也說說體外診斷試劑標準品、校準品、質(zhì)控品那些事7

9/9也說說體外診斷試劑標準品、校準品、質(zhì)控品那些事（7）第七篇廠商的校準物：承上啟下，意義重大在校準等級（calibrationhierarchy）鏈上，上面層是參考測量系統(tǒng)，中間層是廠商校準物賦值過程，這一篇我會重點介紹產(chǎn)品校準物的研制、生產(chǎn)、賦值、測量不確定度評定等相關(guān)要求。校準物的生產(chǎn)工藝一般為：稱量→配制→過濾→分裝→凍干（適用于凍干品）→軋蓋→貼標→定值→包裝，其中稱量、配制、凍干、定值是主要工藝控制點，特別是冷凍干燥，其投入大、過程復(fù)雜、控制點多、對時間和人員要求高，但冷凍干燥能極大延長產(chǎn)品的效期，并方便貯存和運輸，在校準物和質(zhì)控物的生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。質(zhì)量控制過程包括原料檢驗、半成品檢驗、成品檢驗。在校準物研制過程中，要考慮基質(zhì)、項目、濃度、定值等因素。二十多年前，校準物大都為一些緩沖液基質(zhì)，為了克服基質(zhì)效應(yīng)，目前越來越多的校準物使用與臨床樣本近似的基質(zhì)。在這里想要說明的是，有的項目基質(zhì)效應(yīng)影響并不大，再加上咱們國家一直對血液管理非常嚴格，因此只要能提供數(shù)據(jù)證明基質(zhì)效應(yīng)的影響可以接受，應(yīng)鼓勵廠家使用動物血清基質(zhì)或者緩沖液基質(zhì)的校準物、質(zhì)控物。在校準物的項目選擇上，臨床為了使用方便和成本考慮，目前比較傾向使用復(fù)合的校準物，但是大組合會添加更多的成分，制備難度加大、組分間的干擾風(fēng)險增大，因此酶類、酯類、甲功、腫標等小組合也是不錯的選擇。在設(shè)計校準物的濃度時，應(yīng)充分考慮臨床實際應(yīng)用，結(jié)合項目的參考區(qū)間和醫(yī)學(xué)決定水平制定，具有診斷價值的濃度點不宜使用校準濃度外推方法。校準物屬于參考物質(zhì)（RM）的范疇，因此也應(yīng)具備三大特點：穩(wěn)定、均勻、帶有不確定度的特性值。校準物在設(shè)計開放階段就要考慮穩(wěn)定性，一般要確定效期穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性。在確定校準物效期時，可以參考ISO導(dǎo)則35，同時校準物作為應(yīng)用層面的參考物質(zhì)，屬于醫(yī)療器械管理，也可以參考YY/T1579《體外診斷醫(yī)療器械體外診斷試劑穩(wěn)定性評價》（等同轉(zhuǎn)化ISO23640）。在研發(fā)階段，當預(yù)測產(chǎn)品的效期、比較不同配方或包裝的效果、評估產(chǎn)品配方或生產(chǎn)工藝改變的影響的時候，可以使用加速穩(wěn)定性，達到加快選擇產(chǎn)品配方、包裝，從而提高研發(fā)效率、縮短研發(fā)周期的效果，但是加速穩(wěn)定性代替不了實時穩(wěn)定性，產(chǎn)品一定要做實時穩(wěn)定性的監(jiān)測和驗證。關(guān)于校準物的均勻性，可以參考ISO導(dǎo)則35。下面重點說說校準物的賦值。結(jié)合實際工作，我將校準物的賦值進行了總結(jié)，大致分為以下五種情況01有參考方法的情況下，經(jīng)典的校準物賦值過程圖1是ISO17511：2020中的溯源模式1，圖中紅框部分，從p4到m5就是制造商需要完成的。p4制造商選定測量程序（manufacture’sselectedmeasurementprocedure），應(yīng)是一個或多個現(xiàn)有的一級或二級校準物校準的測量系統(tǒng)，如果該項目現(xiàn)有公布的二級參考測量程序，最好選用參考測量程序，廠家可以在內(nèi)部建立參考測量程序，更鼓勵廠家利用現(xiàn)有的外部參考測量實驗室。m3校準p4給m4制造商工作校準物（workingcalibrator，又被稱為制造商主校準物、內(nèi)部校準物）賦值。廠家一定要建立工作校準物嗎？理論上可以沒有，可以直接用參考測量系統(tǒng)來校準產(chǎn)品校準物、甚至直接校準試劑盒，但是大家想想，這樣現(xiàn)實嗎？肯定不現(xiàn)實！所以才有工作校準物的存在。P5制造商常設(shè)測量程序（manufacture’sstandingmeasurementprocedure），p5一般與常規(guī)測量程序相同，但是廠家要通過大量的重復(fù)測定和嚴格的控制措施來實現(xiàn)較低的測量不確定度。m4校準p5給m5終端用戶校準物（end-useIVDMDcalibrator）賦值。圖1完整的校準物賦值過程在校準物賦值的過程中，有下面幾點需要強調(diào)和注意：—工作校準物的值是調(diào)整出來的，不是上一級參考物質(zhì)校準測量程序直接得到的。m3校準p4給m4賦值，得到的這個值就直接作為工作校準物的校準值嗎？由于工作校準物與實際臨床樣本還是有差異的，而我們最終都是服務(wù)于臨床患者樣本，因此這個值不是最終的校準值，只能作為初始賦值。制造商要使用參考測量程序去測試一組病人樣本（通常5～10個不同濃度的pools），再同時用工作校準物得到的初始賦值去校準常規(guī)測量程序測試這同一組病人樣本，如果這兩組值接近（預(yù)先設(shè)定可接受標準，例如回歸曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率、截距等），那工作校準物的賦值是有效的，如果不接近，則需要調(diào)整工作校準物的賦值，直到接近為止（如果工作校準品的基質(zhì)不接近臨床樣品，無論怎么調(diào)整，是調(diào)整不過來的，這就解釋了為什么一再強調(diào)工作校準物的互換性）；—產(chǎn)品校準物的值也是調(diào)整出來的。用m4校準p5給產(chǎn)品校準物賦值，得到的這個值也不能直接作為產(chǎn)品校準物的校準值，制造商要使用工作校準物校準常規(guī)測量程序去測試一組病人樣本，再同時用產(chǎn)品校準物得到的初始賦值校準常規(guī)測量程序去測試同一組病人樣本，如果這兩組值接近（預(yù)先設(shè)定可接受標準，例如回歸曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率、截距等），那產(chǎn)品校準物的賦值是有效的，如果不接近，則需要調(diào)整產(chǎn)品校準物的賦值，直到接近為止；—校準物的值是有檢測系統(tǒng)專用性的。從溯源圖上能看出，校準物的賦值是離不開試劑+儀器的測量程序的固定組合的，因此無論是工作校準物還是產(chǎn)品校準物，如果適用于多個檢測系統(tǒng)，則應(yīng)有不同的校準值。02有參考方法的情況下，簡化的賦值過程上面是一個完整的傳遞過程，非常復(fù)雜。在實際過程中，上述過程往往會簡化，見圖2，沒有m3和p4，從p3直接到m4，m4工作校準物是臨床樣本panels或pools，或者直接是臨床樣本，這些樣本與臨床樣本具有最大的相似性，因此通過p3參考方法給m4的賦值就不用再調(diào)整，這樣省去了很大的工作量。產(chǎn)品校準物的定值過程同第一種情況。03使用有證參考物質(zhì)給校準物賦值，這些有證標準物質(zhì)的前提是具備互換，并且濃度與校準物的濃度相當使用有證標準物質(zhì)給校準物賦值，見圖3。用有證標準物質(zhì)校準檢測系統(tǒng)后測定工作校準物，得到工作校準物的初步賦值。在分析儀上選定2個通道，一個通道以有證標準物質(zhì)校準，另一個通道以初步賦值的工作校準物校準，然后測試同一組病人樣本，如果這兩組值接近（預(yù)先設(shè)定可接受標準，例如回歸曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率、截距等），那工作校準物的賦值是有效的，如果不接近，則需要調(diào)整工作校準物的賦值，直到接近為止。產(chǎn)品校準物的定值過程同第一種情況。圖3使用CRM給校準物賦值的過程04使用有證參考物質(zhì)給校準物賦值的“靶值轉(zhuǎn)移程序”，這些有證標準物質(zhì)可能不具備互換性在這里，給大家推薦S?renBlirup-Jensen、A.MyronJohnson、MarianneLarsen1等專家2001年在ClinChemLabMed雜志上發(fā)表的《蛋白標準化》的系列文章，特別是第四篇《ProteinstandardizationIV:ValueTransferProcedurefortheAssignmentofSerumProteinValuesfromaReferenceMaterialtoaTargetMaterial》。文章里介紹了給參考物質(zhì)定值，特別是免疫類項目的參考物質(zhì)定值的一種方法即“靶值轉(zhuǎn)移程序”。由于該篇文章內(nèi)容較多、較復(fù)雜，在這里不詳細介紹了，大家如有需要我后續(xù)可再寫小文章。下面，我只介紹這篇文章的關(guān)鍵點。我們通常用與CRM直接比較的方式給下一級校準物定值（即上面的第三種情況），但是，如果CRM的基質(zhì)與下一級校準物基質(zhì)不一樣、濃度不一樣，這樣直接定值可能就會引起一定問題（第六篇提到二級標準物質(zhì)可以用與一級標準物質(zhì)進行比較測量的方法定值，這也是有條件的，即基質(zhì)相近、濃度相當，說得就是這個道理）。“靶值轉(zhuǎn)移程序”的基本原理是稱重稀釋，多點測定，線性回歸?！鞍兄缔D(zhuǎn)移程序”又分為2種途徑，途徑1：從一個血清蛋白制備物到另一個血清蛋白制備物的靶值轉(zhuǎn)移程序（直接靶值轉(zhuǎn)移），見圖4；途徑2：從一個純的蛋白制備物到一個血清蛋白制備物的靶值轉(zhuǎn)移程序（間接靶值轉(zhuǎn)移）。每種途徑都有其操作程序和數(shù)學(xué)模型，其中要注意的是：CRM和校準物的復(fù)溶、稀釋等過程采用稱重法，以降低不確定度；不同稀釋梯度溶液要進行密度校正；CRM和校準物要有多個稀釋梯度，且濃度近似；分不同天進行，且每天校準用的校準物要新配制；采用合適的統(tǒng)計學(xué)方法。圖4靶值轉(zhuǎn)移程序大致過程05無有證標準物質(zhì)、無參考測量程序，廠商建立自己的標準這種情況即ISO17511：2020里的模式6，見圖5。m3往往是制造商自己制備或外購的純化的生物標志物，如待測的抗原或抗體。p4制造商選定測量程序可以是這些抗原或抗體的配制程序，也可以是測這些抗原或抗體的常規(guī)測量程序，但要標準化、固定化，以減少不確定度。m4工作校準物可以是帶基質(zhì)的，也可以是其他基質(zhì)，也可以用臨床樣本panel或pool組成。經(jīng)常有同仁問道“企業(yè)如何建立自己的內(nèi)部標準？”其實這種情況，沒有標準，您的就是標準，大家記住一個原則“做我所寫，寫我所做，說與做一致，知與行合一”。圖5廠商建立標準的過程上面介紹了校準物的賦值，下面再說說測量不確定度。在檢驗醫(yī)學(xué)中測量程序的可靠性一直主要用術(shù)語隨機測量誤差和系統(tǒng)測量誤差，分別以不精密度和偏倚來表征。當前計量界對被測量的演變，由傳統(tǒng)上臨床化學(xué)使用的誤差方法到基于測量結(jié)果不確定度的方法。不確定度在涉及患者結(jié)果與臨床參考值比較的情況下，顯得尤為重要。舉例來說，HbA1c的參考區(qū)間為4%～6%，三位患者測的結(jié)果分別為3.9%、4.1%、6.2%，那到底是正常還是異常？如果直接作比較是有風(fēng)險的，科學(xué)的做法是比較時考慮測量不確定度。與誤差方法相比，測量不確定度可以傳遞和累積，這也是其應(yīng)用的優(yōu)勢之一。ISO15189要求實驗室確定并文件化他們測量結(jié)果的不確定度。關(guān)于醫(yī)學(xué)實驗室測量不確定度評定，可以參考ISO/TS20914:2019《Medicallaboratories——practicalguidancefortheestimationofmeasurementuncertainty》，這也是ISO/TC212新發(fā)布的一個標準，以配合ISO15189的實施。醫(yī)學(xué)實驗室測量結(jié)果不確定度的一個來源是所使用的產(chǎn)品校準物的測量不確定度。因此應(yīng)客戶要求，廠家應(yīng)將產(chǎn)品校準物的測量不確定度的相關(guān)信息提供。產(chǎn)品校準物賦值的測量不確定度是與其溯源密切相關(guān)的，溯源鏈上的每一個校準物、每一個校準程序都會引入不確定度，產(chǎn)品校準物賦值的測量不確定度就是上述分量的合成。溯源解決的是測量正確度的問題，如果僅僅追求量值溯源，不對每一校準傳遞步驟進行嚴格控制并降低測量不確定度，最終也不能實現(xiàn)測量結(jié)果準確可比的目的。最后還要強調(diào)一下溯源確認（validationofmetrologicaltraceability）。校準物完成賦值以后，不是就此結(jié)束了，還應(yīng)進行溯源確認的這個工作，因為試劑、儀器、校