畢業(yè)論文-新臺(tái)糖22號(hào)健康種苗生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究

新臺(tái)糖22號(hào)健康種苗生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究摘要廣西是我國(guó)最重要的甘蔗產(chǎn)區(qū)，甘蔗和蔗糖產(chǎn)量均占全國(guó)的65％以上，年糖料蔗種植面積約1，600萬(wàn)畝，但平均單產(chǎn)已經(jīng)逐漸降低。造成我區(qū)甘蔗產(chǎn)量逐年下降的原因，主要是常用品種的種性退化和甘蔗良種研發(fā)更新的嚴(yán)重滯后。新臺(tái)糖22號(hào)在我國(guó)推廣已近20年，占蔗區(qū)面積80%以上，而在我區(qū)，新臺(tái)糖22號(hào)的種植面積甚者已經(jīng)達(dá)90%以上，種性退化嚴(yán)重，品種過(guò)于單一化，病蟲(chóng)害累積爆發(fā)日益嚴(yán)重。但是，由于目前育成的新品種無(wú)論是在產(chǎn)量、糖分或者適應(yīng)性等方面都還無(wú)法超越新臺(tái)糖22號(hào)，因此，在加快良種研發(fā)的同時(shí)，延長(zhǎng)新臺(tái)糖22號(hào)這一品種在生產(chǎn)上的使用壽命是我國(guó)蔗糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。新臺(tái)糖22號(hào)多年連作，病害積累嚴(yán)重，其中梢腐病、花葉病、宿根矮化病等病害目前還沒(méi)有很好的防治方法，要防治病害最有效的措施就是采用健康脫毒種苗（淡明等，2011年）。本研究以法國(guó)Vitropic公司研發(fā)的新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)RITA）為基礎(chǔ)，利用健康種苗生產(chǎn)技術(shù)對(duì)新臺(tái)糖22進(jìn)行提純復(fù)壯，同時(shí)結(jié)合法國(guó)最新的間歇浸沒(méi)式組織培養(yǎng)系統(tǒng)（RITA）進(jìn)行間歇式工廠化甘蔗健康種苗快繁技術(shù)研究。重點(diǎn)對(duì)甘蔗健康種苗快速增殖、對(duì)一些甘蔗重要病害進(jìn)行甘蔗間歇式工廠化藥物脫毒、無(wú)蔗糖培養(yǎng)等健康種苗培養(yǎng)新技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，最終為支撐開(kāi)展相關(guān)的技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)化示范打好基礎(chǔ)。試驗(yàn)主要結(jié)果如下：1、新臺(tái)糖22號(hào)愈傷組織分化，其中下部的誘導(dǎo)率最大，其次是中部，上部最低為；不同2,4D濃度，愈傷誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異性，22號(hào)從生長(zhǎng)點(diǎn)開(kāi)始0~7cm的嫩葉鞘作為愈傷誘導(dǎo)的材料較好。2、RIAT系統(tǒng)接種苗數(shù)是10根/瓶時(shí)增殖系數(shù)第二，但總苗數(shù)第一，15根/瓶和20根/瓶則、生長(zhǎng)空間明顯不足，培養(yǎng)液更容易褐化，生長(zhǎng)后期組培苗容易產(chǎn)生黃葉并迅速死亡；5根苗/瓶時(shí)增殖系數(shù)第一，但總苗數(shù)第四，培養(yǎng)液養(yǎng)分也有剩余，造成浪費(fèi)。因此，接種10根/瓶最佳。3、RITA系統(tǒng)培養(yǎng)接種密度相同時(shí)，吸光度減少，即硝態(tài)氮消耗量增加；接種密度越大，吸光度下降越快，硝態(tài)氮剩余含量也就越少。當(dāng)接種密度為10株/瓶時(shí)，組培苗增殖情況較好，養(yǎng)分消耗適宜。綜合2和3結(jié)論，接種密度10根/瓶最佳。4、當(dāng)RITA接種密度為10株/瓶時(shí)，增殖系數(shù)、總苗數(shù)及養(yǎng)分消耗培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)的其它最佳參數(shù)組合為培養(yǎng)時(shí)間為21天左右，培養(yǎng)液配方為3/4MS培養(yǎng)基+6-BA0.4mg/L+蔗糖20g/L、浸沒(méi)間隔時(shí)間為3min/3h。5、可用于健康種苗生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行脫毒的藥物和藥物組合及濃度為：LincanycinHydrochloride鹽酸林可霉素（潔霉素）、Cefalexin（頭孢氨芐）、Pasiniazid對(duì)氨水楊酸煙肼、Berberine鹽酸小檗堿、代森錳鋅、多菌靈等，濃度均為1mg/L。6、蔗糖濃度可調(diào)整為15-20g/L的中低水平，有效降低了蔗糖使用濃度，在保障健康種苗正常增殖的基礎(chǔ)上降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)鍵詞：新臺(tái)糖22號(hào)；健康種苗；組織培養(yǎng)；快繁；新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)（RITA）1前言甘蔗,學(xué)名Saccharumofficinarum,甘蔗屬，是我國(guó)最重要的糖料作物。而廣西，作為我國(guó)四大甘蔗產(chǎn)區(qū)之一，其甘蔗和蔗糖產(chǎn)量均占全國(guó)的65%以上，年糖料蔗種植面積約為1,600萬(wàn)畝，平均單產(chǎn)4-5噸/畝。但是，近年來(lái)，我區(qū)甘蔗產(chǎn)量逐年下降，病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重，已造成了巨大的損失。經(jīng)調(diào)查，造成我區(qū)甘蔗產(chǎn)量逐年下降的原因，主要是常用品種的種性退化和甘蔗良種研發(fā)更新的嚴(yán)重滯后。新臺(tái)糖22號(hào)在我國(guó)推廣已近20年，占蔗區(qū)面積80%以上，而在我區(qū)，新臺(tái)糖22號(hào)的種植面積甚者已經(jīng)達(dá)90%以上，種性退化嚴(yán)重，且由于品種過(guò)于單一化，病蟲(chóng)害累積爆發(fā)日益嚴(yán)重，2012年病蟲(chóng)害傳播造成甘蔗減產(chǎn)15-20%以上，直接經(jīng)濟(jì)損失超10億元（韋昌聯(lián)，2012）。雖然新臺(tái)糖22號(hào)種性退化嚴(yán)重，但是，由于目前育成的新品種無(wú)論是在產(chǎn)量、糖分或者適應(yīng)性等方面都還無(wú)法超越新臺(tái)糖22號(hào)，因此，在加快良種研發(fā)的同時(shí)，延長(zhǎng)新臺(tái)糖22號(hào)這一品種在生產(chǎn)上的使用壽命是我國(guó)蔗糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。新臺(tái)糖22號(hào)多年連作，病害積累嚴(yán)重，其中花葉病、宿根矮化病等病害目前還沒(méi)有很好的防治方法。因此，采用脫毒健康的甘蔗種苗是防治上述病害最有效的技術(shù)措施（淡明等，2011年）。甘蔗脫毒健康種苗是采用優(yōu)良品種做材料，經(jīng)預(yù)脫毒處理—?jiǎng)冸x莖尖—組織培養(yǎng)—病原檢測(cè)—組培擴(kuò)繁，或種莖熱處理脫毒，去除甘蔗宿根矮化病、花葉病等細(xì)菌性病害喝病毒性病害病原，得莖尖脫毒苗或脫毒種莖，經(jīng)大田繁殖至一級(jí)、二級(jí)種莖成為甘蔗脫毒健康種苗，供大田生產(chǎn)用種。20世紀(jì)70年代末，巴西、古巴等國(guó)已對(duì)甘蔗健康種苗進(jìn)行了研究，并在80年代，成功獲得健康種苗，并在甘蔗生產(chǎn)上推廣使用（章文水等，2002年），至今，巴西、古巴等國(guó)90%蔗區(qū)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)甘蔗用種健康、無(wú)毒化，巴西已通過(guò)政府立法，在全國(guó)建立甘蔗脫毒健康種苗生產(chǎn)繁殖體系，明確規(guī)定生產(chǎn)上必須使用脫毒的健康種苗（游建華等，2001年）。據(jù)廣西有關(guān)研究報(bào)道：脫毒苗與常規(guī)苗相比，糖料蔗增產(chǎn)15.1%-52.1%，蔗糖分提高0.12%-1.71%(絕對(duì)值)。在廣西，新臺(tái)糖22號(hào)健康種苗在百色蔗區(qū)的試驗(yàn)中，健康種苗脫去了甘蔗花葉病、宿根矮化病等病源，品種的種性得到較大恢復(fù)，產(chǎn)量和糖分接近于原種，甘蔗明顯增產(chǎn)（歐麗萍，2013年）。1.1甘蔗健康種苗快繁研究現(xiàn)狀1.1.1甘蔗健康種苗的技術(shù)原理甘蔗的宿根矮化病、花葉病等病原菌和病毒在植物體內(nèi)主要通過(guò)胞間連絲和維管束系統(tǒng)傳播。甘蔗健康種苗就是利用脫毒技術(shù)對(duì)甘蔗進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，植物的莖尖分生組織十分活躍，維管束系統(tǒng)尚未形成，病原菌和病毒由于胞間連絲傳播速度的緩慢，跟不上莖尖細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂速度；再者，莖尖分生組織細(xì)胞新陳代謝速度快，生長(zhǎng)激素濃度較高，病毒較難復(fù)制和繁殖（韋海球，2013）。因此，采取莖尖培養(yǎng)能夠有效地去除病菌病毒，從而獲得健康的種苗。1.1.2甘蔗健康種苗的獲得途徑目前，甘蔗健康種苗的獲得主要是通過(guò)莖尖培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)常規(guī)的植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。據(jù)前人試驗(yàn)，許莉萍等利用愈傷組織和莖尖培養(yǎng)去除花葉病毒研究中，表明心葉愈傷組織培養(yǎng)脫毒效果顯著，后代產(chǎn)生的變異較大；莖尖組織培養(yǎng)有一定的脫毒效果，后代的遺傳穩(wěn)定性高（許莉萍，1994）。高山林等采用熱處理-分生組織脫毒技術(shù)，其脫毒效果顯著，可增產(chǎn)50%以上（高山林，2001）。許多的前人研究證明，頂端分生組織培養(yǎng)對(duì)甘蔗花葉病，宿根矮化病，白條病等的脫毒效果較好。而目前生產(chǎn)上，主要采用了熱處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)的方法。這一技術(shù)要點(diǎn)包括以下幾個(gè)：選取供體蔗—種莖熱處理—催芽—莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)—擴(kuò)繁—壯苗生根。在甘蔗健康種苗的繁育中，供體材料應(yīng)該選擇生長(zhǎng)良好健康強(qiáng)壯的蔗莖，蔗莖經(jīng)熱處理后置于人工培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。莖尖處理接種時(shí)，應(yīng)該無(wú)菌條件下進(jìn)行，劉麗敏等證明莖尖在接種到培養(yǎng)基之前，使用PVP溶液、無(wú)菌水浸泡10—15min，可以減輕酚污染，提高莖尖培養(yǎng)成功率（劉麗敏，2009）。莖尖誘導(dǎo)長(zhǎng)出甘蔗幼苗叢芽后，將其轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，每株系進(jìn)行病毒檢測(cè)，選取無(wú)毒株，不斷擴(kuò)大繁殖，達(dá)到從芽苗批量工廠化生產(chǎn)的目的。從莖尖接種到移植大田，整個(gè)過(guò)程需要5個(gè)月左右。1.1.3不同激素種類(lèi)及配比對(duì)甘蔗組培苗增殖的影響在甘蔗組培研究中，激素的配比是一個(gè)十分重要的內(nèi)容，激素的種類(lèi)以及濃度都會(huì)影響到甘蔗組培苗的生長(zhǎng)方向、生長(zhǎng)情況，最終將會(huì)關(guān)系到生產(chǎn)上的效益。陳彪等在甘蔗組織培養(yǎng)配方中不同激素效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，外源激素的刺激使多酚氧化酶活性提高，若降低外源激素含量可大大降低酚害影響，提高叢芽誘導(dǎo)率，而不同激素混合使用有利于降低分化苗的變異率（陳彪等，2001年）。常用的外源激素包括6-BA、KT、NAA、IAA等等。劉麗敏等在利用浸沒(méi)式生物反應(yīng)器進(jìn)行甘蔗脫毒苗快繁研究中證實(shí)，6-BA單獨(dú)使用能促進(jìn)組培苗分化，但增殖率低且分化苗細(xì)小，繼續(xù)培養(yǎng)后不需要轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)階段即可以伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但苗高矮不等，長(zhǎng)勢(shì)不整齊，不能用于下一階段的培養(yǎng)。楊柳等則證實(shí)NAA單獨(dú)使用時(shí)能促進(jìn)根萌發(fā)，增值率低下。陳彪等證實(shí)不論單獨(dú)使用6-BA或KT，都有可能在一定程度上是分化苗的素質(zhì)有所降低，但當(dāng)6-BA與KT混合使用，即使總量達(dá)到較高水平，不但可望獲得較多的分化苗，而且對(duì)分化苗的素質(zhì)也不會(huì)有顯著影響。1.1.4不同接種量對(duì)甘蔗組培苗增殖的影響除了不同激素種類(lèi)及配比對(duì)甘蔗組培苗增殖有影響外，培養(yǎng)容器的大小、形狀以及相應(yīng)的接種量都會(huì)直接影響到組培苗的質(zhì)量。韋海球在甘蔗脫毒健康組培苗繁育技術(shù)發(fā)展與對(duì)策研究中發(fā)現(xiàn)，接種數(shù)量過(guò)少，則不利于組培苗分化;接種數(shù)量過(guò)多，則組培苗會(huì)慢慢褐變、死亡。研究不同容器的不同最佳接種密度，十分有利于組培苗的生產(chǎn)和效益。1.1.5蔗糖濃度高低對(duì)甘蔗組培苗的影響甘蔗組培苗在培養(yǎng)過(guò)程中，不僅依靠培養(yǎng)基或培養(yǎng)液提供養(yǎng)分，也需要糖分，在人工光照環(huán)境下，進(jìn)行自養(yǎng)異養(yǎng)結(jié)合。蔗糖濃度的高低，也會(huì)影響甘蔗組培苗的增殖擴(kuò)繁。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，蔗糖濃度低，分化苗褐變嚴(yán)重，分化苗弱小，最后甚至死亡;蔗糖濃度高，分化苗能正常生長(zhǎng)，但成本過(guò)高，造成浪費(fèi)，不適合生產(chǎn)上使用。1.2新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)RITA)的應(yīng)用1.2.1RITA系統(tǒng)的歷史發(fā)展該新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)由法國(guó)Vitropic公司研發(fā)。該系統(tǒng)經(jīng)過(guò)大量的實(shí)踐，已經(jīng)進(jìn)行過(guò)一次改良，目前引進(jìn)的是改良后的最新系統(tǒng)。已在咖啡、香蕉、橡膠樹(shù)、土豆等物種中得到成功應(yīng)用。該系統(tǒng)的先進(jìn)行主要體現(xiàn)為：減少培養(yǎng)基更換次數(shù)以及傳統(tǒng)固體培養(yǎng)繼代的勞力成本；便于添加二氧化碳?xì)怏w以及化學(xué)藥物，更有利于實(shí)現(xiàn)無(wú)糖培養(yǎng)以及健康種苗的化學(xué)藥物脫毒；培養(yǎng)液直接浸沒(méi)植株，提高養(yǎng)分吸收效率；每輪浸沒(méi)可更新空氣，透氣性好，減少組織培養(yǎng)玻璃化；修改浸泡的頻率和持續(xù)時(shí)間可有效控制植株發(fā)育的方向（如分蘗、生根等）；無(wú)污染擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。1.2.2RITA的重要性目前我國(guó)甘蔗品種改良更新滯后導(dǎo)致甘蔗生產(chǎn)單一化嚴(yán)重，表現(xiàn)在：一方面主栽品種的長(zhǎng)期種植導(dǎo)致種性退化，另一方面由于品種單一化種植導(dǎo)致甘蔗生產(chǎn)上優(yōu)勢(shì)病蟲(chóng)害小種數(shù)量累積，使得我國(guó)糖料蔗產(chǎn)業(yè)面臨巨大的威脅，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。且由于病蟲(chóng)害傳播造成甘蔗減產(chǎn)等直接經(jīng)濟(jì)損失年均近10億。而脫毒健康種苗技術(shù)是目前在生產(chǎn)上恢復(fù)甘蔗優(yōu)良種性最有效的技術(shù)措施。巴西等國(guó)已有成功的實(shí)例。因此，依托脫毒健康種苗技術(shù)保障我國(guó)蔗糖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展顯得尤為重要。1.2.3RITA的應(yīng)用價(jià)值間歇式培養(yǎng)RITA系統(tǒng)在使用過(guò)程中，能夠有效減少甘蔗健康種苗工廠化生產(chǎn)中的培養(yǎng)基更換次數(shù)以及傳統(tǒng)固體培養(yǎng)繼代的勞力成本；便于添加二氧化碳?xì)怏w以及化學(xué)藥物，更有利于實(shí)現(xiàn)無(wú)糖培養(yǎng)以及健康種苗的化學(xué)藥物脫毒，有利于培養(yǎng)真正全方位脫毒的甘蔗健康種苗；根據(jù)生產(chǎn)需要，修改浸泡的頻率和持續(xù)時(shí)間即可有效控制植株發(fā)育的方向（如分蘗、生根等），可無(wú)須額外改變培養(yǎng)基成分，提高甘蔗組織培養(yǎng)的效率。1.3本研究的目的及意義甘蔗在我國(guó)甚至全世界都是非常重要的糖料作物，傳統(tǒng)的種植方法無(wú)論是品種還是最終的產(chǎn)量，已經(jīng)不能滿足人類(lèi)對(duì)糖量的需求。甘蔗組織培養(yǎng)，將會(huì)是未來(lái)甘蔗生產(chǎn)的主要來(lái)源。Lorenzo等曾在2001年報(bào)道，利用古巴的一個(gè)甘蔗品種一代增殖可達(dá)40倍，這些組培苗在田間的生長(zhǎng)情況也較傳統(tǒng)獲得的組培苗適應(yīng)性更好。Angela等在2009年報(bào)道，利用RITA系統(tǒng)進(jìn)行甘蔗組織培養(yǎng)，組培苗可不受其代數(shù)增加而降低增值能力的影響，從而獲得足夠的初代苗，并且提高甘蔗品種（Q117和Q205）的增值率。而傳統(tǒng)商業(yè)生產(chǎn)方式由于成本較高、勞動(dòng)密集等原因，尚未滿足甘蔗種植業(yè)的需求。大規(guī)模利用間歇式組織培養(yǎng)方法開(kāi)展甘蔗健康種苗的快速繁殖和生產(chǎn)，有望成為甘蔗種植產(chǎn)業(yè)和蔗糖產(chǎn)業(yè)的理想選擇。因此，本研究以法國(guó)Vitropic公司研發(fā)的新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)RITA）為基礎(chǔ)，對(duì)RITA培養(yǎng)中不同因素對(duì)新臺(tái)糖22號(hào)健康種苗快繁的影響進(jìn)行研究。包括不同接種量、激素水平、蔗糖濃度、浸沒(méi)頻率以及不同培養(yǎng)液等對(duì)新臺(tái)糖22號(hào)健康種苗快繁的影響研究，旨在對(duì)新臺(tái)糖22號(hào)的提純、復(fù)壯，在甘蔗良種研發(fā)成功前，延長(zhǎng)新臺(tái)糖22號(hào)的使用壽命，促進(jìn)我區(qū)我國(guó)的糖料蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。2試驗(yàn)材料與方法2.1試驗(yàn)材料及設(shè)備愈傷誘導(dǎo)及材料來(lái)源：廣西大學(xué)試驗(yàn)田中的新臺(tái)糖22號(hào)；福農(nóng)39號(hào)以及美國(guó)帶回來(lái)的18個(gè)美國(guó)品種作為原始實(shí)驗(yàn)材料。增殖材料來(lái)源：GREEN公司的第2代新臺(tái)糖22號(hào)脫毒苗，以及在實(shí)驗(yàn)室利用新臺(tái)糖22號(hào)愈傷組織分化得到的脫毒苗。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：主要試驗(yàn)設(shè)備有RITA培養(yǎng)系統(tǒng)，無(wú)菌操作臺(tái)，高溫滅菌鍋，干凈無(wú)污染的培養(yǎng)室等。RITA設(shè)備包括培養(yǎng)瓶，連接氣管以及空氣泵，工作時(shí)，空氣泵產(chǎn)生過(guò)濾的空氣通過(guò)導(dǎo)氣管進(jìn)入培養(yǎng)瓶，產(chǎn)生的壓力將培養(yǎng)瓶下部的培養(yǎng)液通過(guò)隔層上升，從而達(dá)到浸沒(méi)培養(yǎng)的目的（如圖）。設(shè)備的浸沒(méi)時(shí)間可根據(jù)生產(chǎn)需要調(diào)節(jié)。2.2試驗(yàn)方法2.2.1愈傷誘導(dǎo)愈傷誘導(dǎo)外植體處理在連續(xù)晴天的情況下，采集生長(zhǎng)時(shí)間相同、長(zhǎng)勢(shì)較好、表面無(wú)病蟲(chóng)害的不同品種的蔗株尾梢（甘蔗莖尖）作為原始實(shí)驗(yàn)材料。剝掉表面葉片，在無(wú)菌條件下用75%酒精擦試表面并浸泡30s進(jìn)行表面消毒，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的不同，用0.1%的氯化汞溶液浸沒(méi)20~30min（較幼嫩的尾稍浸沒(méi)時(shí)間應(yīng)較短，而較老的則時(shí)間長(zhǎng)些）。利用無(wú)菌去離子水沖洗3~4次（每次1min），隨后逐層剝離作為處理后的實(shí)驗(yàn)材料。（注：實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水）。不同部位對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響使用處理后的實(shí)驗(yàn)材料22號(hào)和39號(hào)各三根做對(duì)比，每根切取其生長(zhǎng)點(diǎn)基部以上0~10cm的嫩葉鞘，從生長(zhǎng)點(diǎn)基部開(kāi)始算起，每3cm作為一部分，0~3cm是下部，3~6cm是中部，6~9cm是上部（因?yàn)榍腥〉拇笮〔灰?，散開(kāi)以及確定污染等人為誤差，故樣品采集富余1cm）。每一部分用解剖刀切成寬為1mm左右的小塊約30塊，接入MS＋2,4-D3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6~7g/L的固體培養(yǎng)基中，每瓶10塊，共3瓶，無(wú)光照條件下25~28℃培養(yǎng)28天，同一時(shí)間進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。每7天觀察一次，進(jìn)行時(shí)間與總愈傷誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)，以及第28天從愈傷塊的顏色和形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察。（每個(gè)平行27瓶、270塊）不同2.4-D濃度對(duì)不同甘蔗品種愈傷塊誘導(dǎo)的影響使用所有品種的處理后材料各三根，均切取其生長(zhǎng)點(diǎn)基部以上5cm，每根用解剖刀切成寬為1mm左右的小塊約50塊，以10塊/瓶隨機(jī)接入如下4種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，無(wú)光照條件下25~28℃培養(yǎng)28天，同一時(shí)間進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。第28天進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)。（每個(gè)平行9瓶，90塊）D1：2,4-D1mg/L+MS+蔗糖30g/L+瓊脂6~7g/L；D2：2,4-D2mg/L+MS+蔗糖30g/L+瓊脂6~7g/L；D3：2,4-D3mg/L+MS+蔗糖30g/L+瓊脂6~7g/L；D4：2,4-D4mg/L+MS+蔗糖30g/L+瓊脂6~7g/L；2.2.2利用RITA系統(tǒng)進(jìn)行新臺(tái)糖22健康種苗增殖條件優(yōu)化不同培養(yǎng)基增殖效果比較利用固體培養(yǎng)方式，選取無(wú)菌苗作為實(shí)驗(yàn)材料，分別采用不同的基本培養(yǎng)基（MS、1/2MS、3/4MS、N6、B5、NLN）另加6-BA1.0mg/L+30g/L白砂糖+7.5g/L瓊脂，各配制300ml培養(yǎng)基，每瓶30ml共10瓶，滅菌后每瓶接種3株單苗，3次重復(fù)。置于26~28℃，光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)28天，每七天拍照并記錄長(zhǎng)勢(shì)。RITA系統(tǒng)培養(yǎng)最佳接種苗密度試驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)腞OC22號(hào)健康組培苗，共320株單苗進(jìn)行RITA系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，配制增殖培養(yǎng)液3L（培養(yǎng)液配方MS+6-BA1.0mg/L+白砂糖30g/L），分裝至三角瓶中每瓶150ml，滅菌條件121℃，21min，待冷卻后于無(wú)菌操作臺(tái)操作，分別接種5、10、15、20、25、30株每瓶作為不同密度梯度，每種密度做三個(gè)平行。每瓶接種后將培養(yǎng)液倒入RITA瓶中，增殖浸沒(méi)頻率為3min/3h，在26~28℃，光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)40天，從第一天開(kāi)始，每瓶每五天吸取100μL培養(yǎng)液作為樣品稀釋10倍4℃保存，同時(shí)記錄每瓶的總苗數(shù)，最后記錄每株的苗數(shù)（＞0.5cm），并以固體培養(yǎng)作為對(duì)照對(duì)比進(jìn)行對(duì)比。不溶物的稱(chēng)量則將40天后培養(yǎng)液搖晃均勻，吸取5ml過(guò)濾，利用千分之一天平稱(chēng)重。不同接種密度硝態(tài)氮消耗試驗(yàn)接種密度同上設(shè)計(jì)，從第一天開(kāi)始，每瓶每五天吸取100μL培養(yǎng)液，稀釋10倍后于4℃保存，待樣品全部采集完畢，將培養(yǎng)液稀釋液再稀釋50倍后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。6-BA與KT激素水平、蔗糖濃度和浸沒(méi)時(shí)間的優(yōu)化在確定最佳接種密度基礎(chǔ)上，優(yōu)化RITA系統(tǒng)各參數(shù)，如培養(yǎng)液配方、激素水平、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液浸沒(méi)時(shí)間、褐化物及其它代謝固體物質(zhì)積累速度等。根據(jù)6-BA、KT、蔗糖、浸沒(méi)時(shí)間4個(gè)因素間的濃度設(shè)立正交組合，PH=5.8-6.0，采用,L16(44)設(shè)計(jì)，進(jìn)行4因素4水平的正交試驗(yàn)，各激素糖量水平設(shè)置，用不同的激素水平、蔗糖濃度和浸沒(méi)時(shí)間組合在RITA培養(yǎng)瓶中進(jìn)行增殖，設(shè)置每組4瓶，每瓶10株單苗，培養(yǎng)時(shí)間待定，根據(jù)培養(yǎng)液顏色以及養(yǎng)分消耗，有效分蘗，幼苗質(zhì)量等判斷組合取舍，找出蔗苗培養(yǎng)各因素的最佳組合。正交試驗(yàn)水平設(shè)置如下：6-BAmg/lKTmg/l蔗糖（g/L）浸沒(méi)時(shí)間（1min/h）00010.20.21030.40.42060.60.630適于RITA系統(tǒng)培養(yǎng)與化學(xué)脫毒結(jié)合的藥物篩選從田間收集甘蔗梢腐病病葉，在超凈工作臺(tái)上將葉片經(jīng)75%酒精表面消毒處理，隨后用剪刀將病葉剪成1cm左右大小接種于土豆培養(yǎng)基，待菌斑長(zhǎng)出來(lái)后挑取最相似的病斑進(jìn)行LB液體培養(yǎng)以進(jìn)行單孢分離，分離后的單孢菌落經(jīng)過(guò)ITS測(cè)序確認(rèn)后再接種于土豆培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，待菌絲剛生長(zhǎng)至平板邊緣時(shí)，利用課題組已有的一批化學(xué)藥劑（濃度均為1mg/L）采用表面噴施的方法初步篩選化學(xué)藥物。3結(jié)果分析3.1不同部位對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響表1：22、39號(hào)不同部位愈傷誘導(dǎo)率及顏色形態(tài)統(tǒng)計(jì)品種部位總接種塊數(shù)愈傷塊數(shù)愈傷誘導(dǎo)率%愈傷組織顏色（形態(tài)）白（水漬）黃（顆粒）褐化（死亡）22上27051.9A41265中27014754.4C41106123下27024088.9D661743039上270197.0B190251中27025795.2E251613下27026497.8E250146注:表中不同大寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.01)。從圖1中可以看出22號(hào)和39號(hào)相同部位的愈傷誘導(dǎo)曲線的趨勢(shì)大致相同，但39號(hào)的愈傷誘導(dǎo)總數(shù)要高于22號(hào)，證明39號(hào)的愈傷誘導(dǎo)能力要比22號(hào)強(qiáng)。而不同部位的愈傷誘導(dǎo)速率不同，下部的愈傷誘導(dǎo)速率在5~10天達(dá)到最快，中部的則為10~15天達(dá)到最值。從圖1和表1中均可得到愈傷總塊數(shù)的比較為22上＜39上＜22中＜22下＜39中＜39下。其中從表1可以看出，22號(hào)上中下三個(gè)部位的愈傷誘導(dǎo)率在0.01水平有極顯著性差異，其中下部的誘導(dǎo)率最大為88.9%，其次是中部為54.4%，上部最低為1.9%；39號(hào)上部與中部，上部與下部的愈傷誘導(dǎo)率在0.01水平有極顯著性差異，其中下部的誘導(dǎo)率最大為97.8%，其次是中部為95.2%，上部為7.0%。從愈傷組織誘導(dǎo)率來(lái)看22號(hào)與39號(hào)的上部部位在本次實(shí)驗(yàn)條件下不適用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織。而隨著越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的部位，越適宜進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。圖1：22、39號(hào)不同部位總愈傷誘導(dǎo)率與時(shí)間關(guān)系圖通過(guò)愈傷顏色形態(tài)的統(tǒng)計(jì)觀察（圖2），新臺(tái)糖22號(hào)所產(chǎn)生的愈傷組織以黃色顆粒狀的居多，愈傷組織生長(zhǎng)的比較緊湊且干燥；而福農(nóng)39號(hào)則以白色水漬狀的居多，不易分離，而且愈傷塊較大，相同條件下福農(nóng)39號(hào)愈傷組織的體積約為新臺(tái)糖22號(hào)的2倍以上。由此可見(jiàn)，福農(nóng)39號(hào)的可愈性明顯好于新臺(tái)糖22號(hào)，但根據(jù)后續(xù)的分化實(shí)驗(yàn)表明新臺(tái)糖22號(hào)的愈傷塊很容易分化出甘蔗幼苗，22.下22.22.下22.中22.上22中22上2222中2222下圖2ROC22號(hào)上中下部位愈傷誘導(dǎo)圖片3.2不同2.4-D濃度對(duì)不同甘蔗品種愈傷塊誘導(dǎo)的影響從圖3及表2中可以看出除了US23和US24兩個(gè)品種外，其他品種甘蔗在不同濃度激素下的愈傷誘導(dǎo)率均大于50%，在相同環(huán)境以及培養(yǎng)條件下，不同甘蔗品種的愈傷誘導(dǎo)率是不同的，而不同2，4-D濃度對(duì)一些甘蔗品種的愈傷誘導(dǎo)率大小是有顯著或極顯著的影響，也有一部分無(wú)顯著影響。圖3：不同甘蔗品種在不同2.4-D濃度下的愈傷誘導(dǎo)率直觀分析圖其中，在本次實(shí)驗(yàn)2，4-D濃度范圍中，US1和US23兩個(gè)品種較符合激素的兩重性，US1US2US8US10US17US21US23US24US31在0.01水平有極顯著性差異；US9US16在0.05水平有顯著性差異；不同2，4-D濃度下，US3、US13、US19、US25、US33、US34、US37、ROC22和福農(nóng)39號(hào)的愈傷誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異性，而且平均值均大于90%。但經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，雖然不同濃度激素下均有愈傷塊被誘導(dǎo)出來(lái)，可是它們的大小、形態(tài)、褐化情況以及每塊組織的誘導(dǎo)愈傷面積不相同，所以即使在無(wú)顯著差異的誘導(dǎo)率下，也不能說(shuō)明不同2，4-D濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)情況無(wú)影響，當(dāng)2,4-D濃度為1-2mg/L時(shí)，可有效降低愈傷變異率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，22號(hào)及39號(hào)從生長(zhǎng)點(diǎn)開(kāi)始0~7cm的嫩葉鞘作為愈傷誘導(dǎo)的材料較好，而對(duì)于不同品種如果進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，推薦使用生長(zhǎng)點(diǎn)0~5cm長(zhǎng)度的嫩葉鞘。其生長(zhǎng)周期為21天左右。對(duì)于不同甘蔗品種的愈傷誘導(dǎo)，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索最佳激素濃度，以獲得數(shù)量多、質(zhì)量好的愈傷組織為目的。而再分化實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用黃色顆粒狀的愈傷組織。表2美國(guó)品種和ROC22、福農(nóng)39在不同濃度激素培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率（單位：%）品種濃度（mg/l）平均1234151.1A77.8C92.2D65.6B71.7268.9A95.6B94.4B93.3B88.1395.695.694.493.394.7853.3A71.1B94.4C64.4B70.8966.7a81.1b91.1c93.3c83.11095.6B95.6B91.1B80.0A90.61396.797.898.995.697.21697.8b98.9b95.6ab91.1a95.81797.8B98.9B95.6B63.3A88.91996.795.698.995.696.72191.1B93.3B97.8B51.1A83.32332.2B53.3D43.3C22.2A37.82481.1D53.3C41.1B24.4A502592.296.797.896.795.83195.6C82.2B71.1A65.6A78.63397.896.797.895.696.93495.698.996.795.696.73796.797.898.995.697.2ROC2294.497.897.893.395.8福農(nóng)3997.897.898.996.797.8（注:表中數(shù)字后不同大寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.01)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，無(wú)字母表示無(wú)差異性。）3.3RITA系統(tǒng)培養(yǎng)接種苗密度試驗(yàn)結(jié)果分析通過(guò)表3：總苗數(shù)30>10>25>5>15>20>固體；而增殖率1*5>1*10>1*30>1*15>1*25>1*20；通過(guò)圖4：總根數(shù)1*10>1*30>1*20>1*5>1*15>1*25。結(jié)果表明，RIAT系統(tǒng)接種苗數(shù)是10根/瓶時(shí)增殖系數(shù)第二，總苗數(shù)第二，但總根數(shù)第一，15根/瓶和20、25根/瓶則生長(zhǎng)空間明顯不足，培養(yǎng)液更容易褐化，生長(zhǎng)后期組培苗容易產(chǎn)生黃葉并迅速死亡；5根苗/瓶時(shí)增殖系數(shù)第一，但總苗數(shù)第四。如果接種密度定為1*30，總苗數(shù)第一，總根數(shù)第二，但操作時(shí)間長(zhǎng)，染菌幾率高，如果染菌損失量大，所以綜合上述原因選定1*10為增殖時(shí)的最佳接種密度因此，接種10根/瓶最佳。而通過(guò)計(jì)算可以看出不溶代謝物的差距不大，而且與增殖率的關(guān)系并不太明確，但對(duì)增值率確實(shí)有一定的影響。表3不同接種密度的總苗數(shù)、增殖系數(shù)每瓶苗數(shù)51015202530固體平均增殖量79.918.120.613.30.01水平DCBABABBA0.05水平edcabbcca總數(shù)11981746907896135618536000.01水平CEBBDFA0.05水平cebbdfa不溶物質(zhì)量（g）1.7881.3681.7431.8181.6441.353圖4不同接種密度生根數(shù)3.4不同接種密度硝態(tài)氮消耗試驗(yàn)結(jié)果分析通過(guò)圖5可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，同一接種密度的吸光度減少，也就是硝態(tài)氮消耗量增加；接種密度越大，吸光度下降越快，其硝態(tài)氮含量也就越少，可以細(xì)化實(shí)驗(yàn)的采樣天數(shù)，通過(guò)測(cè)定硝態(tài)氮的吸光度來(lái)估算增殖量。在第21天左右，硝態(tài)氮消耗量在15~37%，40天消耗硝態(tài)氮消耗量在41~58%，所以計(jì)劃選用1/2MS以及3/4MS作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并以MS培養(yǎng)基為對(duì)照。圖5：不同接種密度培養(yǎng)液中硝態(tài)氮含量與時(shí)間的關(guān)系圖3.5不同培養(yǎng)基增殖倍數(shù)比較圖6：不同培養(yǎng)基增殖倍數(shù)比較通過(guò)觀察，接種第二天B5、NLN培養(yǎng)基就全部染菌，所以不適用于培養(yǎng)甘蔗組培苗，N6培養(yǎng)基1-7天時(shí)與MS長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，但之后N6就處于一種停滯狀態(tài)，不生長(zhǎng)也不死亡；1/2MS和3/4MS與對(duì)照組MS培養(yǎng)基形態(tài)上無(wú)太大差異。通過(guò)計(jì)算以及經(jīng)過(guò)LSD分析得到1/2MS和3/4MS與對(duì)照組MS培養(yǎng)基這三種培養(yǎng)基在0.05水平上均無(wú)顯著性差異。所以可以選用1/2或3/4MS培養(yǎng)基代替MS培養(yǎng)基，進(jìn)行之后實(shí)驗(yàn)。3.66-BA與KT激素水平、蔗糖濃度和浸沒(méi)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果分析表5不同激素水平、蔗糖濃度以及間歇頻率的正交試驗(yàn)直觀分析試驗(yàn)號(hào)A（6-Bamg/L)B(KTmg/L)CD(g/L)E(浸沒(méi)間歇時(shí)間3min/xh)增殖系數(shù)11111102122222.23133334.94144444.952123410.862214314.37234121.182432112.793134216.410324311411331243.81234213113414233.414423140154324115.9164413210.1K13.0007.6507.0500.52510.650K29.7257.6257.4755.5257.450K38.8006.4258.5009.9505.900K47.3507.1755.85012.8754.875R6.7251.2252.65012.3505.775從表5中可以看出，蔗糖濃度與增殖量成正比例關(guān)系，而浸沒(méi)間歇時(shí)間與增殖量成反比例關(guān)系。所選擇的2個(gè)激素因子中，隨著6-BA濃度的不斷增加，組培苗增殖系數(shù)上升，在6-BA濃度為0.2mg/L時(shí)，其均值達(dá)到最大，但從交互作用表6中則發(fā)現(xiàn)6-BA為0.4，KT為0的時(shí)候，是最大值這個(gè)有待參考；而隨著KT濃度的上升，增殖系數(shù)先上升后下降，差幅不大，相對(duì)比6-BA，KT可以算為誤差項(xiàng)。從直觀分析表5中可以看出，除了蔗糖因素之外，6-BA因素極差最大，其次到浸沒(méi)間歇時(shí)間的影響，而KT極差最小，這反映出不同激素對(duì)增殖系數(shù)的影響程度是不同的。圖76-BA、KT、蔗糖和浸沒(méi)間歇時(shí)間效應(yīng)曲線圖表6交互作用表從直觀分析表5中可以看出最大值為實(shí)驗(yàn)9的這組，0.4、0、30、3，與之前實(shí)驗(yàn)條件基本相似。而正交試驗(yàn)四個(gè)因素每項(xiàng)的最優(yōu)水平為2、1、4、1，從效應(yīng)曲線圖中可以看出KT可以算為誤差項(xiàng)，對(duì)增殖的影響不大，蔗糖濃度與增殖量成正比，而浸沒(méi)間隔時(shí)間與增殖量成反比，除KT外其它三項(xiàng)均有顯著性影響。結(jié)論：接種密度為10株/瓶時(shí)，增殖系數(shù)、總苗數(shù)及養(yǎng)分消耗培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)的其它最佳參數(shù)組合為培養(yǎng)時(shí)間為21天左右，培養(yǎng)液配方為3/4MS培養(yǎng)基+6-BA0.4mg/L+蔗糖20g/L、浸沒(méi)間隔時(shí)間為3min/3h。3.7化學(xué)藥物篩選結(jié)果從圖8初步篩選結(jié)果表明，LincanycinHydrochloride鹽酸林可霉素（潔霉素）、Cefalexin（頭孢氨芐）、Pasiniazid對(duì)氨水楊酸煙肼、Berberine鹽酸小檗堿、代森錳鋅、多菌靈等對(duì)甘蔗梢腐病菌菌絲的生長(zhǎng)抑制效果最好，可用于甘蔗健康種苗RITA生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行脫毒。圖8不同藥物不同劑量對(duì)cno-1梢腐病菌生長(zhǎng)的影響3.8無(wú)糖或低糖培養(yǎng)按照實(shí)驗(yàn)4中蔗糖濃度的不同梯度處理（即0、10、20、30g/L）結(jié)果，蔗糖濃度為0g/L時(shí)，無(wú)激素時(shí)，培養(yǎng)2-3天出現(xiàn)黃化，隨后死亡，即便有激素1周左右也會(huì)出現(xiàn)黃化，隨后死亡。低糖濃度（即蔗糖濃度為10g/L）培養(yǎng)時(shí)植株略矮小、細(xì)、簇生。中糖濃度（即蔗糖濃度為20g/L）和正常濃度（即蔗糖濃度為30g/L）則生長(zhǎng)正常。但通過(guò)LSD分析驗(yàn)證了組1與組2、3、6、9沒(méi)有顯著性差異，也就是說(shuō)20蔗糖在接種密度較低時(shí)與30蔗糖沒(méi)有顯著性差異，而我們?cè)谑褂肦ITA系統(tǒng)時(shí)的接種密度也是較低的，因此，蔗糖濃度可調(diào)整為15-20g/L的中低水平，有效降低了蔗糖使用濃度，在保障健康種苗正常增殖的基礎(chǔ)上降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。4討論新型間歇式組織培養(yǎng)系統(tǒng)（RITA），經(jīng)過(guò)二次改造，適用范圍大大增加，已在咖啡、香蕉、橡膠樹(shù)、土豆等物種中得到了成功的應(yīng)用，VITROPIC公司在大量的研究試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，利用RITA系統(tǒng)培養(yǎng)咖啡苗其同樣的增值速率比傳統(tǒng)的培養(yǎng)的要少一半的時(shí)間；Angela等在2009年報(bào)道，利用RITA系統(tǒng)進(jìn)行甘蔗組織培養(yǎng)，組培苗可不受其代數(shù)增加而降低增值能力的影響，從而獲得足夠的初代苗，并且提高甘蔗品種（Q117和Q205）的增值率。我們的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，RITA系統(tǒng)組培苗分化幼苗的時(shí)間要比傳統(tǒng)方法的提前2-3天，增殖量也比傳統(tǒng)方法高3-4倍。組培苗培養(yǎng)的過(guò)程中，除了選用合適的設(shè)備，接種密度、激素配比和糖分含量也是十分重要。通過(guò)正交試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)RITA接種密度為10株/瓶時(shí)，增殖系數(shù)、總苗數(shù)及養(yǎng)分消耗培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)的其它最佳參數(shù)組合為培養(yǎng)時(shí)間為21天左右，培養(yǎng)液配方為3/4MS培養(yǎng)基+6-BA0.4mg/L+蔗糖20g/L、浸沒(méi)間隔時(shí)間為3min/3h。在這樣條件下培養(yǎng)出來(lái)的新臺(tái)糖22號(hào)甘蔗組培幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，后期也容易生根，且RITA培養(yǎng)方式所帶的根系明顯好些，須根較為旺盛；而固體培養(yǎng)的根系主根細(xì)長(zhǎng)，須根較少。在培養(yǎng)過(guò)程中，因?yàn)镽ITA系統(tǒng)本身的優(yōu)勢(shì)，即組培苗受其代數(shù)增加而增值能力降低的現(xiàn)象（一般組配方法組培苗代數(shù)不超過(guò)6代），RITA組培苗在10代以后仍然可以保持較高的增值率，這將會(huì)是RITA甘蔗健康種苗生產(chǎn)的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)。在利用RITA系統(tǒng)對(duì)新臺(tái)糖22號(hào)甘蔗組培苗的快速繁殖中，我們發(fā)現(xiàn)RITA系統(tǒng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)越于傳統(tǒng)的甘蔗組培苗方法。傳統(tǒng)的甘蔗組培方法由于它自身需要的勞動(dòng)力大、成本高等缺點(diǎn)，將無(wú)法滿足未來(lái)機(jī)械化、集約化的甘蔗種植要求，突破勢(shì)在必行；RITA系統(tǒng)的先進(jìn)性、優(yōu)越性，也將會(huì)在未來(lái)得到更好的驗(yàn)證。參考文獻(xiàn):[1]AngelaMM,JeanAB,PrakashL.etal.Developmentofatemporaryimmersionsystem(RITAR)formassproductionofsugarcane(Serspecifichybrids)[J].InVit