基因在大腸桿菌酵母中的高效的表達

關(guān)于基因在大腸桿菌酵母中的高效的表達第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三前言基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程主要目標之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物—即實現(xiàn)基因的高效表達。基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三最佳的基因表達體系：⑴目的基因的表達產(chǎn)量高;⑵表達產(chǎn)物穩(wěn)定;⑶生物活性高;⑷表達產(chǎn)物容易分離純化。第一節(jié)基因的表達系統(tǒng)與表達策略第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:1、容易獲得較高濃度的細胞；

2、能利用易得廉價原料；

3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；

4、發(fā)熱量低、需氧低、適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；

5、容易進行代謝調(diào)控；

6、容易進行DNA重組技術(shù)操作；

7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，

8、產(chǎn)物容易提取純化。第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三二、宿主細胞分為兩大類：1、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；2、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調(diào)控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現(xiàn)多種基因的高效表達。表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、細胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達等。④易培養(yǎng)，成本低。第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三缺點：①大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。②因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達產(chǎn)物需經(jīng)變性復性才恢復活性。③蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基。④其內(nèi)毒素很難除去。

第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的基本過程第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的基本過程

基因的表達主要涉及到兩個過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，目的基因通過轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；

然后，tRNA（轉(zhuǎn)運RNA,transferRNA）將各種氨基酸運送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三Transcription(轉(zhuǎn)錄):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

轉(zhuǎn)錄的具體過程第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三

啟動子（promoter）：在基因序列中，標志著轉(zhuǎn)錄起始的可被RNA聚合酶識別的位點(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。

終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標志著轉(zhuǎn)錄停止的RNA聚合酶識別位點。有效轉(zhuǎn)錄的基本條件第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的基本過程第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)表達蛋白用途選擇基因的表達策略一、生物化學和分子生物學研究二、表達蛋白質(zhì)用作抗原三、結(jié)構(gòu)研究第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三真核基因表達的特點一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽，不存在象原核生物那樣的多基因操縱子模式；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)很大，而且往往遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基，它們并不直接影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結(jié)合，而是通過改變基因5’上游區(qū)DNA的構(gòu)型來影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結(jié)合；mRNA合成后穿過核膜進入細胞質(zhì)中后才進行翻譯工作，而且通常都有復雜的成熟和剪接過程；基因的啟動子區(qū)和原核基因差異很大，而且有增強子序列存在。第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三原核體系中表達真核基因的困難細菌的RNA聚合酶不識別真核基因的啟動子；真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在原核細胞中不能結(jié)合到核糖體上；真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細胞沒有象真核細胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達出有功能的真核蛋白；表達的真核蛋白在原核細胞中很不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶降解破壞。第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三⑴將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達載體的目的基因，這樣就解決了原核細胞沒有RNA剪接功能的問題。⑶構(gòu)建載體時，將真核基因插在幾個原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識別和降解，最后可以將融合多肽切除。構(gòu)建表達載體的策略第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)克隆基因在大腸桿菌中的表達

R－35－10SD編碼序列OriTcrTT啟動子起始密碼子AUG、GUG、UUG終止密碼子UAAU、UGA、UAG大腸桿菌表達載體的成份

大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質(zhì)粒表達載體，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點和有關(guān)序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復制子。第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌表達載體的成份⑴啟動子要求是：①強啟動子②是誘導性的，如熱誘導和化學誘導。⑵轉(zhuǎn)錄終止子使轉(zhuǎn)錄終止，增強mRNA的穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達水平。尤其是將兩個終止子串聯(lián)，轉(zhuǎn)錄終止功能更強。⑶核糖體結(jié)合位點在轉(zhuǎn)錄起始位點下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)篩選標記基因

(5)密碼子的選擇第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)①T7表達系統(tǒng)T7噬菌RNA聚合酶能選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄，其mRNA合成速率相當于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。②Lac表達系統(tǒng)是β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動子可以被IPTG誘導，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導物就可以誘導目的基因的表達。③Tac表達系統(tǒng)是一種由Lac和Trp啟動子雜合而成的啟動子，其強度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導表達。④λPL表達系統(tǒng)是負責λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一，是一種極強的啟動子。第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三影響克隆基因表達效率的因素

一般而言，所用啟動子的強度、DNA的轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會在一定程度上影響到轉(zhuǎn)基因的表達。啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響大多數(shù)大腸桿菌啟動子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄其始位點上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5’--TATAAT)和-35區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25bp處，一般有10bp組成，5’--TTGACA故稱為-35區(qū)，)。當然，實際的啟動子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動子的這兩個區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動子的表達能力也就越強。另外，這兩個保守區(qū)間的距離也是影響啟動子強度的重要因素，即這個間距越是接近于17bp，啟動子的活性就越強。第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三b.翻譯起始序列對表達效率的影響

mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結(jié)合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結(jié)合位點是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細菌核糖體有效結(jié)合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3‘端互補，控制了翻譯的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----

16SrRNA3’末端第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三c.啟動子與克隆基因間的距離對基因表達的影響

研究表明啟動子和目的基因間的距離對基因的表達效率影響很大，所以在構(gòu)建新的表達載體時要考慮到這一因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序列，否則會導致細胞能量的大量消耗，或是形成不應有的二級結(jié)構(gòu)，最終影響的目的基因的表達效率。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)的融合表達融合表達一般是將基因引入某表達載體編碼的高表達蛋白（擔體蛋白）序列的3’末端。表達出來的融合蛋白的N末端含有由擔體序列編碼的片段。融合蛋白可以直接用作抗體，但通常是將N端的擔體蛋白部分從C端的目的蛋白中裂解出來，有利于對目的蛋白進行生化研究及功能分析。方法主要有：化學裂解法和酶解法。第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)的分泌型表達將目的蛋白的基因置于原核蛋白信號肽序列的下游有可能實現(xiàn)分泌表達。實現(xiàn)蛋白質(zhì)分泌表達有許多有利之處：1.在穿膜過程中信號肽被信號肽酶切除。生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)是一致的。2.周質(zhì)中蛋白酶活性低，分泌的蛋白穩(wěn)定。3.周質(zhì)中細菌的蛋白很少，使得重組蛋白易純化。4.周質(zhì)中提供了一個氧化環(huán)境，更有利于二硫鍵的正確形成。因此，對于許多難以純化的蛋白質(zhì)可以通過分泌表達來實現(xiàn)生產(chǎn)。第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)的包含體形式表達重組蛋白在大腸桿菌中高表達時，絕大多數(shù)是以包含體形式存在的。包含體就是表達的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的固體顆粒。不可溶、無生物活性的包含體必需經(jīng)過變性、復性才能獲得天然結(jié)構(gòu)及生物活性。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三減少包含體形成的策略：1.降低重組菌的生長溫度。2.添加可促進重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑。如高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖。3.供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH值等。

不過，包含體的形成有時也是有利的，不僅可以獲得高表達、高純度的蛋白質(zhì)，還可避免細胞水解酶對重組蛋白的破壞。第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三有效、理想的復性方法應具備一下幾個特點：1.活性蛋白質(zhì)的回收率高。2.正確復性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質(zhì)分離。3.折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。4.折疊復性方法利用放大。5.復性過程耗時較少。第29頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)基因在酵母中的高效表達大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺陷：1.缺失真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等。2.表達的蛋白多以包含體形式存在，需要經(jīng)過復雜的復性才能恢復構(gòu)象和生物活性。因此，可以使用真核生物酵母作為表達菌。如釀酒酵母、甲醇酵母等。第30頁，共33頁，2023年，2月20日，星期三甲醇酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母能利用甲醇為其唯一碳源。