抗體兩者都用到細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；融合中都會發(fā)生多種融合方式，因此都要進(jìn)行篩選。植物體細(xì)胞雜交vs單克隆抗體制備診斷試劑運(yùn)載藥物治療疾病應(yīng)用二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用思考討論資料1

用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用

在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕婦女體內(nèi)胎盤產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有?？梗ㄈ私q毛膜促性腺激素）單克隆抗體思考討論資料2

使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。抗體一藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugate,ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細(xì)胞毒素）三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用抗體藥物接頭細(xì)胞凋亡ADC被細(xì)胞吞噬二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用討論1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？

抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞。藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。討論2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？

可用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療。一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床上各具有什么優(yōu)勢？

單克隆抗體診斷試劑盒中的抗體只與特定的抗原反應(yīng)，故特異性和靈敏度提高生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，利于控制質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？診斷疾病①作為診斷試劑二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？治療疾?、谶\(yùn)載藥物二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？作為藥物治療疾病二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用動物細(xì)胞融合技術(shù)單克隆抗體的制備單克隆抗體的應(yīng)用1.動物細(xì)胞融合的概念、結(jié)果、原理、意義是什么2.動物細(xì)胞融合常用的方法，3.動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較1.單克隆抗體制備的研究背景1.診斷試劑2.運(yùn)載藥物3.治療疾病2.單克隆抗體制備動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體課堂小結(jié)一、概念檢測1.下列有關(guān)動物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交比較的敘述，錯誤的是（）A.它們的原理都涉及細(xì)胞膜的流動性B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導(dǎo)融合C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細(xì)胞D.前者主要為了獲得細(xì)胞產(chǎn)品，后者主要為了獲得雜種植株練習(xí)與應(yīng)用C2.科學(xué)家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關(guān)敘述正確的是（）A.利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒B.體外培養(yǎng)單個B淋巴細(xì)胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體C.將等量B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合,經(jīng)誘導(dǎo)后融合的細(xì)胞即為雜交瘤細(xì)胞D.將純化的核衣殼蛋白反復(fù)注射到小鼠體內(nèi)，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體練習(xí)與應(yīng)用A練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用假如你掌握了動物細(xì)胞融合技術(shù)，你想用這種技術(shù)來解決哪些問題？解決這些問題的大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風(fēng)險？請查閱相關(guān)資料，完善自己的思路，并形成文字報告，與同學(xué)交流?？梢岳脛游锛?xì)胞融合技術(shù)培育多倍體胚胎,研究其發(fā)育機(jī)制,甚至可能培育出新的物種。但是,目前相關(guān)技術(shù)還不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等問題,并且還可能帶來些倫理方面的問題。課堂檢測

1.犬細(xì)小病毒(CPV)單克隆抗體(CpvMcAb)可抑制病毒對宿主細(xì)胞的侵染及病毒的復(fù)制，進(jìn)而殺滅幼犬體內(nèi)病毒。下列相關(guān)敘述，錯誤的是()A．在CpvMcAb的制備過程中用到了動物細(xì)胞培養(yǎng)和動物細(xì)胞融合技術(shù)B．給幼犬注射CPV后，CPV抗體檢測呈陽性，說明發(fā)生了體液免疫反應(yīng)C．經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選出來的雜交瘤細(xì)胞即可直接生產(chǎn)CpvMcAbD．對雜交細(xì)胞培養(yǎng)時，需要無菌無毒環(huán)境，且溫度、氣體環(huán)境等要適宜C2.關(guān)于動物細(xì)胞融合的說法錯誤的是()A.動物細(xì)胞融合后形成的具有原來兩個或多個動物細(xì)胞遺傳信息的多核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞B.動物細(xì)胞融合己成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段C.常用于誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合手段有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等D.細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能A3.單克隆抗體制備過程中使用的骨髓瘤細(xì)胞是一種缺陷型細(xì)胞，在含有次黃嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(HAT)中無法生長；而小鼠B淋巴細(xì)胞是正常細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基上可正常存活。用聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合后，經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)，最終可在HAT培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞是()A.A骨髓瘤細(xì)胞之間形成的融合細(xì)胞B.B淋巴細(xì)胞之間形成的融合細(xì)胞C.骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞之間形成的融合細(xì)胞D.B淋巴細(xì)胞C4.科學(xué)家將經(jīng)過羊紅細(xì)胞免疫過的小鼠B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，并能分泌單克隆抗體。羊紅細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞在該實(shí)驗(yàn)中分別屬于()A.癌細(xì)胞和記憶淋巴細(xì)胞B.抗原物和漿細(xì)胞C.特定抗體物和記憶淋巴細(xì)胞D.癌細(xì)胞和漿細(xì)胞B5.為研制抗新型冠狀病毒的單克隆抗體，某研究性學(xué)習(xí)小組以兔子甲為實(shí)驗(yàn)材料設(shè)計了以下實(shí)驗(yàn)流程?；卮鹣铝袉栴}：習(xí)題鞏固1.利用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用。下列說法錯誤的是（

）A、B淋巴細(xì)胞應(yīng)來自于已免疫小鼠體內(nèi)B、細(xì)胞融合過程體現(xiàn)了細(xì)胞膜的選擇透過性C、融合細(xì)胞需經(jīng)過篩選培養(yǎng)和專一抗體檢測D、單克隆抗體技術(shù)可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因蛋白檢測答案：B習(xí)題鞏固2.將特定藥物與單克隆抗體相結(jié)合制成的“生物導(dǎo)彈”，能夠用于殺死人類的某些癌細(xì)胞。其過程如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是(

)A.①過程的原理和植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同B.經(jīng)①形成的雜交瘤細(xì)胞能無限增殖并產(chǎn)生單一抗體C.②過程需要篩選并克隆單個雜交瘤細(xì)胞D.抗體的靶向作用使③過程具有高度特異性答案：B習(xí)題鞏固3.圖示為人體抗胃癌單克隆抗體的制備過程。下列有關(guān)敘述錯誤的是(

)A.甲是能與人體抗胃癌抗體特異性結(jié)合的抗原B.細(xì)胞融合獲得乙的原理和植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同C.用特定選擇培養(yǎng)基對乙篩選，融合細(xì)胞均能生長，未融合細(xì)胞均不能生長D.丙需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，多次篩選后可獲得能分泌所需抗體的丁答案：C單克隆抗體制備過程中的相關(guān)考點(diǎn)總結(jié)（1）該過程中應(yīng)用到的技術(shù)_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）誘導(dǎo)融合的方法______________________________________動物細(xì)胞特有的誘導(dǎo)融合方法為_______________________動物細(xì)胞融合、動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞膜具有一定的流動性、細(xì)胞增殖用特定的抗原對小鼠進(jìn)行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法滅活病毒誘導(dǎo)法（5）第一次篩選的目的______________________

第一次如何篩選___________________________

篩選原理_________________________________________________________________________________篩選獲得雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長（6）雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)__________________________________（7）第二次篩選的目的________________________________________________如何篩選___________________________________________________選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細(xì)胞，即_____________

_____________（8）抗體檢測原理_______________________________________獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進(jìn)行多次篩選）分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體（9）如何獲取大量所需雜交瘤細(xì)胞__________________________________________（10）如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)___________________________②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)_________________________（11）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)______________________________________________________________________________在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備陽單克隆抗體制備過程中的相關(guān)考點(diǎn)總結(jié)1、抗PD-L1單克隆抗體能與癌細(xì)胞膜表面的PD-L1特異性結(jié)合，因而具有治療某些癌癥的作用。如下圖是制備抗PD-L1單克隆抗體的示意圖，下列敘述錯誤的是（

）A．提取的脾B淋巴細(xì)胞有多種，是因?yàn)橐环N病原體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種B淋巴細(xì)胞B．多孔玻璃板中的細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞和鼠瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞C．圖中細(xì)胞集落a-d既能大量繁殖，又能產(chǎn)生抗體D．圖中細(xì)胞集落a可用于擴(kuò)大化培養(yǎng)生產(chǎn)抗PD-L1單克隆抗體B試一試2、甘草酸是中藥甘草中的主要活性成分。為了快速檢測甘草酸，科研人員利用細(xì)胞工程技術(shù)制備了抗甘草酸的單克隆抗體，其基本操作過程如圖。相關(guān)敘述正確的是（）A．過程①注射相應(yīng)抗原后應(yīng)立即從小鼠脾臟中提取細(xì)胞甲B．過程②誘導(dǎo)細(xì)胞融合，利用了細(xì)胞膜的選擇透過性C．過程③、④的篩選方法相同，細(xì)胞丙、丁遺傳物質(zhì)相同D．過程⑤無論在體內(nèi)還是體外進(jìn)行，細(xì)胞丁都可大量增殖D3、下列關(guān)于單克隆抗體制備的說法，正確的是（

）A．將特定抗原注射到小鼠體內(nèi)，可以從小鼠血清中獲得單克隆抗體B．培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞必需提供動物血清C．誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后，發(fā)生融合的細(xì)胞均為雜交瘤細(xì)胞D．第二次篩選雜交瘤細(xì)胞是為了篩選出能產(chǎn)生特定抗體且遺傳穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞D第2節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)（第3課時）第2章三動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物本節(jié)聚焦1、什么是動物細(xì)胞核移植技術(shù)？2、動物體細(xì)胞核移植的基本過程是什么？3、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景有哪些？4、怎樣理性看待體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題？【情景導(dǎo)入】“（悟空）拔一把毫毛，丟在口中嚼碎，望空噴去，叫一聲‘變！’，即變作三二百個小猴，周圍攢簇（cù）?！边@是《西游記》中的一段描述，展示了中華先賢的想象力。毫毛來自體細(xì)胞，我們能用體細(xì)胞“變”出一群猴嗎？2017年，中國的科學(xué)家將這一幕變成了現(xiàn)實(shí)，他們利用體細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆出兩只獼猴“中中”和“華華”。

在這之前，科學(xué)家培育了胚胎細(xì)胞克隆猴，你知道兩者有什么不同嗎?其實(shí)，自1996年首個體細(xì)胞克隆動物多莉羊誕生以來，人類已經(jīng)成功克隆了馬、牛和豬等大型家畜，但為什么體細(xì)胞克隆猴的誕生能轟動世界呢?體細(xì)胞或者胚胎細(xì)胞胚胎細(xì)胞核移植

體細(xì)胞核移植細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性十分困難一、動物細(xì)胞核移植技術(shù)2.原理

細(xì)胞核的全能性3.類型1.概念

將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核，移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體的技術(shù)。①供體細(xì)胞的細(xì)胞核在去核卵母細(xì)胞中不能完全恢復(fù)其分化前的功能狀態(tài)，導(dǎo)致了胚胎發(fā)育率低；②是對非人靈長類動物胚胎操作的技術(shù)尚不完善。胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植難度低難度高一、動物細(xì)胞核移植技術(shù)非人靈長類動物體細(xì)胞核移植的困難原因①供體細(xì)胞的細(xì)胞核在去核卵母細(xì)胞中不能完全恢復(fù)其

前的功能狀態(tài)，這導(dǎo)致了胚胎發(fā)育率低；②對非人靈長類動物

進(jìn)行操作的技術(shù)尚不完善。胚胎分化非人靈長類具有許多與人類相似的生物學(xué)特征，研究工作中，使用量最多的是舊大陸猴,其中獼猴屬最為重要。我國首例體細(xì)胞克隆猴一、動物細(xì)胞核移植技術(shù)幾個概念供體受體一個細(xì)胞的細(xì)胞核去掉核的卵母細(xì)胞一、動物細(xì)胞核移植技術(shù)用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物。

體細(xì)胞克隆牛是如何做的？二、體細(xì)胞核移植的過程采集卵母細(xì)胞，體外培養(yǎng)至MⅡ期高產(chǎn)奶牛（供體）取體細(xì)胞培養(yǎng)將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞顯微操作去核通過電融合使細(xì)胞融合，形成重構(gòu)胚用物理或化學(xué)方法（電刺激、Ca2+載體、乙醇和蛋白酶合成抑制劑等）激活重構(gòu)胚，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程胚胎植入受體（代孕）生出遺傳性狀與供體基本一致的奶牛MⅡ期卵母細(xì)胞已發(fā)育成熟，具有受精能力，細(xì)胞質(zhì)中具有激活重構(gòu)胚以及早期胚胎發(fā)育的必需因子。也有人采用梯度離心、紫外線短時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法去核或使其中的DNA變性。將供體細(xì)胞直接注入去核卵母細(xì)胞能夠（降低去核操作可能導(dǎo)致的破壞）提高成功率，且操作簡便。

重構(gòu)胚是指人工重新構(gòu)建的胚胎，具有發(fā)育成完成個體的能力。新生個體的細(xì)胞質(zhì)基因一部分來自去核卵母細(xì)胞，一般分來自供體細(xì)胞。二、體細(xì)胞核移植的過程取卵母細(xì)胞，體外培養(yǎng)至MⅡ期供體細(xì)胞重構(gòu)胚去核卵母細(xì)胞顯微操作去核胚胎代孕電融合激活早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植分娩注入用物理或化學(xué)方法（電刺激、Ca2+載體、乙醇和蛋白酶合成抑制劑等）激活重構(gòu)胚，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程二、體細(xì)胞核移植的過程采集牛卵巢中的卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)到MⅡ期從供體高產(chǎn)奶牛取體細(xì)胞,

顯微操作去核（實(shí)際上是去除紡錘體-染色體復(fù)合物）

動物細(xì)胞培養(yǎng)將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞二、體細(xì)胞核移植的過程電融合法使兩細(xì)胞融合供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞形成重構(gòu)胚激活重構(gòu)胚使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程早期胚胎用物理或化學(xué)方法：（如電刺激、Ca2+載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑）將胚胎移入（受體）代孕母牛生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛（克隆牛）二、體細(xì)胞核移植的過程從屠宰場收集牛卵巢，在體外培養(yǎng)到MⅡ期從供體高產(chǎn)奶牛身體某一部位取體細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)通過顯微操作去核將供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞通過電融合法使兩細(xì)胞融合，供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞形成重構(gòu)胚將胚胎移入受體（代孕）母牛體內(nèi)生出犢牛（如電刺激、Ca2＋載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等）體細(xì)胞核移植的流程】用物理或化學(xué)方法激活重構(gòu)胚

目前動物細(xì)胞核移植技術(shù)中普遍使用的去核方法是顯微操作法，也有人采用梯度離心、紫外線短時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法。這些方法時在沒有穿透卵母細(xì)胞透明帶的情況下去核或使其中的DNA變性。相關(guān)信息P54思考討論討論1.將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞之前，為什么必須先對卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作？為使核移植動物的遣傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細(xì)胞。并防止細(xì)胞染色體的數(shù)量發(fā)生變化為什么要選用處于MⅡ期的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞？①細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在激發(fā)細(xì)胞核全能性表達(dá)的物質(zhì)。②細(xì)胞體積大，便于操作。③卵黃多，營養(yǎng)物質(zhì)豐富。二、體細(xì)胞核移植的過程思考討論討論2.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植技術(shù)培養(yǎng)的克隆動物是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細(xì)胞。即使遺傳物質(zhì)相同，但是動物的發(fā)育以及一些行為、習(xí)性的形成與所處的環(huán)境有很大的關(guān)系二、體細(xì)胞核移植的過程畜牧業(yè)加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育。三、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題醫(yī)藥衛(wèi)生三、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題（1）利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因克隆動物可以作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白。（2）轉(zhuǎn)基因克隆動物的細(xì)胞、組織或器官可以作為異種移植的供體。（3）以患者作為供體培育的人核移植胚胎干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化能形成相應(yīng)的細(xì)胞、組織或器官，將它們移植給患者時可以避免免疫排斥反應(yīng)?？蒲?1)研究克隆動物可使人類更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過程(2)克隆一批遺傳背景相同的動物，可以通過它們之間的對比來分析致病基因(3)克隆特定疾病模型的動物，還能為研究該疾病的致病機(jī)制和開發(fā)相應(yīng)的藥物提供幫助。三、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題保護(hù)瀕危物種種間克隆白肢野牛黑足雪貂基因該技術(shù)有望增加瀕危物種的存活數(shù)量。三、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題應(yīng)用前景畜牧生產(chǎn)醫(yī)藥衛(wèi)生科研保護(hù)瀕危物種加速家畜遺傳改良進(jìn)程、促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育①作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白②治療人類疾病時轉(zhuǎn)基因克隆動物的細(xì)胞、組織或器官可以用于異體移植③以患者作為供體培育相應(yīng)細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行移植，避免免疫排斥①使人類更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過程②分析致病基因③研究致病機(jī)制，開發(fā)藥物增加瀕危物種存活數(shù)量三、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題問題①成功率低②核移植的理論研究較為滯后③克隆動物存在健