微生物工程實驗

微生物工程實驗第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日發(fā)酵工程實驗室規(guī)則實驗室內(nèi)嚴禁飲食吸煙。進入實驗室需穿實驗服。實驗前將桌面清理趕緊，非必要之用品放入抽屜中，必需用的書籍和文具等也應放置在非操作區(qū)，以免污染。坐在實驗椅上操作實驗，勿隨意走動或奔跑。實驗進行之前應確實了解其目的以及進行步驟，才能獨立操作并于實驗結(jié)束后分析結(jié)果。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日認真進行各項實驗，嚴格掌握無菌技術(shù)。各個實驗用品按指定地點存放。實驗中發(fā)生差錯或意外事故時，應立即報告老師及時處理。切勿隱瞞或自作主張不按規(guī)定處理，如萬一發(fā)生有菌材料污染桌面、衣物等，應立即用抹布浸沾2～3%來蘇（或5%石炭酸液），泡在污染部位，經(jīng)半小時后方可抹去。如手上沾有活菌也用上述消毒液浸泡10分鐘左右，再以肥皂及自來水反復洗凈。要愛護室內(nèi)儀器設(shè)備，按使用規(guī)則操作，并應節(jié)約使用實驗材料。如不慎損壞了器材等，應報告教師。第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日做好實驗記錄，寫好實驗報告。關(guān)于實驗材料：培養(yǎng)基、培養(yǎng)液接種前均應清楚標示日期、組別、菌名及姓名。實驗結(jié)束后，使用過的儀器、設(shè)備、器皿一律物歸原處，每組小組長負責清理工作。值日生由各組同學輪流擔任，負責實驗結(jié)束后的整理、清洗及打掃工作，另外離開實驗室后要負責水、電、門、窗的安全。每次使用發(fā)酵罐及實驗過程中換人時，必須填寫好發(fā)酵罐使用記錄本。實驗過程當中，一臺發(fā)酵罐必須要有至少一人看守。第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日考核方式（1）實驗報告：要求報告內(nèi)容包括：題目、目的、原理、操作步驟、實驗結(jié)果及討論。（2）考核方式：平時成績（實驗預習、考勤、紀律、實驗儀器的組裝和使用能力，實驗的技能技巧，實驗態(tài)度以及安全、衛(wèi)生和藥品的節(jié)約等）占40%；實驗報告占60%。第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗安排液態(tài)發(fā)酵——酵母菌的上罐發(fā)酵菌種的擴培發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)和滅菌單因素實驗的設(shè)計與取樣單因素實驗比較及生長曲線的測定固態(tài)發(fā)酵——葡萄酒的釀制及菌種的分離第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗一.固體發(fā)酵——葡萄酒的釀制及菌種的分離實驗目的了解酵母菌作用下制成葡萄酒的過程。熟悉葡萄酒的制作方法。學習從發(fā)酵液中分離酵母菌。實驗原理酵母菌在厭氧的狀態(tài)下可把糖分解為酒精和二氧化碳。葡萄酒就是在酵母菌的作用下釀制而成。第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗藥品及器材葡萄；白砂糖；發(fā)酵器皿；保鮮膜等實驗步驟清洗：用水整串淋洗，用洗凈的手將葡萄盡量撕揉碎，連皮、籽一起裝罐。。入罐：粉碎后的葡萄果液可裝入清潔最好消毒后的干燥陶瓷、玻璃、無毒塑料容器進行前發(fā)酵。（容器要稍大，以保證裝葡萄果液后有30%的空間，因為劇烈發(fā)酵時會產(chǎn)生氣泡，會將葡萄皮往上翻涌，裝得太滿會溢出容器）加白糖量：每斤葡萄汁要加40-60克白糖（糖加少了，影響發(fā)酵和酒精度；加多了，成本高。而且糖濃度太大，會使單細胞酵母的細胞壁滲透壓過大，影響生長）。加糖一般分二次加入。第一次在裝入葡萄后24小時，加入一半，3-4天后視發(fā)酵情況再加剩余的一半。第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日前發(fā)酵：裝瓶罐后，先在25-28度環(huán)境里放置24小時，不要加糖。前發(fā)酵時容器不能密封，酵母繁殖需要氧氣，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生的二氧化碳需要排除，還要將上浮的果皮按入果液中進行攪拌，又要分次加糖攪拌等一系列的操作，都需要開蓋才行。經(jīng)過一周左右發(fā)酵，把糖消耗完畢后自然停止發(fā)酵，果皮不再浮上來，即達到止發(fā)酵點。6-7天后應把皮、籽過濾取出。后發(fā)酵：一般前發(fā)酵7天后，將果汁內(nèi)的皮、籽用篩網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)布過濾取出，用濾紙再過濾一次，裝入清潔容器密封進行后發(fā)酵20-30天。此時容器最好不留空隙，切斷氧氣，防止細菌侵入。也可在液面上加些食用酒精，酒精比重比葡萄酒小，浮在表面形成保護層隔斷氧氣。同時要避光，防止酒色氧化變淺，所以，容器不能用透明的瓶。后發(fā)酵時用軟木塞密封裝瓶第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日30天后啟封，可以發(fā)現(xiàn)酒液變澄清，底部有一層沉淀，這是酵母完成歷史使命后的“尸體”及雜質(zhì)。上層的清純酒液同樣用虹吸或過濾的方法再提純一次。用不透光的酒瓶灌裝，然后密封，存放溫度最好在12度，酒瓶橫躺或略微瓶口向下傾斜存放，可保存二年左右。酒精度的測定：對第7天，第30天的葡萄酒液測酒精度用4層紗布過濾發(fā)酵液.量取過濾液100ml于蒸餾瓶中，另加入50ml蒸餾水，加入數(shù)粒玻璃珠防止暴沸，裝上冷凝管，加熱蒸餾，直至餾出液體積約為95ml時，停止蒸餾。用蒸餾水定容至100ml，用酒精計測量，按測得的實際溫度和酒精計示值查附表2，換算成20℃時的酒精度。實驗結(jié)果及討論從色、香、味以及所測得的酒精度等方面對所釀制的葡萄酒進行評價從葡萄酒中分離野生型酵母菌第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日取成熟前15天的紫皮中等顆粒的葡萄750克，挑出爛葡萄；摘除蒂，用洗凈的手充分捏碎葡萄；裝入清潔的非金屬容器加蓋，在20-25度環(huán)境中放置24小時；加入30-40克白糖，用木筷拌勻，并把葡萄皮按入果液中；發(fā)酵3-4天后再加入30-40克白糖拌勻，并把浮起的葡萄皮按入果液中；7天后發(fā)酵停止，用非金屬篩網(wǎng)布和濾紙、細布過濾去掉葡萄皮及籽；靜止12小時，用乳膠管虹吸出清純酒液（或用濾紙、細布過濾）后裝瓶密封；30天后，再過濾一次裝瓶密封、避光、低溫、平躺保存。第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日酒精度的測定：對第7天，第30天的葡萄酒液測酒精度用4層紗布過濾發(fā)酵液.量取過濾液100ml于蒸餾瓶中，另加入50ml蒸餾水，加入數(shù)粒玻璃珠防止暴沸，裝上冷凝管，加熱蒸餾，直至餾出液體積約為95ml時，停止蒸餾。用蒸餾水定容至100ml，用酒精計測量，按測得的實際溫度和酒精計示值查附表2，換算成20℃時的酒精度。查閱相關(guān)資料，設(shè)計實驗從葡萄酒中分離野生型酵母菌實驗結(jié)果及討論從色、香、味以及所測得的酒精度等方面對所釀制的葡萄酒進行評價對分離所得的野生型酵母進行描述第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗二、菌種的擴培實驗目的：熟練掌握無菌操作技術(shù)了解生物發(fā)酵過程中種子的擴培過程

實驗原理：500ml500L10L擴培過程第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗器材實驗儀器搖床1臺；超凈工作臺6臺；電爐6個；玻璃棒12個；50ml量筒6個；500ml量筒6個；100ml燒杯6個；500ml燒杯6個；250ml三角燒瓶12個；500ml三角燒瓶30個；接種環(huán)6個；酒精燈6個；棉線、紗布、報紙若干；天平6個藥品蛋白胨、葡萄糖NH4Cl、蒸餾水菌種酵母菌斜面6支種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g葡萄糖40g，蒸餾水1000ml，pH自然，115℃，20min第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗步驟斜面的活化：PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面。接酵母于斜面中，28℃，48h種子的培養(yǎng)種子培養(yǎng)液的配置500ml，取部分種子液于2個250ml錐形瓶，每個錐形瓶裝50ml（作一級種子瓶），余下種子液分裝于四個500ml錐形瓶中，每個錐形瓶裝100ml（作二級種子瓶），115℃，20min滅菌。用接種環(huán)挑取斜面2環(huán)轉(zhuǎn)接于一級種子液中，150rpm，28℃，48h。取一級種子液，無菌操作將種子液混合均勻以后，用移液槍以10%的接種量接種于二級種子液中，150rpm，28℃，48h。準備一瓶無菌蒸餾水500ml，滅菌，待用。第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗步驟通過按照給定的研究題目，獨立查閱相關(guān)資料，設(shè)計實驗方案，并對實驗所需的各種藥品、玻璃儀器及分析設(shè)備列出清單，寫出詳盡的試驗過程及需要。各組獨立的進行試驗，并觀察試驗中的各種現(xiàn)象，分析總結(jié)實驗得出的各種數(shù)據(jù)并撰寫相應的研究及實驗報告等各過程第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗三、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與滅菌

實驗四、單因素實驗的設(shè)計與取樣

實驗目的：掌握小型發(fā)酵罐管路消毒、空消、實消、菌種培養(yǎng)等技術(shù)。學習掌握小型發(fā)酵罐接種、取樣操作系統(tǒng)。實驗原理：發(fā)酵罐是進行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動的調(diào)控實驗所需的培養(yǎng)條件，是微生物學、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等學科研究所必需的設(shè)備。第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日小型發(fā)酵罐：它主要有6部分組成。罐體、攪拌系統(tǒng)、傳熱裝置、通氣系統(tǒng)、消泡系統(tǒng)和各種參數(shù)檢測器．離位發(fā)酵罐和在位發(fā)酵罐

第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗器材高壓蒸汽滅菌鍋3臺；在位機械攪拌式發(fā)酵罐3臺；離位機械攪拌式發(fā)酵罐3臺菌種：E.coli種子液；無菌蒸餾水；泡敵鐵架臺6個；試管架6個；三角燒瓶；小試管；酒精棉球若干；工業(yè)用酒精一瓶棉線手套6雙；接種用的大試管60支；第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗步驟在位發(fā)酵罐滅菌空氣過濾器及管路的消毒：蒸汽經(jīng)空氣過濾器及以后的空氣管道進入發(fā)酵罐內(nèi)。壓力保持在0.10～0.11MPa之間。（注：壓力不得超過0.12MPa，否則過濾器芯會損壞）。消毒時間為30min。到時間后，關(guān)閉蒸汽閥。將空氣經(jīng)流量計進入空氣過濾器（0.4VVM），吹干20min?？障号疟M蒸汽管中的冷凝水，使蒸汽從罐底緩慢進入發(fā)酵罐（微開）。打開上部蒸汽閥，使蒸汽通過進氣管進入發(fā)酵罐；對發(fā)酵罐進行空消。在滅菌過程中，應時刻注意罐壓，并控制在0.11～0.12MPa之內(nèi)，空消時間為30～50min。當溫度降至80℃以下時，才能排盡發(fā)酵罐內(nèi)的冷凝水，隨即關(guān)閉冷凝水閥。調(diào)節(jié)進氣管和排氣口，使罐壓保持在0.03～0.05MPa之間。第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日加培養(yǎng)基液：打開發(fā)酵罐的排氣閥，調(diào)小進氣閥得開度，卸去罐內(nèi)壓力；按要求各組配制不同的發(fā)酵培養(yǎng)基2.5L，加入培養(yǎng)基。加消泡劑1.5ml（0.03~0.035%）。擰緊加料口螺母。實消（必須將安全防護罩裝上）排盡加熱管的冷凝水，通入蒸汽，加熱培養(yǎng)基，同時開通電源，開啟攪拌電機，調(diào)節(jié)電機轉(zhuǎn)速至150rpm左右，進行慢速攪拌。當發(fā)酵罐內(nèi)溫度達到85℃后，打開蒸汽閥門，將蒸汽徐徐進入發(fā)酵罐，繼續(xù)升溫。當溫度達到95～100℃后，停止攪拌，并將排氣閥微開。調(diào)節(jié)底部及上部的蒸汽閥及排氣閥，使壓力保持在0.1～0.11MPa之間，嚴禁超壓。（罐壓不得超過0.12MPa，防止引起設(shè)備的損壞）。實消時間一般為20min。到時間后，關(guān)閉所有的閥門,自然冷卻10min左右。第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日關(guān)閉加熱管蒸汽閥，通冷卻水打開電磁閥，按冷卻鍵至“自動”狀態(tài)。當溫度降至發(fā)酵８0℃后，慢速（150rpm）開啟攪拌機，加速降溫。當蒸汽閥門關(guān)閉以及通冷卻水后，發(fā)酵罐的罐壓將迅速下降，當罐內(nèi)壓力降至0.03MPa時，必須間隙開氣進氣閥，讓空氣進入發(fā)酵罐內(nèi)，并保持壓力在0.03~0.05MPa之間，溫度控制在28℃?！臃椒ǎ捍蜷_排氣閥，用蒸汽消毒20～30min。關(guān)閉蒸汽閥，放出少量料液。關(guān)閉閥門，再用蒸汽消毒。第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日離位發(fā)酵罐的滅菌實消關(guān)閉電源開關(guān)，旋下電機接頭、溫度傳感器接頭、泡沫傳感器接頭、加熱器接頭、pH接頭、DO接頭；向上取出電機，并妥善放置；取出溫度傳感器、加熱器、pH電極、DO電極。

將2.5L培養(yǎng)液從接種口倒入發(fā)酵罐內(nèi)，蓋上接種口螺帽。將所有閥門擰緊，補料口用硅膠管兩兩連上，保持密封。

進氣口與空氣過濾器之間用膠管夾夾住，以防在實消時發(fā)酵液倒流至空氣過濾器中，造成過濾器失效。取樣口、進氣口及空氣通道必須用夾子加緊。將發(fā)酵罐（連支架）平穩(wěn)的端起，并放入立式滅菌鍋內(nèi)。開啟滅菌鍋進行滅菌，115℃，滅菌25分鐘。

第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日注：滅菌時間到后，不要手動排高壓蒸汽鍋內(nèi)的蒸汽，必須是高壓滅菌鍋內(nèi)的壓力慢慢降下來。如果手動排高壓滅菌鍋內(nèi)的正氣，則發(fā)酵罐內(nèi)的物料會因快速沸騰，造成料液溢出發(fā)酵罐；而且，還可能引發(fā)酵罐內(nèi)的壓力比高壓滅菌鍋內(nèi)的壓力高很多，造成發(fā)酵罐的破裂。

冷卻：實消結(jié)束后，待發(fā)酵罐在滅菌鍋內(nèi)自然冷卻20min且溫度小于80℃后取出。將電極按原位安裝于發(fā)酵罐頂部，并聯(lián)接妥電機線。通入空氣；正確連接冷卻水進、出管道。打開電源開關(guān)，調(diào)整轉(zhuǎn)速、溫度設(shè)定值（建議：轉(zhuǎn)速：150rpm；溫度：培養(yǎng)溫度）第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日※取樣方法：打開取樣口的膠管夾即可取出樣液。取樣后，打開取樣管空氣，將取出管中殘留的發(fā)酵液吹出，用膠管夾將取樣口封閉；然后封閉進入取樣管的空氣管。注意：必須輕拿輕放，以免引起玻璃筒損