氣相色譜測定牦牛骨中脂肪酸的甲酯化方法比較

氣相色譜測定牦牛骨中脂肪酸的甲酯化方法比較劉文媛;賈偉;吳婷;張春暉;李俠;陳雪峰【摘要】利用氣相色譜(GC)技術，采用酸水解提取脂質,比較了6種甲酯化法(乙酰氯-甲醇法、H2SO4-甲醇法、HCI-甲醇法、KOH-甲醇法、KOH-甲醇+H2SO4-甲醇法和KOH-甲醇+HCl-甲醇法)對脂肪酸測定的影響，優(yōu)選牦牛骨中脂肪酸測定的最佳方法.37種脂肪酸標準樣品在0.28~250.00mg/L范圍內線性關系良好相關系數(shù)均大于0.99(除C4:0外).堿酯化法和酸堿結合法幾乎無法測出牦牛骨中的脂肪酸，其測得的總脂肪酸含量小于0.20g/100g?乙酰氯-甲醇法測得的總脂肪酸含量(13.61g/100g)顯著高于H2SO4-甲醇法(總脂肪酸含量為11.68g/1009)和HCI-甲醇法(總脂肪酸含量為3.18g/1009)測得的結果?乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法的日內和曰間精密度分別為0.27%~8.60%和0.34%~2.64%,兩種方法中脂肪酸的回收率為83.06%-105.54%.結果表明，酸水解-乙酰氯-甲醇法是牦牛骨中脂肪酸測定的最佳方法.C18:1n9c、C16:0、C18:0和共軛亞油酸(CLA)是牦牛骨的主要脂肪酸,其總和達脂肪酸總量的85%以上,飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸含量比值約為1:2.牦牛骨中脂肪酸的研究為骨資源脂質的有效利用提供了重要依據(jù).期刊名稱】《色譜》年(卷),期】2016(034)011【總頁數(shù)】7頁(P1113-1119)關鍵詞】氣相色譜;甲酯化;脂肪酸;牦牛骨;方法驗證作者】劉文媛;賈偉;吳婷;張春暉;李俠;陳雪峰【作者單位】陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安710021;中國農業(yè)科學院農產品加工研究所,北京100193;中國農業(yè)科學院農產品加工研究所,北京100193;中國農業(yè)科學院農產品加工研究所,北京100193;中國農業(yè)科學院農產品加工研究所,北京100193;中國農業(yè)科學院農產品加工研究所,北京100193;陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安710021【正文語種】中文【中圖分類】O658骨由骨髓和礦化骨組織組成,富含蛋白質、礦物質和脂肪［1］,隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模和肉類消費量的逐年增長,骨資源的開發(fā)利用逐漸引起人們的關注。牦牛是唯一一種可生活在海拔3000m以上高寒地帶的牛種，約有92%的牦牛分布在中國［2］,而牦牛骨作為可食性副產物未被有效利用。近年來對牦牛骨的研究多集中在蛋白質及微量元素上,對其脂肪酸的研究鮮見報道［3,4］。氣相色譜法是檢測脂肪酸的有效方法［5］,測定分析前需將脂肪酸衍生為脂肪酸甲酯甲酯化方法有酸催化法、堿催化法、酸堿結合法和乙酰氯-甲醇催化法等［6,7］。酸催化法適用于酯化總脂肪酸,反應時間取決于酸濃度和反應溫度。堿催化法的反應條件相對溫和且耗時較短,但不適用于酯化游離脂肪酸,且對體系中水分含量要求嚴格［8-10］。乙酰氯-甲醇在催化過程中釋放足量的鹽酸,促進酯化反應的進行［11］。前人使用不同的酯化劑對不同骨樣中的脂肪酸進行了分析，如Humphrie等［12］使用H2SO4-甲醇法研究了女性骨關節(jié)炎和脆性骨折之間的脂肪酸指紋圖譜的差異;Everts等［13］采用HCI-甲醇法對鯨魚骨化石中的脂肪酸進行了分析;劉金凱等［14］使用乙酰氯-甲醇對氧化及未氧化的羊骨油中脂肪酸進行了測定。但酯化試劑多作為一種單純的甲酯化手段用于脂肪酸的測定,尚未有骨中脂肪酸檢測方法特性及適用性的研究。本研究綜合比較了脂肪酸檢測方法,優(yōu)選牦牛骨中脂肪酸測定的最佳方法,為今后牦牛骨中脂肪酸的檢測提供了方法依據(jù),牦牛骨中脂肪酸組成分析為其脂質的應用研究提供了思路和依據(jù)。儀器、試劑與材料AllegraX-12R型冷凍離心機（美國BeckmanCoulter有限公司）;配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀（GC-FID,Varian450）、自動進樣器CP8400、CP-Sil88毛細管柱（100mx0.25mmx0.2pm）購自安捷倫科技中國有限公司。乙酰氯（質量分數(shù)為99%）、硫酸（質量分數(shù)為98%）、鹽酸（質量分數(shù)為37%）、氫氧化鉀、氯化鈉、無水硫酸鈉和碳酸鈉均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;甲醇（色譜純）購自賽默飛世爾科技公司;正己烷（色譜純）購自北京邁瑞達科技有限公司。37種脂肪酸甲酯混合標準品（FAMEMix37）、C4~C24各脂肪酸甲酯標準品（純度》99%）、碳酸甘油三酯（glyceryltriundecanoate,純度＞98%）購自美國Sigma公司;共軛亞麻油酸甲酯（conjugatedmethyloctadecadienoate,CLA,純度為99%）購自美國Nu-Check-Prep公司。隨機選取西藏拉薩地區(qū)自然放牧條件下2~3歲發(fā)育正常的公牛6頭,屠宰后取后股骨（不含軟骨），剔除碎肉、筋等雜質，晾干后粉碎，得到3~5mm的骨顆粒,保存于-80°C備用。標準溶液的配制37種脂肪酸甲酯混合標準品的配制:原液（質量濃度見表1）用正己烷梯度稀釋2.5、5、10、15、20倍用于繪制標準曲線。十—碳酸甘油三酯內標液的配制:稱取500mg十一碳酸甘油三酯,用甲醇定容至500mL,配制成質量濃度為1g/L的溶液。共軛亞麻油酸甲酯外標液的配制:取50mg共軛亞麻油酸甲酯，用正己烷定容至100mL,配制成質量濃度為0.5g/L的溶液，用正己烷稀釋為10、20、30、40倍的梯度工作液,用以繪制標準曲線。實驗方法脂肪的提取采用酸水解提取牦牛骨中的脂質。稱取0.10g牦牛后股骨，加入0.5mL1g/L十—碳酸甘油三酯內標液和10.0mL8.3mol/LHCI溶液。將水解管于80°C水浴中水解40min（每10min振蕩一次）。水解完成后，取出試管冷卻至室溫，加入2mL正己烷,渦旋振蕩1min,靜置2min,將有機層收集到另一水解管中，同樣的操作重復4次。脂肪甲酯化采用6種不同的酯化劑對水解提取的脂質進行甲酯化處理。6種甲酯化方法分別為M1:乙酰氯-甲醇法［14］（酯化劑:10%（體積分數(shù),下同）乙酰氯-甲醇）；M2:H2SO4-甲醇法［12］（酯化劑:5%H2SO4-甲醇）；M3:HCI-甲醇法［15］（酯化劑:5%HCI-甲醇）；M4:KOH-甲醇法［16］酯化劑:2mol/LKOH-甲醇）；M5:KOH-甲醇+H2SO4-甲醇法［17］（酯化劑:2mol/LKOH-甲醇,5%H2SO4-甲醇）和M6:KOH-甲醇+HCI-甲醇法［18］（酯化劑:2mol/LKOH-甲醇,5%HCI-甲醇）。M1~M4甲酯化處理:試管中加入6mL各方法下相應的酯化劑，在N2流下充氣1min后旋緊螺旋蓋，振蕩2min,混勻，于80C水浴2h（每20min振蕩一次）。M5~M6甲酯化處理:試管中加入6mLKOH-甲醇，在N2流下充氣1min后旋緊螺旋蓋，振蕩2min,混勻后于80C水浴1h,于冰浴中冷卻至4C后加入6mL5%H2SO4-甲醇（M5）或6mL5%HCI-甲醇（M6）,在N2流下充氣1min后旋緊螺旋蓋，振蕩2min,混勻后于80C水浴中再次酯化1h。水浴過程中每15min振蕩一次。M1~M6甲酯化反應完成后,取出試管冷卻至室溫。將反應后的樣液轉移至50mL離心管中,分別用3.0mL飽和NaCI溶液（M1使用60g/LNa2CO3溶液）清洗試管3次，合并清洗液，混勻，以4500r/min的轉速離心10min。離心完成后收集上清液于儲藏瓶中,加入約2g無水硫酸鈉干燥,振搖混勻靜置，于-80°C保存。取1mL上清液過0.2pm有機相濾膜，于氣相小瓶中進行GC分析。色譜條件色譜柱:CP-Sil88毛細管柱;進樣量:1pL,分流比為20:1。檢測器溫度:300°C;進樣溫度：200°C;載氣為氦氣，純度>99.999%；載氣流速為30mL/min。升溫程序如下：初始柱溫80C,以2C/min的速度升溫至200C,于200C保持2min,再以5C/min的速度升溫至230°C,于230°C保持15min。甲酯化方法的比較37種脂肪酸甲酯混合標準品和CLA標準品的GC譜圖見圖1?？梢钥闯鲈诒狙芯克⒌腉C-FID條件下，各脂肪酸甲酯均能被有效分離和檢出。圖2分別為6種甲酯化方法處理后樣品的GC譜圖，與乙酰氯-甲醇法（M1）和酸酯化法（M2和M3）相比，堿酯化法（M4）和酸堿結合法（M5和M6）的出峰數(shù)極少且峰高極低。乙酰氯-甲醇法、H2SO4-甲醇法和HCl-甲醇法分別檢測出20、20和16種脂肪酸（不包括內標）,而在重復測定過程中穩(wěn)定存在的脂肪酸分別為15、15和12種。本研究只對穩(wěn)定存在的脂肪酸進行了定量分析比較,結果見表2。M1-M6arethesameasthoseinFig.2.CLA:conjugatedlinoleicacid;SFA:saturatedfattyacid;UFA:unsaturatedfattyacid.nd:notdetected.a）-c）:significantdifference（p<0.01）inM1-M3.Resultswereobtainedfromthemeansofninedeterminations.堿酯化法和酸堿結合法堿酯化法（測得總脂肪酸含量<0.20g/100g）和酸堿結合法（測得總脂肪酸含量<0.10g/100g）幾乎無法測出牦牛骨中的脂肪酸（見表2）。koh-甲醇易與游離脂肪酸反應生成脂肪酸鉀和水,水會導致氫氧根自由基的生成,這些氫氧根自由基會使骨樣中的酯和新生成的脂肪酸甲酯發(fā)生水解反應,從而削弱堿酯化效果［19-21］。牦牛骨中游離脂肪酸及體系中水的存在導致堿酯化法和酸堿結合法最終只能測出微量的脂肪酸。而在Juarez等［22］對肉中脂肪酸檢測方法的研究中,HCI-甲醇法、皂化法、經(jīng)典法和結合法均測得相應的脂肪酸含量,且使用KOH-甲醇催化的皂化法和經(jīng)典法測得的脂肪酸含量均較高?？赡苁怯捎谌夂凸侵兄舅峤M成形式不同,適用于肉中脂肪酸檢測的堿酯化法和酸堿結合法卻幾乎無法測得牦牛骨中的脂肪酸。乙酰氯-甲醇法和酸酯化法由表2可知HCl-甲醇法測定的總脂肪酸含量(3.18g/100g)顯著低于乙酰氯-甲醇法(13.61g/100g)和H2SO4-甲醇法(11.68g/100g)測定的總脂肪酸含量。酸催化過程需要較高的催化劑濃度和溫度，且反應時間較長［21］。HCl-甲醇不穩(wěn)定,HCl易與甲醇發(fā)生親核反應生成氯甲烷和水［23］,水會削弱酯化效果［24］。在本研究試驗條件下,HCI-甲醇法可能未使脂肪酸完全酯化，從而造成其結果偏低。Juarez等［22］比較了肉中脂肪酸的檢測方法,發(fā)現(xiàn)與皂化法、經(jīng)典法相比,HCI-甲醇法由于反應條件不足導致脂肪酸不能被完全提取,只能測得較低的脂肪酸含量。H2SO4-甲醇作為酯化劑時，脂肪酸與甲醇在酸性條件下發(fā)生酯化反應［8］。但反應體系中的水會抑制反應的進一步進行［25］,且可能存在甲醇脫水生成甲基醚的副反應。這些反應將影響H2SO4-甲醇的酯化效果。而乙酰氯在作用過程中釋放的鹽酸實現(xiàn)了酸原位催化反應,且乙酰氯可以消化酯化過程中產生的水從而促進酯化反應的進行［26］。由于酯化過程中水的產生，除C10:0、C12：0、C14：1n5、C17:0和C20:0用兩種方法測得的含量沒有顯著差異外，乙酰氯-甲醇法測得的飽和脂肪酸(saturatedfattyacid,SFA,4.16g/100g)、不飽和脂肪酸(unsaturatedfattyacid,UFA,9.45g/100g)、總脂肪酸(13.61g/100g)和其他10種脂肪酸含量均顯著高于H2SO4-甲醇法測得的含量(見表2)。工作曲線、檢出限和定量限使用正己烷梯度稀釋脂肪酸甲酯混合標準溶液,根據(jù)質量濃度(mg/L)與峰面積關系繪制標準曲線。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)以3倍和10倍信噪比計算得出，部分脂肪酸甲酯的線性關系見表3。各脂肪酸甲酯標準品在0.28~250.00mg/L范圍內線性關系良好相關系數(shù)R2均大于0.99(C4：0除外，其R2為0.9878)?；诒?中的LOD和LOQ值，對樣液進行稀釋使其脂肪酸濃度處于線性范圍內。精密度與回收率使用相對標準偏差(RSD)計算方法的日內精密度(n=9)和曰間精密度(n=3),乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法的精密度見表4。相較于乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法的日內精密度(0.34%~1.90%),其日間精密度范圍(0.27%~8.60%)較大,但均小于9%。取約0.10g牦牛后股骨添加高、中、低3個水平的脂肪酸標準品，并按1.3節(jié)方法處理樣品，進行加標回收試驗根據(jù)回收率評估乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法的準確性(見表5)。各脂肪酸3個添加水平的回收率均在81%~106%之間，且牦牛骨中含量較高的C18:1n9c、C16:0和C18:0在3個濃度水平和CLA中濃度水平的回收率均在90%~97%之間。結果表明乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法準確可靠。牦牛骨脂肪酸分析分析比較牦牛骨中的脂肪酸,SFA約占總脂肪酸的1/3,C16:0、C18:0是主要脂肪酸，兩者含量之和達SFA的90%以上。C18:1n9c是最主要的單不飽和脂肪酸(含量達UFA的85%以上),含量約為總脂肪酸的一半。這一結果與Kagawa等［27］的研究結果相似，表明C18:1n9c(含量約為總脂肪酸的34%-50%)是人和動物骨組織的主要脂肪酸。CLA是主要的多不飽和脂肪酸，含量達總脂肪酸的14%。C18:1n9c、C16:0、C18:0和CLA是牦牛骨的主要脂肪酸，這一結果與Mello等［28］得出的C18:1n9c、C16:0和C18:0是牛骨髓主要脂肪酸的結論相似。通過對6種甲酯化方法的分析比較發(fā)現(xiàn),堿酯化法和酸堿結合法幾乎無法測出牦牛骨中的脂肪酸，乙酰氯-甲醇法和H2SO4-甲醇法的測定效果顯著優(yōu)于HCI-甲醇法測得的結果(總脂肪酸含量為3.18g/100g),乙酰氯-甲醇法測得的總脂肪酸含量(13.61g/100g)顯著優(yōu)于H2SO4-甲醇法測得的結果(總脂肪酸含量為11.68g/100g)。結合驗證試驗結果綜合比較，酸水解-乙酰氯-甲醇法是牦牛骨中脂肪酸檢測的最佳方法°C18:1n9c、C16:0、C18:0和CLA是牦牛骨的主要脂肪酸,其含量分別為總脂肪酸的47%、17%、10%和13%,SFA與UFA的含量比值約為1:2。對牦牛骨中脂肪酸的深入研究為牦牛骨資源的深層次利用提供可靠詳實的基礎數(shù)據(jù),對牦牛產業(yè)的發(fā)展具有重要意義?！鞠嚓P文獻】WardAG,CoursA.TheScienceandTechnoIogyofGeIatin,London:AcademicPress,1977:31MaJ,CaiJ,MaJ,etaI.VetParasitoI,2014,202(3/4):113QuY,LiC,ChengLT,etaI.ChineseJournaIofScienceandTechnoIogyofFoodIndustry,2016,37(3):271瞿瑗,李誠,程樂濤,等.食品工業(yè)科技,2016,37(3):271ZhouLB.ActaAgricuIturaeBoreaIi-OccidentaIisSinica,2011,20(5):59周利兵.西北農業(yè)學報,2011,20(5):59LiB,QiuLQ,SongSF,etaI.ChineseJournaIofAnaIysisLaboratory,2014,33(5):528李斌,裘立群,宋少芳,等.分析試驗室,2014,33(5):528ShaoSP,XiangDP,LiS,etaI.ChineseJournaIofChromatography,2015,33(11):1214邵仕萍,相大鵬,李雙,等.色譜,2015,33(11):1214LinQ,LiGB,GeP,etaI.ChineseJournaIofChromatography,2016,34(5):520林麒,李國波,葛品,等.色譜,2016,34(5):520CarrapisoAI,GarciaC.JLipids,2000,35(11):1167SuterB,GrobK,PacciareIIiB.ZLebensmUntersForschA,1997,204(4):252LongAR,MassieSJ,TyznikWJ.JFoodSci,1988,53:940EckerJ,SchererM,SchmitzG,etaI.JChromatogrB,2012,897(4):98HumphrieJM,KuIiwabaJS,GibsonRJ,etaI.JBone,2012,51(2):218EvertsJM,DoberenzAR,WyckoffRWG.JCompBiocheraPhysioI,1968,26(3):955LiuJK,GaoY,WangZY,etaI.ChineseJournaIofModernFoodScienceandTechnology,2014,30(11):240劉金凱,高遠,王振宇,等.現(xiàn)代食品科技,2014,30(11):240ShengJ,VannelaR,RittrnannBE.JBioresourTechnol,2011,102(2):1697ZhuWX,YuanP,ZhangL,etal.ChineseJournalofAnalysisLabor