微生物與制藥

微生物與制藥第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日藥物的抗菌試驗(yàn)

藥物的體外抗菌試驗(yàn)包括用于區(qū)別藥物是抑菌或殺菌藥物的抑菌試驗(yàn)；測(cè)定藥物殺菌活性的殺菌試驗(yàn)；以及檢查兩種藥物聯(lián)合作用的聯(lián)合抗菌試驗(yàn)等。一般抑菌藥物只能抑制微生物生長(zhǎng)，不能殺死微生物，抑菌藥物被除去，微生物又可以恢復(fù)繼續(xù)生長(zhǎng)。殺菌藥物能殺死微生物，殺菌藥物除去后，微生物仍然不能生長(zhǎng)。第二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日藥物的抑菌作用或殺菌作用是在一定條件下相對(duì)而言的。在我們檢測(cè)時(shí)，藥物的作用受到用藥時(shí)培養(yǎng)基的組成、溫度、PH值及所用的菌種、菌量等各個(gè)因素有關(guān)。雖然說(shuō)體外抗菌試驗(yàn)有很多優(yōu)點(diǎn)，但是由于體外抗菌試驗(yàn)沒(méi)有復(fù)雜的體內(nèi)因素影響，因此藥物體外抗菌試驗(yàn)和體內(nèi)抗菌試驗(yàn)可能會(huì)出現(xiàn)不一致的結(jié)果。所以，一般我們?cè)隗w外對(duì)藥物進(jìn)行測(cè)試后，有效的藥再要進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，如果體內(nèi)試驗(yàn)再次證實(shí)此藥有效的話，才能推薦應(yīng)用到臨床。第三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)藥物的體外抑菌試驗(yàn)一、藥物的體外抑菌試驗(yàn)（一）體外抑菌試驗(yàn)藥物的體外抑菌試驗(yàn)是常用抗菌試驗(yàn)方法，其中最常用的方法用系列稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

稀釋法

稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種。這兩種方法都可以用來(lái)測(cè)定藥物的最小抑菌濃度（MIC）：是指該藥物能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，通常用μg∕ml或U/ml表示。具體的液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法見(jiàn)書本，固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法，又可分為平板法和斜面法。第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日2.瓊脂擴(kuò)散法

利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的原理進(jìn)行的。一般用于細(xì)菌和酵母菌的藥敏試驗(yàn)。1.

濾紙片法（紙碟法）濾紙片法是最常用的方法，適用于新藥的初篩試驗(yàn)（初步藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試驗(yàn)（細(xì)菌藥物第三性試驗(yàn)、以便選擇用藥）。濾紙片分濕、干兩種，可以在試驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌紙片沾取藥物溶液放在含菌的平板表面，也以預(yù)先做成一定濃度的干燥紙片。一般來(lái)說(shuō)預(yù)先做成的干燥紙片實(shí)用一些而且準(zhǔn)確一些。第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日干燥紙片的制備方法：選用吸水力強(qiáng)而且質(zhì)地均勻的濾紙，用打洞機(jī)制成6mm直徑的圓紙片，120℃干燥滅菌2小時(shí)。然后把配制好的各種適宜濃度的抗生素溶液，每100張紙片加入0.5ml藥液，使它均勻浸潤(rùn)，放在無(wú)菌平皿中，37℃，使它干燥，分裝小瓶中，封口，4℃保存.一般藥敏試驗(yàn)常采用濾紙片法，我們可以根據(jù)抑菌圈的大小，來(lái)判斷菌種對(duì)藥物的敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日世界衛(wèi)生組織規(guī)定了抗菌藥物的敏感性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下根據(jù)抑菌圈大小來(lái)判斷，比如：抗生素或化療藥物抑菌圈直徑（mm）耐藥中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18紅霉素≤1314-17≥18四環(huán)素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日2.

打洞法含菌瓊脂平板上打洞,所以說(shuō)微量法適于藥物血濃度的監(jiān)測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是微量（血清用量少）敏感，操作簡(jiǎn)便。除此之外還有管碟法、直接滴加法和挖溝法：適用于測(cè)試一種藥物對(duì)幾種細(xì)菌的抗菌作用。方法是先制備普通瓊脂平板，并在平板上挖直溝，在溝內(nèi)滴加藥液，在溝側(cè)接種細(xì)菌。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后觀察加細(xì)菌生長(zhǎng)的情況。我們可以根據(jù)溝和細(xì)菌間的抑菌距離的長(zhǎng)短，來(lái)判斷該藥物對(duì)這些細(xì)菌的抗菌能力。第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日(二）、

體外殺菌試驗(yàn)殺菌試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的致死活性的。1.

最低殺菌濃度（MBC）（最小致死濃度MLC）的測(cè)定按液體培養(yǎng)基稀釋法的操作方法測(cè)了藥物的MIC。然后把未長(zhǎng)出菌的各個(gè)試管培養(yǎng)液分別移種到無(wú)菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上無(wú)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度就是最小致死濃度（MLC）。如果是細(xì)菌的話可以稱為最小殺菌濃度（MBC）。第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日2.

活菌計(jì)數(shù)法

將定量的試驗(yàn)菌加入到一定濃度的定量藥物中，作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)數(shù)，從存活的微生物數(shù)量計(jì)算出藥物對(duì)試驗(yàn)菌的致死率，從而判斷藥物的殺菌能力。活菌計(jì)數(shù)一般是將定量的藥物與試驗(yàn)菌作用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，培養(yǎng)后數(shù)平板上形成的菌落數(shù)，由于一個(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的，所以可以用菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出混合液中存活的細(xì)菌數(shù)。或者也可以用微孔濾膜過(guò)濾藥物與試驗(yàn)菌的混合液，洗凈藥液，將濾膜放在平板上培養(yǎng)后數(shù)菌落數(shù)（CFU)。第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日3.

酚系數(shù)測(cè)定（石炭酸系數(shù)測(cè)定）酚系數(shù)是以酚為標(biāo)準(zhǔn)，將待測(cè)的化學(xué)消毒劑與殺菌效力相比較，所得的就是殺菌效力的比值。苯酚系數(shù)=消毒劑的殺菌稀釋度/苯酚的殺菌稀釋度（苯酚系數(shù)大于2或等于2才合格）由于各種化學(xué)消毒劑殺菌原理各不相同，因而這種方法僅僅適用于酚類消毒劑殺菌效力的測(cè)定。具體的測(cè)定方法:是分別將酚及待測(cè)化學(xué)消毒劑按不同比例稀釋，各取5ml放到試管中，再加入經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后的菌懸液各0.5ml，混勻后放入20℃水浴中，5、10、15分鐘分別取一接種環(huán)混合液移種到另一支5ml的肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)記錄生長(zhǎng)情況。第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（三）、

聯(lián)合抗菌試驗(yàn)1、聯(lián)合抗菌試驗(yàn)主要用于測(cè)定兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互影響。①無(wú)關(guān)作用小，兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨(dú)活性；②拮抗作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨(dú)抗菌活性；③累加作用，兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)的活性等于兩種單獨(dú)抗菌活性之和；④協(xié)同作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨(dú)作用的總和。第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日常用方法

1.

棋盤格法

棋盤稀釋法是常用的定量方法，首先分別測(cè)定擬聯(lián)合的抗菌藥物對(duì)檢測(cè)菌的MIC。藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計(jì)算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)0．5為協(xié)同作用；0．5－1為相加作用；1～2為無(wú)關(guān)作用；＞2為拮抗作用。

第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日[棋盤法的設(shè)計(jì)]棋盤法的主要優(yōu)點(diǎn)在于甲、乙兩藥的每個(gè)藥物濃度都有單獨(dú)的和與另一個(gè)藥物不同濃度的聯(lián)合，因此能精確測(cè)定兩種抗菌藥物在適當(dāng)濃度的比例下所產(chǎn)生的相互作用。在進(jìn)行棋盤法之前應(yīng)先測(cè)定兩種抗菌藥物單獨(dú)對(duì)受試菌的MIC，然后以兩藥MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8濃度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4濃度）分別進(jìn)行聯(lián)合?？梢?jiàn)舉例，如表—1的青霉素G與鏈霉素聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)和表2的TMP+SMZ的聯(lián)合作用。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日藥物及濃度青霉素G(IU／m1)鏈霉素單藥對(duì)照4210.50.25鏈霉素（μg／ml）64------32------16------8---+++4---+++青霉素G單藥對(duì)照---++細(xì)菌對(duì)照-：無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)+：有細(xì)菌生長(zhǎng)FIC指數(shù)=1／1+16／16=2——無(wú)關(guān)第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

2.紙條試驗(yàn)

在含菌平板上垂直放兩條浸有不同藥液的濾紙條，培養(yǎng)后觀察兩藥形成的抑菌區(qū)的圖形來(lái)判斷兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，是無(wú)關(guān)、協(xié)同還是拮抗作用。

第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日3.

紙條梯度平板試驗(yàn)

將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培養(yǎng)基。將平皿放平加入含抗菌藥物的瓊脂培養(yǎng)基，這樣在制成的雙層瓊脂平板中含有梯度濃度的抗菌藥物。要求其最小抑菌濃度的位置約處于平板的一半。然后將試驗(yàn)菌液均勻涂布在平板表面。取紙條浸透另一待檢藥液，按梯度中藥物濃度遞減的方向置于平板表面，培養(yǎng)后觀察形成的抑菌區(qū)的圖形以判斷兩種藥物之間的相互作用。第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日意義目的在于：①治療混合性感染；②預(yù)防或推遲細(xì)菌抗生素耐藥性的發(fā)生；③聯(lián)合用藥可以減少劑量以避免達(dá)到毒性劑量；④聯(lián)合用藥比單一用藥時(shí)效果更好。第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日二、藥物的體內(nèi)抗菌試驗(yàn)

藥物的體內(nèi)抗菌試驗(yàn)又稱為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)治療試驗(yàn)或保護(hù)力試驗(yàn)。當(dāng)抗菌藥物進(jìn)入機(jī)體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、膿汁內(nèi)的核酸均與藥物結(jié)合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機(jī)體內(nèi)的微生物，代謝活動(dòng)較低，對(duì)藥物的敏感性降低，有時(shí)還可形成細(xì)胞壁缺陷型細(xì)菌，對(duì)某些藥物不敏感。機(jī)體內(nèi)各組織中藥物的吸收，分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在評(píng)定新藥的藥效時(shí)除做體外抗菌試驗(yàn)外還需要做體內(nèi)的抗菌試驗(yàn)。

第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日三、影響抗菌試驗(yàn)的因素

1.

菌種在抗菌試驗(yàn)中所用到的菌種，必需是國(guó)家衛(wèi)生部生物制品檢定所菌各保藏中心專門提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株。在特殊情況下，也可以采用臨床新分離的并經(jīng)過(guò)鑒定、純化及合理保藏的菌株。而且我們要用到的試驗(yàn)菌種應(yīng)該選擇是對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)菌。因?yàn)槟菚r(shí)菌種生命力最旺盛，這對(duì)于我試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果也會(huì)準(zhǔn)確些。第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日1.

培養(yǎng)基試驗(yàn)所用到的培養(yǎng)基應(yīng)按各試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)要求進(jìn)行配制，嚴(yán)格控制各種原料、成分的質(zhì)量及培養(yǎng)基的配制過(guò)程。要注意當(dāng)有些藥物具有抗代謝作用時(shí)，培養(yǎng)應(yīng)不能存在代謝物，否則抑菌作用將會(huì)被消除。培養(yǎng)基內(nèi)如果含有血清等蛋白質(zhì)時(shí)，有可能與某些抗菌藥物結(jié)合，使抗菌藥物失去，所以就要避免培養(yǎng)基混進(jìn)這類營(yíng)養(yǎng)物。第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日3.

抗菌藥物藥物的物理狀態(tài)、濃度、稀釋方法等都會(huì)直接影響抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，必需精確配制。如果是固體藥物，必需使藥物溶解或使藥物呈均勻懸液。PH值應(yīng)調(diào)至中性，以確保藥物的穩(wěn)定性和不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。中草藥因?yàn)橛蓄伾秃绪焚|(zhì)，結(jié)果的判斷，應(yīng)特別注意。第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日4.

對(duì)照試驗(yàn)為確保試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行各種對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)菌對(duì)照：在無(wú)藥情況下，應(yīng)能在培養(yǎng)基內(nèi)正常生長(zhǎng)。溶劑及稀釋液對(duì)照：配制抗菌藥物時(shí)所用的溶劑及稀釋液均應(yīng)無(wú)抗菌作用。已知藥物對(duì)照：應(yīng)使已知抗菌藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)抗菌效應(yīng)。

第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日復(fù)習(xí)題：1.

藥物體外抑菌試驗(yàn)常用的方法有哪幾種？具體的試驗(yàn)操作方法？

2.

如何測(cè)定藥物的最小致死濃度？

3.

聯(lián)合抗菌試驗(yàn)常用的方法有哪些？

4.

藥物體內(nèi)抗菌試驗(yàn)的方法？

5.

抗菌試驗(yàn)的影響因素有哪些？第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的實(shí)驗(yàn)（藥敏片擴(kuò)散法）目的意義：

掌握藥敏片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的一般方法體會(huì)藥敏實(shí)驗(yàn)在臨床用藥上的指導(dǎo)意義基本原理：

藥敏片是含有抗生素的濾紙片，將其置于涂滿待測(cè)菌的固體培養(yǎng)基上，抗菌藥物通過(guò)向培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)。根據(jù)抑菌環(huán)的大小可以判定細(xì)胞對(duì)此藥物的敏感度。第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日器材及試劑:藥敏片：含各種抗生素的市售產(chǎn)品培養(yǎng)基平板：普通牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待檢細(xì)菌的培養(yǎng)物。眼科鑷、無(wú)菌棉拭子、酒精燈等。第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟:1、用無(wú)菌棉拭