微生物發(fā)酵制藥

微生物發(fā)酵制藥第一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日2第一節(jié)概述第二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日3發(fā)酵：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程微生物發(fā)酵制藥：利用微生物技術(shù)，通過高度工程化的新型綜合技術(shù)，以利用微生物反應(yīng)過程為基礎(chǔ)，依賴于微生物機(jī)體在反應(yīng)器內(nèi)的生長繁殖及代謝過程來合成一定產(chǎn)物，通過分離純化進(jìn)行提取精制，并最終制劑成型來實(shí)現(xiàn)藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)一、發(fā)酵第三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日發(fā)酵工程的4個階段第一階段1676年制成第一臺顯微鏡——微生物的存在1857年巴斯德證明了酒精是由活的酵母發(fā)酵引起的1897年畢希納發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形成酒精——酶第四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日第二階段對發(fā)酵技術(shù)的認(rèn)識起始于19世紀(jì)末，主要來自于厭氧發(fā)酵，如利用酵母菌、乳酸菌生產(chǎn)酒精、乳酸和各種發(fā)酵食品。第五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日第三階段20世紀(jì)40年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素迅速工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。深層培養(yǎng)、生產(chǎn)大規(guī)?；?、多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功。第六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日7發(fā)酵罐發(fā)酵第七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日8立式臥式搖床發(fā)酵第八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日9靜置發(fā)酵第九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日10二、第十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日初級代謝產(chǎn)物：與菌體生長相伴隨的產(chǎn)物、對菌體生長、分化和繁殖是必須的氨基酸、核苷酸、維生素、糖類等菌體對其合成反饋控制嚴(yán)密，一般不過量積累次級代謝產(chǎn)物：與菌體生長不相伴隨，以初級代謝的中間產(chǎn)物為原料而合成抗生素、生物堿、毒素、色素、胞外多糖等結(jié)構(gòu)常較復(fù)雜對環(huán)境條件敏感第十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日三、常見的制藥用微生物細(xì)菌放線菌真菌第十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之大腸桿菌屬(Escherichiacoli)生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等氨基酸類藥物基因工程的載體第十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之短桿菌屬(Brevibacterium)維生素B12、氨基酸、核苷酸類藥物生產(chǎn)中常用的菌種，也是酶法合成生產(chǎn)輔酶A的菌種。第十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)生產(chǎn)氨基酸、核苷酸類藥物，用于甾體轉(zhuǎn)化是谷氨酸和其他氨基酸的高產(chǎn)菌，如北京棒桿菌AS1.299鈍齒棒桿菌AS1.542第十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之芽孢桿菌屬(Bacillus)生產(chǎn)氨基酸、核苷酸、抗生素類、維生素B12、用于甾體轉(zhuǎn)化等。第十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之假單胞菌屬(Pseudomonas)生產(chǎn)維生素B12、氨基酸、核苷酸類；進(jìn)行類固醇（甾體）轉(zhuǎn)化；有些菌株可利用烴類生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。第十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌之乳酸桿菌屬(Lactobacillus)生產(chǎn)抗癌類藥物第十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日放線菌抗生素12000余種，60%左右來自放線菌，經(jīng)濟(jì)價值大。第十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日放線菌之鏈霉菌屬(Streptomyces)灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)產(chǎn)鏈霉素金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)產(chǎn)金霉素紅霉素鏈霉菌(Streptomyceserythreus)產(chǎn)紅霉素龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)產(chǎn)土霉素第二十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日放線菌之諾卡氏菌屬(Norcadia)生產(chǎn)利福霉素、蚊霉素等第二十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日放線菌之小單胞菌屬(Micromonospora)多種可產(chǎn)抗生素，如棘孢小單胞菌(M.echinospora)產(chǎn)慶大霉素。第二十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日放線菌之游動放線菌屬（Actinoplanes）典型代表：濟(jì)南游動放線菌(Actinoplanestsinanesisn)產(chǎn)創(chuàng)新霉素(creatmycin；1964)第二十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之根霉屬(Rhizopus)生產(chǎn)甾體激素、延胡索酸及酶制劑等。第二十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之曲霉屬(Aspergillus)生產(chǎn)枸櫞酸、葡萄糖酸、有機(jī)酸類、抗生素，進(jìn)行甾體轉(zhuǎn)化。第二十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之青霉屬(Penicillum)產(chǎn)黃青霉(Penicillumchrysogenum)生產(chǎn)青霉素，也可用來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、檸檬酸和抗壞血酸第二十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之頭孢霉菌屬(Cephalosporium)產(chǎn)黃頭孢霉(Cephalosporiumchrysogen)、頂孢頭孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)都生產(chǎn)頭孢菌素C第二十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之酵母菌屬(Saccharomyces)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：生產(chǎn)啤酒、酒精、藥用酵母等；核酸、麥角固醇、細(xì)胞色素C、凝血質(zhì)和輔酶A等。紅酵母(Rhodotorula)：β-胡蘿卜素棉病針孢酵母(Nematsporagossypii)：核黃素第二十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日真菌之其它牛肝菌屬：含有人體必需的8種氨基酸，還含有腺膘呤、膽堿和腐胺等生物堿。靈芝屬：靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、甾類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機(jī)酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。第二十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日30菌株選育、發(fā)酵和分離純化或提煉是發(fā)酵制藥的三個主要工段。四、發(fā)酵制藥的基本過程第三十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日31發(fā)酵制藥流程第三十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日32發(fā)酵制藥工藝第三十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日33菌體生長與產(chǎn)物合成的三個階段：發(fā)酵前期（fermentationprophase)菌體生長期（cellgrowthphase)發(fā)酵中期(fermentationmetphase)產(chǎn)物合成期（productsynthesisphase)發(fā)酵后期（fermentationanahase）菌體自溶期（cellautolysisphase)五、微生物發(fā)酵基本過程特征第三十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日34從接種至菌體達(dá)到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降－以氨基酸為碳源，釋放氨，后氨被利用。先降后升－以糖為碳源，釋放出丙酮酸等有機(jī)酸，后被利用。發(fā)酵前期特征第三十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日35以次級代謝產(chǎn)物或目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進(jìn)入產(chǎn)物合成階段。呼吸強(qiáng)度：無明顯變化，菌體數(shù)目不增加。產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，至最高峰后合成能力衰退。對外界變化敏感:容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵過程。發(fā)酵中期特征第三十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日36菌體衰老，細(xì)胞開始自溶的一段時間合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢氨基氮含量增加，pH上升發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞，菌體自溶給過濾和提取帶來困難發(fā)酵后期特征第三十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日37第二節(jié)制藥微生物與產(chǎn)物的生物合成制藥微生物的選擇制藥微生物的選育微生物菌種的保藏微生物代謝產(chǎn)物的生物合成微生物生物合成的調(diào)節(jié)第三十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日38（1）所需培養(yǎng)基易得，價格低廉；（2）培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和（糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等）（3）生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短（4）單產(chǎn)高（5）抗病毒能力強(qiáng)（6）菌種純粹，不易變異退化，穩(wěn)定性好（7）菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保證安全一、制藥微生物的選擇第三十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日39來源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：表層土壤(0-10cm)，海洋（0-100m）預(yù)處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性1）溫度2）化學(xué)：SDS－酵母膏，CaCO3，NaOH處理，減少細(xì)菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。3）離心、膜分離。生產(chǎn)菌的自然分離第三十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日40培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基，營養(yǎng)和pH，添加抑制劑如抗生素，制霉菌素等。分離方法：1）稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖溶液2）濾膜法：0.22－0.45um。細(xì)菌在膜上，放線菌菌絲可穿透，進(jìn)入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：放線菌25-30℃，32-37℃，45-50℃，7-14天至1月。第四十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日41二、制藥微生物菌種的選育1、選育的目的改善菌種的特性，使產(chǎn)量提高，改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等2、選育的方法：A、自然選育；B、誘變育種C、雜交育種第四十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日42定義：不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過程。自然選育第四十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日43菌種分離純化1。稀釋涂布2。平板劃線純化第四十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日44斜面?zhèn)鞔谒氖捻?，共一百三十九頁?022年，8月28日45防止菌株衰退的措施菌種退化：菌種的發(fā)酵能力降低、繁殖能力降低、發(fā)酵產(chǎn)品的得率降低.1、衰退的可能原因（1）、基因突變（2）、分離現(xiàn)象2、防止菌種衰退的方法

A、從菌種選育方面考慮；B、盡量減少傳代次數(shù)C、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；D、利用不易衰退的細(xì)胞傳代;E、采用有效的菌種保藏方法第四十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日46原因：菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：根據(jù)菌種的生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。關(guān)鍵：保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以達(dá)到降低其代謝活動，延長保存期的目的。三、微生物菌種的保藏第四十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日47菌種保藏的方法斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍干燥法、冷凍法、液態(tài)真空干燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。第四十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日48（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定時間進(jìn)行移植培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏，如此反復(fù)。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、存活率高，具有一定的保藏效果。缺點(diǎn)：菌種仍有一定的強(qiáng)度的代謝活動條件，保存時間不長（1－6個月），傳代多，菌種容易變異。適用菌種：細(xì)菌、酵母、防線菌、霉菌第四十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日49（2）礦物油保藏法將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。適用菌種：適用于除細(xì)菌外的其它菌種（3）砂土管保藏法利用土壤顆粒對微生物起保護(hù)作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。適用菌種：產(chǎn)孢子的微生物，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌（奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌）以及酵母不適用。第四十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日50

（4）真空冷凍干燥法先在菌懸液加入保護(hù)劑（如：脫脂牛奶、血清等）然后在較低溫度下使成凍結(jié)狀態(tài)，最后減壓抽干。特點(diǎn)：它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達(dá)一年至數(shù)十年之久，并且存活率高，變異率低。但是手續(xù)麻煩，需要一定的設(shè)備。適用菌種：對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。第五十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日51（5）其他保藏方法冷凍法：分低溫冷凍（－20℃）與超低溫冷凍（－196℃）兩種。適用于細(xì)菌、真菌、病毒等的保藏液態(tài)真空干燥法：菌體在恒溫液態(tài)條件下進(jìn)行真空干燥。適用于包括細(xì)菌、病毒，特別適用于冷凍干燥保藏效果不佳的菌種。瓊脂穿刺封口保藏法：適用于不產(chǎn)孢子細(xì)菌的保藏第五十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日52曲法保藏：將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的干燥器中，干燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。麥粒保藏法：麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時，置通風(fēng)、避光、干燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。無水硅膠保藏法：將細(xì)胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，加入裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于干燥器內(nèi)，室溫或4℃保藏。對于細(xì)菌和真菌效果都較好。第五十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日53國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機(jī)構(gòu)，其中國際知識產(chǎn)權(quán)組織承認(rèn)的法定的保藏機(jī)構(gòu)僅有28家。第五十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日54

1、我國的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1）普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武漢病毒研究所2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院，北京，（IFFI）4）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所5）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院抗生素研究所，北京四川抗生素工業(yè)研究所，成都華北制藥廠抗生素研究所，石家莊6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京第五十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日552、國外主要的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1）美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）2）美國冷泉港研究所（CSH）3）日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）4）日本東京科研化學(xué)有限公司（KCC）5）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）6）英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）7）美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）8）美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（NRRL）第五十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日56第三節(jié)發(fā)酵工藝條件的確定培養(yǎng)基及其制備滅菌操作發(fā)酵工藝條件的確定及主要控制參數(shù)第五十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日57培養(yǎng)基（medium)：供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同。

細(xì)菌：

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB

(Luria-Bertani)

放線菌：高氏一號培養(yǎng)基

真菌：

查氏合成培養(yǎng)基、PDA(Potato-Dextrose-Agar)

酵母菌；

麥芽汁培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。一培養(yǎng)基第五十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日58碳源氮源無機(jī)鹽水生長因子前體與促進(jìn)劑消泡劑培養(yǎng)基的成分第五十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日59概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物合成提供碳骨架。碳源第五十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日60糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油、豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機(jī)酸遲效碳源:酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸碳源的種類第六十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日61概念：構(gòu)成微生物和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)作用:為生長和代謝提供氮源種類：無機(jī)氮源、有機(jī)氮源氮源第六十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日62幾乎所有微生物都能利用有機(jī)氮源黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素有機(jī)氮源第六十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日63氨水、銨鹽和硝酸鹽等。銨鹽比硝酸鹽更快利用。工業(yè)應(yīng)用：主要氮源和輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)，如（NH4)2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。如NaNO3利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。無機(jī)氮源第六十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日64概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用的礦物質(zhì)。作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用種類：P、S、K、Na、Mg、Ca常常添加Fe、Zn、Cu、Mo、Co、Mn、Cl，一般不加無機(jī)鹽與微量元素第六十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日65水菌體細(xì)胞的主要成分營養(yǎng)傳遞的介質(zhì)良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長環(huán)境溫度培養(yǎng)基的主要成分。第六十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日66概念：維持微生物生長所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。生長因子（growthfactor）第六十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日67概念：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化。使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施多次少量添加前體（precurtsor）第六十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日68概念：促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。促進(jìn)劑（accelerant）第六十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日69概念：降低泡沫的液膜強(qiáng)度和表面粘度，使泡沫破裂的化合物。種類：油脂類、酯類、硅油及聚氧乙烯－聚氧丙烯甘油醚。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消沫劑(defoamingagent)第六十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日70按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì):固體、半固體、液體培養(yǎng)基按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種類第七十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日71概念：細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉素和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。制備：液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0％瓊脂粉。作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子固體培養(yǎng)基第七十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日72單細(xì)胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。固體培養(yǎng)基－要求第七十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日73概念：供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基，液體。作用：使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子種子培養(yǎng)基（seedmedium）第七十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日74培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。用速效性、容易利用的碳、氮源和無機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大?？s短發(fā)酵的延滯期。種子培養(yǎng)基－要求第七十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日75概念：提供微生物生長、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的要求：營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中，組成上豐富完整。不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基（fermentationmedium)第七十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日76概念：發(fā)酵過程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。組成：各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基補(bǔ)料培養(yǎng)基第七十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日77控制發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量第七十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日78第七十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日79第七十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日80第八十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日81培養(yǎng)基設(shè)計一般原則第八十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日82二、滅菌操作工藝第八十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日83由于各種發(fā)酵過程所用的微生物菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵的條件、產(chǎn)物的性質(zhì)不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是對于哪種發(fā)酵過程，一旦發(fā)生染菌，都會由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被消耗或代謝產(chǎn)物被分解，嚴(yán)重影響到產(chǎn)物的生成，使發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量大為降低。一）、染菌對不同發(fā)酵過程的影響第八十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日841）青霉素發(fā)酵過程：由于許多雜菌都能產(chǎn)生青霉素酶，因此不管染菌是發(fā)生在發(fā)酵前期、中期或后期，都會使青霉素迅速分解破壞，使目的產(chǎn)物得率降低，危害十分嚴(yán)重。2）核苷或核苷酸發(fā)酵過程：由于所用的生產(chǎn)菌種是多種營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制了生產(chǎn)菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成。第八十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日853）檸檬酸等有機(jī)酸發(fā)酵過程：一般在產(chǎn)酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會發(fā)生染菌，主要是要預(yù)防發(fā)酵前期染菌。4）谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發(fā)酵的影響較大。第八十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日86種子培養(yǎng)期染菌染菌發(fā)生的不同時間對發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)主要是使微生物細(xì)胞生長與繁殖，此時，微生物菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富，比較容易染菌。若將污染的種子帶入發(fā)酵罐，則危害極大，因此應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌的發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)種子受到雜菌的污染，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。第八十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日87發(fā)酵前期染菌在發(fā)酵前期，微生物菌體主要是處于生長、繁殖階段，此時期代謝的產(chǎn)物很少，相對而言這個時期也容易染菌。染菌后的雜菌將迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的正常生長、繁殖及產(chǎn)物的生成。原因：發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌補(bǔ)救措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。第八十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日88發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌將會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，并嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。有的染菌后雜菌大量繁殖，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌體自溶，致使發(fā)酵液發(fā)粘，產(chǎn)生大量的泡沫，有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，代謝產(chǎn)物的積累減少或停止；有的染菌后會使已生成的產(chǎn)物被利用或破壞。措施降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第八十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日89發(fā)酵后期染菌由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的糖等營養(yǎng)物質(zhì)已接近耗盡，且發(fā)酵的產(chǎn)物也已積累較多，如果染菌量不太多，對發(fā)酵影響相對來說就要小一些，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。對發(fā)酵產(chǎn)物來說，發(fā)酵后期染菌對不同的產(chǎn)物的影響也是不同的，如抗生素、檸檬酸的發(fā)酵，染菌對產(chǎn)物的影響不大；肌苷酸、谷氨酸等地發(fā)酵，后期染菌也會影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、提取和產(chǎn)品的質(zhì)量。發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。第八十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日90發(fā)酵過程污染雜菌是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量第九十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日91顯微鏡檢查法二）、染菌的檢查和判斷

用革蘭氏染色法對樣品進(jìn)行涂片染色，顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌和雜菌的特征進(jìn)行區(qū)別、判斷是否染色。如發(fā)現(xiàn)了與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其他微生物存在，就可判斷為發(fā)生了染菌。此法檢查雜菌最為簡單、直接，也是常用的方法之一。必要時還可進(jìn)行芽孢染色或鞭毛染色。第九十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日92肉湯培養(yǎng)法

通常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待檢樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37°C進(jìn)行培養(yǎng)，隨時觀察微生物的生長情況，并取樣進(jìn)行鏡檢，判斷是否染菌。肉湯培養(yǎng)法常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，同時此法也用于噬菌體的檢查。第九十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日93平板培養(yǎng)

將待檢樣品在無菌平板上劃線，分別于37°C、27°C進(jìn)行培養(yǎng)，一般24h后即可進(jìn)行鏡檢觀察，檢查是否染菌。有時為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置于37°C條件下培養(yǎng)6h，使雜菌迅速增值后再劃線培養(yǎng)。

無菌實(shí)驗時，如果肉湯連續(xù)三次發(fā)生變色反應(yīng)（由紅色變?yōu)辄S色）或產(chǎn)生渾濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。第九十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日94抗生素發(fā)酵染菌原因分析（日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所）項目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15原因不明24.94第九十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日95

滅菌方法

化學(xué)滅菌第九十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日96物理滅菌第九十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日97培養(yǎng)基滅菌的操作方式第九十七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日98分批操作的滅菌過程冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)氣閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通冷卻水降溫通入蒸汽，加熱升溫：空氣管、夾套通入蒸汽，升溫至70℃，取樣管、放料管通入蒸汽維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)氣和排氣量，維持30min。第九十八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日99連續(xù)滅菌操作第九十九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日100連續(xù)滅菌滅菌過程第一百頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日101連續(xù)滅菌的特點(diǎn)第一百零一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日102三、發(fā)酵工藝條件的確定及主要控制參數(shù)第一百零二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日103檢測儀器和主要參數(shù)第一百零三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日104生物學(xué)檢測的主要參數(shù)和控制第一百零四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日105第一百零五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日106第一百零六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日107第一百零七頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日108物理參數(shù)的檢測與控制3.發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測第一百零八頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日109對一種微生物來說：超過它的最高生長溫度可殺死它采用它的最適生長溫度可培養(yǎng)它低于它的最低生長溫度可保存它第一百零九頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日110溫度的選擇原則第一百一十頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日111溫度的控制方式第一百一十一頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日112壓力的檢測與控制第一百一十二頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日113攪拌的檢測與控制第一百一十三頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日114化學(xué)參數(shù)的檢測與控制基質(zhì)濃度pH溶解氧尾氣第一百一十四頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日115基質(zhì)濃度的檢測與控制第一百一十五頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日116pH的檢測與控制第一百一十六頁，共一百三十九頁，2022年，8月28日117環(huán)境中微生