腫瘤基因及其調(diào)控機制專家講座

腫瘤基因及其調(diào)控機制腫瘤基因及其調(diào)控機制第1頁第一節(jié)癌基因

一、癌基因基本概念逆轉(zhuǎn)錄病毒研究對于說明人類癌癥發(fā)生機理含有主要意義。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中除了病毒本身復制所必需基因，如編碼病毒關(guān)鍵蛋白（gag）、外殼糖蛋白（env）及逆轉(zhuǎn)錄酶（pol）等基因外，還包含一個能引發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化基因。這種基因就是現(xiàn)在為人們所熟知癌基因（oncogene，onc）。腫瘤基因及其調(diào)控機制第2頁

因為最初是在病毒中發(fā)覺，所以稱之為病毒癌基因（v-onc）。以后發(fā)覺，在許多動物正常細胞中都存在著與v-onc相對應DNA序列，稱之為原癌基因（proto－oncogene）或細胞癌基因（c-onc)腫瘤基因及其調(diào)控機制第3頁

現(xiàn)有資料表明：①細胞癌基因與病毒癌基因基本上是同源，但用DNA測序技術(shù)可查明，在二者之間能夠有一個或幾個堿基正確差異。所以現(xiàn)在認為，細胞癌基因是病毒癌基因前體，而病毒癌基因則是細胞癌基因轉(zhuǎn)導翻版；腫瘤基因及其調(diào)控機制第4頁

②細胞癌基因在長久進化過程中極為保守，在無脊椎動物（假如蠅）基因組中就能夠找到與哺乳動物細胞癌基因基本上同源序列。所以實際上在正常情況下，細胞癌基因不但對機體無害，而且可能在發(fā)育過程中，以至于對生命維持起著重大作用：腫瘤基因及其調(diào)控機制第5頁③細胞癌基因在正常細胞中能夠有低水平表示，而在癌組織中與其相對應活化癌基因表示水平卻比它高多。腫瘤基因及其調(diào)控機制第6頁二、癌基因分類較早期分類是依據(jù)癌基因產(chǎn)物在細胞內(nèi)定位，將其區(qū)分為胞質(zhì)癌基因和核癌基因兩大類。伴隨癌基因數(shù)量增加，這一分類顯得不夠完善。近年來，人們趨向于用癌基因蛋白結(jié)構(gòu)與功效及其在細胞內(nèi)定位來進行分類。腫瘤基因及其調(diào)控機制第7頁按照這一標準癌基因可分為五大類：

①生長因子類②酪氨酸激酶類③絲氨酸／蘇氨酸激酶類④GTP結(jié)合蛋白（G蛋白）類⑤核結(jié)合蛋白類腫瘤基因及其調(diào)控機制第8頁Demezuk（1991）對癌基因作了全方面綜述，列出了87種癌基因，并進行了分類。鑒于近年來又有一些新癌基因和抑癌基因出現(xiàn)，對此作了一些增補?，F(xiàn)以其資料為基礎(chǔ)，對五舉癌基因分別介紹以下：腫瘤基因及其調(diào)控機制第9頁1.生長因子類：屬于這異類有sis,int-2等五個癌基因。特點是其產(chǎn)物與一些生長因子極為相同：比如，猴肉瘤病毒v-sis癌基因蛋白產(chǎn)物p28與血小板生長因子（PDGF）β鏈幾乎完全相同。所以sis蛋白可模擬PDGF同其受體結(jié)合，刺激細胞過分增殖。腫瘤基因及其調(diào)控機制第10頁受病毒感染細胞可向周圍分泌生長因子，后者又反過來向分泌它細胞連續(xù)發(fā)放增殖信號，最終造成細胞癌變。這種癌變過程中獨特現(xiàn)象稱為“自分泌”（autocrine)。小鼠乳腺瘤病毒（MMLV）int-2癌基因產(chǎn)物gp27-34類似于成纖維細胞生長因子（FGF），其過分表示可誘發(fā)小鼠乳腺新月形癌。腫瘤基因及其調(diào)控機制第11頁2.酪氨酸激酶類：

屬于這一類癌基因較多，現(xiàn)在較明確有21種。依據(jù)其功效差異，還可分成兩個亞類：

①細胞表面生長因子受體②膜結(jié)合酪氨酸激酶腫瘤基因及其調(diào)控機制第12頁①細胞表面生長因子受體：包含erbB-l，erbB-2/HER/neu等7個癌基因。禽成紅細胞瘤（AEV）病毒癌基因erbB-l蛋白產(chǎn)物pl70與上皮細胞生長因子受體（EGFR）氨基酸序列高度同源。所以，它可模擬EGFR進行工作。即使在沒有外源性刺激時，也能不停地使胞內(nèi)靶蛋白發(fā)生酪氨酸激酶反應，從而連續(xù)地向細胞核發(fā)放增殖信號，造成細胞過分增殖。腫瘤基因及其調(diào)控機制第13頁ErbB-2蛋白產(chǎn)物pl85也與EGFR類似。貓肉瘤病毒癌基因fims蛋白產(chǎn)物gp105～165則與集落刺激因子（CSF-l）受體相同。腫瘤基因及其調(diào)控機制第14頁②膜結(jié)合酪氨酸激酶：包含src-l，abl等14個癌基因。Rous肉瘤病毒（RSV）癌基因src-l蛋白產(chǎn)物pp60是第一個被人們分離，并研究得最多癌蛋白，分子量為60kD，長526個氨基酸殘基，分布在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)。pp60是專一地使蛋白質(zhì)分于中酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化蛋白激酶，稱為酪氨酸專一性蛋白激酶（用P-tyr表示）。腫瘤基因及其調(diào)控機制第15頁在正常細胞中，P-tyr僅占總蛋白磷酸化1／3000（其余由絲氨酸專一性蛋白激酶磷酸化，占90％，還有10％由蘇氨酸專一性蛋白激酶磷酸化），而在被RSV轉(zhuǎn)化細胞中，P-tyr升高了10倍。本亞類中其它癌基因產(chǎn)物也含有P-tyr活性。前述erbB-l等生長因于受體均含有P-tyr活性，因而推測本亞類癌基因也可能參加細胞生長調(diào)控。腫瘤基因及其調(diào)控機制第16頁已知有一個含酪氨酸粘著斑蛋白（vinculin）是pp60P-tyr蛋白激酶底物之一。它位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)吸附斑中，而組成細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)肌動蛋白束恰好固定在吸附斑上。在正常細胞中，粘著斑蛋白磷酸化僅占該蛋白磷酸化1％，而在轉(zhuǎn)化細胞中則上升至20％。同時發(fā)覺在RSV轉(zhuǎn)化細胞株中吸附斑大量降低，其肌動蛋白束結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞。腫瘤基因及其調(diào)控機制第17頁Pp60P-tyr另一個與細胞骨架相關(guān)靶蛋白是p36，它結(jié)合在含有微管蛋白，肌動蛋白和肌球蛋白細胞骨架上，它酪氨酸被pp60P-tyr磷酸化后也可造成細胞骨架破壞。由此可見，RSV病毒轉(zhuǎn)化細胞中src癌基因過分表示，是造成細胞骨架微絲、微管系統(tǒng)破壞主要原因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第18頁3.絲氨酸／蘇氨酸激酶類：關(guān)于這類癌基因只列舉了raf-1,mos和pim-1三種，它們蛋白產(chǎn)物都是定位于胞質(zhì)絲氨酸／蘇氨酸專一蛋白激酶，與第二信使CAMP調(diào)整系統(tǒng)有親密關(guān)系。已知有一個CAMP依賴性蛋白激酶就是絲氨酸專一性蛋白激酶，含有傳遞CAMP信號及調(diào)整基因表示作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第19頁

4.GTP結(jié)合蛋白類

這類包含ras族H-ras，K-ras，N-ras三個癌基因，以及在垂體及卵巢腫瘤中發(fā)覺gsp癌基因。ras族癌基因是當前研究得最多癌基因。從人體腫瘤分離到活化癌基因都屬于ras族，其基因產(chǎn)物p21ras蛋白分子量約21kD，長188~189個氨基酸殘基，分布于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)。含有GTP依賴GTPase活性，其一級結(jié)構(gòu)和生化特征和“G蛋白”十分相同。腫瘤基因及其調(diào)控機制第20頁G蛋白是媒介多肽激素受體信號與細胞內(nèi)效應器腺苷環(huán)化酶之間偶聯(lián)因子，經(jīng)過激活或抑制腺苷環(huán)化酶活性直接或間接地調(diào)整cAMP濃度，進而調(diào)控細胞生長。ras族原癌基因可能象G蛋白一樣參加腺苷環(huán)化酶信號系統(tǒng)調(diào)控。ras族癌基因在12，13或61位氨基酸殘基點突變將使p21ras失去水解活性，并使細胞過分增殖。腫瘤基因及其調(diào)控機制第21頁

5.核蛋白類：屬于這一舉癌基因有myc,myb,fos等12個。其中研究得最為詳盡是c-myc。c-myc最早發(fā)覺于禽粒細胞瘤病毒（AMV）中，并廣泛分布于從酵母到人基因組中。它含有3個外顯子，編碼一個含439個氨基酸，分子量為62kD蛋白質(zhì)。該蛋白定位于細胞核內(nèi)，屬DNA結(jié)合蛋白，可同單鏈或雙鏈DNA結(jié)合。腫瘤基因及其調(diào)控機制第22頁c-myc表示含有組織專一性，細胞周期特異性和發(fā)育階段特異性。在正常組織中c-myc可有低水平表示，而在大多數(shù)實體腫瘤中，其表示顯著增高。在癌前病變和一些良性腫瘤中，也可見到表示增高。普通認為，c-myc擴增是造成原癌基因活化主要路徑。腫瘤基因及其調(diào)控機制第23頁以上資料表明，c-myc蛋白可能是一個調(diào)控細胞增值和分化調(diào)控蛋白，它能夠識別和結(jié)合到基因組中特定識別序列，并活化那些與細胞增殖和分化相關(guān)基因。c-myb也有類似性質(zhì)，主要在造血細胞分化一些特定階段表示，而在一些造血系統(tǒng)腫瘤中其表示可增高。腫瘤基因及其調(diào)控機制第24頁近年來陸續(xù)發(fā)覺了一些新癌基因，它們在癌變過程中起著主要作用：

①int-2②jun③met④PCNA

⑤Ki-67核抗原⑥mdm2腫瘤基因及其調(diào)控機制第25頁①int-2定位于7q31，編碼分子量為27kD蛋白，該蛋白部分結(jié)構(gòu)與成纖維細胞生長因子含有同源性。它含有刺激表皮細胞生長作用，但需要與其它基因協(xié)同才能完成細胞惡性轉(zhuǎn)化。Int-2基因擴增率在乳腺癌中達19％，但擴增倍數(shù)不高。普通認為，該基因高表示與腫瘤轉(zhuǎn)移，復發(fā)和預后不良相關(guān)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第26頁②jun

定位于lp31～32，編碼分子量39kD蛋白。蛋白定位于核內(nèi)。Jun與隨即發(fā)覺junB，junD都是核轉(zhuǎn)錄因子，與c-fos形成轉(zhuǎn)錄調(diào)整復合物，其蛋白產(chǎn)物FOS／Jun能與其它反式因子如視甲醛受體（RAR）、糖皮質(zhì)激素等相互競爭，對轉(zhuǎn)錄起調(diào)整作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第27頁③met定位于7p31，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有各種，分別為9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kbmRNA。蛋白產(chǎn)物主要有兩種，分別為ppl40-145met肝細胞生長因子受體和pp65tpr-met活化融合蛋白。最初確定其為轉(zhuǎn)化基因是在以MNNG處理人骨肉瘤細胞系中，因為l號染色體tpr序列插入到7號染色體met基因形成tpr-met重排而使其活化。腫瘤基因及其調(diào)控機制第28頁其主要功效為促進肝細胞生長及誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化。c-met基因活化與各種腫瘤發(fā)生相關(guān)，其活化機理主要為擴增和重排。現(xiàn)已證實，9.0kbc-metmRNA及其蛋白產(chǎn)物在胃癌和肝癌等腫瘤中表示高出正常組織許多倍，而且表示程度與預后相關(guān)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第29頁④PCNA增殖細胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）是一個在細胞增殖周期中合成和表示36kD蛋白質(zhì)，主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在細胞核內(nèi)聚集，所以進入細胞周期正常細胞和腫瘤細胞都含有PCNA。采取PCNA單抗定位研究PCNA，能夠作為判斷細胞增殖情況和預后一個伎倆。腫瘤基因及其調(diào)控機制第30頁⑤Ki-67核抗原

Ki-67存在于增殖細胞核內(nèi)，在G1中期開始表示，S期和G2期增多，M期到達高峰，G0期細胞陰性，所以Ki-67在調(diào)整細胞增殖中起主要作用。用免疫組化法證實，癌組織中陽性細胞數(shù)顯著高于正常細胞和良性腫瘤，所以對判別良惡性病變有一定實際意義。Ki-67表示水平高低與腫瘤預后之間也有親密關(guān)系。腫瘤基因及其調(diào)控機制第31頁⑥mdm2

mdm2基因最初是從一個含有雙微體（DM）自發(fā)轉(zhuǎn)化BALB／3T3細胞系中克隆出來一個高度擴增基因，定位于12ql3～14上，該基因全長由2372個堿基對組成，編碼區(qū)全長1473個堿基，編碼一個長度為491個氨基酸踐基蛋白質(zhì)，分子量為90kD。腫瘤基因及其調(diào)控機制第32頁動物試驗己證實，mdm2可使細胞轉(zhuǎn)化并含有成瘤性。在一些惡性軟組織腫瘤，骨和腦腫瘤中發(fā)覺了mdm2擴增，說明其可能與這些腫瘤發(fā)生相關(guān)。mdm2癌基因不但可經(jīng)過擴增而直接致癌，而且可作用于抑癌基因p53使正常p53失活而間接致癌。腫瘤基因及其調(diào)控機制第33頁三、癌基因活化機理

細胞癌基因存在于正常細胞中，但在正常情況下并不表現(xiàn)出致癌性，只有在各種外因和內(nèi)因作用下使細胞癌基因活化，才能造成腫瘤發(fā)生，癌基因活化機理可能各種多樣，但主要有以下6種：腫瘤基因及其調(diào)控機制第34頁1.轉(zhuǎn)導（transduction）2.點突變（pointmutation）3.插入突變（insertionalmutation)4.易位(translocation)5．基因擴增（geneamplification）6.基因甲基化改變

腫瘤基因及其調(diào)控機制第35頁

1.轉(zhuǎn)導（transduction）在漫長生物進化過程中，現(xiàn)在逆轉(zhuǎn)錄病毒祖先在感染正常細胞同時，經(jīng)過復雜遺傳學重組和突變，將正常細胞細胞癌基因整合到其基因組中，并使之改變成活化病毒癌基因。帶有病毒癌基因逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染適當動物時，可使之發(fā)生腫瘤。腫瘤基因及其調(diào)控機制第36頁2.點突變（pointmutation）美國Weinberg，Wigler和Cooper等試驗室于1983年分別從不一樣膀胱癌細胞系中分離DNA，用以轉(zhuǎn)染NIH／3T3細胞系，可使之發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。從轉(zhuǎn)化細胞中已分離到活化癌基因分子克隆，并證實其與Harvey鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras）非常相同。腫瘤基因及其調(diào)控機制第37頁在人類正常細胞中也發(fā)覺了其對應物(c-Ha-ras),Barbacid與Weinberg研究組分別發(fā)覺，膀胱癌中活化癌基因與其對應正常癌基因之間只有一個堿基正確差異，即(c-Ha-ras)基因第一個外顯子(exon)所編碼多肽鏈氨基端第12位密碼子上發(fā)生了有突變，其鳥瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其編碼甘氨酸被氨酸所取代。這一單個堿基正確點突變，看來就是正常細胞癌基因變成活化癌基因關(guān)鍵。腫瘤基因及其調(diào)控機制第38頁3.插入突變（insertionalmutation)

逆轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒形式插入到宿主細胞癌基因鄰近而將其激活。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第39頁在這方面最經(jīng)典例子是禽白血細胞增多癥病毒（AW）。新生雛雞在感染ALV后6～12月才產(chǎn)生腫瘤，在癌前期觀察到法氏囊中大量細胞受到病毒感染，而且ALVDNA插入到不一樣細胞基因組不一樣位點。腫瘤基因及其調(diào)控機制第40頁不過，在腫瘤細胞中前病毒DNA卻存在于全部細胞基因組同一位點，說明它們是由ALVDNA插入基因組適當位點一個細胞所形成克隆。在腫瘤細胞中ALVDNA可發(fā)生部分缺失，但最少項保留一部分。腫瘤基因及其調(diào)控機制第41頁Hayward等深入證實，在大多數(shù)腫瘤中ALV前病毒插入到細胞癌基因5`端，并處于相同轉(zhuǎn)錄方向。ALV前病毒長末端序列（LTR）經(jīng)常缺失或失活，所以可能其3`端LTR為轉(zhuǎn)錄提供強有力開啟子，從而產(chǎn)生大量與前病毒DNA相連c-myc序列。腫瘤基因及其調(diào)控機制第42頁在有些情況下，前病毒雖插入到c-myc5`端，但處于相反轉(zhuǎn)錄方向，或插入到3`端而處于相同轉(zhuǎn)錄方向。這兩種情況也可加強c－mvc轉(zhuǎn)錄，但其作用機理尚不太清楚。腫瘤基因及其調(diào)控機制第43頁同時CooPer等發(fā)覺，從這類腫瘤中提取DNA可轉(zhuǎn)化NIH／3T3細胞，但奇怪是，從中分離到轉(zhuǎn)化基因既不是ALVDNA，也不是活化c-myc，而是位于另一位點片段，稱之為Blym，它編碼一個分子量約為7kD多肽。由此可見，在誘發(fā)腫瘤中最少包括兩個癌基因活化。腫瘤基因及其調(diào)控機制第44頁4.易位(translocation)在人類巴基特淋巴瘤細胞系中，發(fā)覺第8號染色體長臂遠端片段易位至第2，22和14號染色體一定部位。腫瘤基因及其調(diào)控機制第45頁現(xiàn)有資料證實，這些部位分別含有免疫球蛋白輕鏈Igκ,Igλ和以及重鏈IgH基因。因為這些部位經(jīng)常進行著活躍轉(zhuǎn)錄，能夠提供強有力開啟子，而易位第8號染色體片段已證實含有細胞癌基因c-myc,能夠被相鄰開啟子活化。腫瘤基因及其調(diào)控機制第46頁還有資料指出．易位c-myc3`端與免疫球蛋白基因3`端相連。這一情況類似于上述ALV前病毒插入，即c-myc插入到開啟子下游，但處于相反轉(zhuǎn)錄方向。腫瘤基因及其調(diào)控機制第47頁5．基因擴增（geneamplification）

在人慢粒白血病細胞系（HL-60）中，發(fā)覺了c-myc擴增，表現(xiàn)為雙微體（dounleminutes，DMs）和均染區(qū)（Homogeneousstaningregion,HSR）形成，可經(jīng)過原位雜交法加以證實。腫瘤基因及其調(diào)控機制第48頁6.基因甲基化改變

在腫瘤細胞中可發(fā)覺癌基因和抑癌基因甲基化改變，表現(xiàn)為癌基因低甲基化或去甲基化，或抑癌基因異常甲基化。有報道在胃癌細胞中發(fā)覺了c-Ha-ras癌基因低甲基化，而低甲基化可造成c-Ha-ras癌基因過分表示。腫瘤基因及其調(diào)控機制第49頁第二節(jié)抑癌基因抑癌基因(antioncogene)過去常稱之為腫瘤抑制基因（tumorsuppressorgene）。關(guān)于抑癌基因存在概念由來以久，人們最初從腫瘤細胞染色體特定部位缺失推測它存在。腫瘤基因及其調(diào)控機制第50頁細胞遺傳學發(fā)展在這方面提供了深入證據(jù)。當用正常細胞同腫瘤細胞雜交，或?qū)⒛骋粭l正常細胞染色體導人腫瘤細胞中時，觀察到腫瘤細胞惡性表型受到抑制，從而推測在正常細胞染色體上存在著抑癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第51頁但最終確定其存在，必須分離到抑癌基因，并對其結(jié)構(gòu)與功效進行詳細分析。1986~l987年國際上有3個試驗室成功地分離到第一個抑癌基因——Rb基因cDNA克?。畯亩挂职┗蜓芯窟M入了分子生物課時代。腫瘤基因及其調(diào)控機制第52頁近年來又陸續(xù)發(fā)覺了一些新抑癌基因。當前對抑癌基因尚無明確分類，但近年來因為抑癌基因數(shù)量增多，而其中一些基因在功效上與傳統(tǒng)抑癌基因有很大不一樣，為便于了解起見，現(xiàn)將其分成兩大類：

腫瘤基因及其調(diào)控機制第53頁表現(xiàn)為喪失功效抑癌基因（傳統(tǒng)抑癌基因）

Rb基因FAP相關(guān)抑癌基因p53基因p21Cipl基因p73基因p27Kipl

NF1基因FHIT基因WT1基因PTENErbA基因Kreyl基因DPC4基因INK4基因腫瘤基因及其調(diào)控機制第54頁參加DNA修復抑癌基因（新發(fā)覺抑癌基因）

錯配修復基因BRCA1基因ATM基因腫瘤基因及其調(diào)控機制第55頁

一、表現(xiàn)為喪失功效抑癌基因1.Rb基因

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)是嬰幼兒眼惡性腫瘤中最常見一個。大量研究資料證實，位于人類細胞第13號染色體長臂13ql4區(qū)域視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因（retinoblastomasusceptibilitygene，Rb）缺失或失活，是造成腫瘤發(fā)生主要原因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第56頁

腫瘤基因及其調(diào)控機制第57頁Rb基因在遺傳學上是隱性，即必須兩個等位基因同時缺失形成所謂缺失純合子，或一個等位基因缺失而另一基因突變而失活，才能造成基因功效喪失。腫瘤基因及其調(diào)控機制第58頁等位基因缺失或失活可由以下情況引發(fā)：

染色體丟失（13-）染色體部分缺失（13q-）等位基因突變（13qRB→I3qrb）腫瘤基因及其調(diào)控機制第59頁所以，腫瘤細胞基因型有以下幾個可能性：

13qrb／13qrb13qrb／13q-13qrb／13-13q-／13q-13-／13-腫瘤基因及其調(diào)控機制第60頁相關(guān)脂酶D（esteraseD，ED）研究究揭示了一個饒有興趣現(xiàn)象。一些視網(wǎng)膜母細胞瘤患者紅細胞脂酶D活性只有正常人二分之一，而在瘤細胞中則其活性為0。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第61頁這一現(xiàn)象提醒，脂酶D基因與Rb基因緊密連鎖，Rb基因缺失造成脂酶D活性對應下降。腫瘤基因及其調(diào)控機制第62頁同時提醒，在體細胞中可能只有一個等位基因缺失，而另一個則是正常，其基因型可能是13q-／l3RB。體細胞中正常等位基因如發(fā)生突變而失活，則可造成腫瘤發(fā)生，其基因型變成13q-／l3rb。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第63頁脂酶D研究不但為說明腫瘤發(fā)生機理提供了有力依據(jù)，更主要是，脂酶D基因與Rb基因緊密連鎖，為Rb基因分離鋪平了道路。Lee等于1987年首次成功地分離到了Rb基因cDNA分子克?。耗[瘤基因及其調(diào)控機制第64頁以脂酶D基因組DNA分子克隆為起點，將其兩側(cè)遠端DNA片段作為探針，用染色體步移（Chromosomewalking）方法．從人胚視網(wǎng)膜和胎盤cDNA文庫中篩選Rb相關(guān)基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第65頁經(jīng)過重復篩選，取得了一個與脂酶D相鄰，編碼46kbmRNA基因，定名為視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因，簡稱Rb基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第66頁檢驗了6例視網(wǎng)膜母細胞瘤病人，發(fā)覺其中2例基因完全不表示，其它4例則表示下降，而且表示mRNA分子長度降低至4.0kb左右，對進行序列分析結(jié)果表明，它編碼一個含816氨基酸殘基蛋白，經(jīng)計算機檢索未發(fā)覺與該基因同源序列。腫瘤基因及其調(diào)控機制第67頁以后各國學者對Rb基因結(jié)構(gòu)與功效進行了大量研究：現(xiàn)已明確，Rb基因基因組DNA總長為200kb，有27個外顯子，轉(zhuǎn)錄為4.7kbmRNA，編碼含928氨基酸殘基蛋白質(zhì)，其分子量為110~114kD。腫瘤基因及其調(diào)控機制第68頁常見三種蛋白產(chǎn)物分子量分別為

110kD未磷酸化形式112kD磷酸化形式114kD

腫瘤基因及其調(diào)控機制第69頁其磷酸化程度在細胞周期中發(fā)生周期性改變：G0期、G1期蛋白未磷酸化S期、G2期大多數(shù)蛋白已磷酸化

腫瘤基因及其調(diào)控機制第70頁Rb蛋白磷酸化程度與細胞周期調(diào)整因子cde2／cde28活性呈正相關(guān)。未磷酸化型Rb蛋白可能是抑制細胞增殖活性型。腫瘤基因及其調(diào)控機制第71頁Rb基因可與一些腫瘤病毒轉(zhuǎn)化蛋白形成穩(wěn)定復合物，其中包含SV40抗原，腺病毒EIA蛋白和人乳頭瘤病毒E6/E7蛋白，故可能對腫瘤病毒轉(zhuǎn)化起抑制作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第72頁Rb蛋白還能夠?qū)毎麅?nèi)轉(zhuǎn)錄因子、生長因子起調(diào)控作用：

腫瘤基因及其調(diào)控機制第73頁研究資料表明，在正常細胞內(nèi)可能存在著Rb蛋白靶蛋白。比如，細胞內(nèi)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶能同Rb基因LT/EIA結(jié)合，這種結(jié)協(xié)議Rb蛋白生長抑制功效相關(guān)。一旦Rb蛋白同SV40或腺病毒基因組對應部位結(jié)合，或在位點發(fā)生了點突變，就可能喪失其生理功效。腫瘤基因及其調(diào)控機制第74頁轉(zhuǎn)錄因子E2F也能與Rb蛋白形成復合物，故Rb蛋白可經(jīng)過一樣機理來調(diào)整E2F因子轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第75頁另外，Rb基因可抑制細胞內(nèi)癌基因表示。比如，用Rb基因轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞可抑制c-fos癌基因在G1晚期表示。腫瘤基因及其調(diào)控機制第76頁Rb蛋白還可經(jīng)過同c-myc，N-myc，erbB-2／neu等癌基因產(chǎn)物相結(jié)合來調(diào)整細胞增殖和分化。腫瘤基因及其調(diào)控機制第77頁2．P53基因在過去十幾年里，人們對p53基因認識經(jīng)歷了一個漫長歷程:最初是經(jīng)過在鼠類細胞中p53蛋白與DNA腫瘤病毒抗原結(jié)合而發(fā)覺。腫瘤基因及其調(diào)控機制第78頁隨即克隆到了p53基因，并證實它能轉(zhuǎn)化鼠類細胞，而且發(fā)覺在惡性轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞中，p53基因表示增高。這些資料提醒，p53作用類似于myc或ras，所以可能是一個癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第79頁伴隨研究深入，發(fā)覺了一些矛盾現(xiàn)象。在對大腸癌、肺癌、乳腺癌等實體瘤進行大量細胞遺傳學研究時發(fā)覺，第17號染色體短臂經(jīng)常丟失。按照Knudson關(guān)于抑癌基因作用模式推測，丟失染色體片段中可能存在著抑癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第80頁因為己知p53基因定位于17p13.1，所以有可能成為等位基因丟失靶基因．所以對腫瘤細胞中殘留等位基因進行了序列分析，發(fā)覺絕大多數(shù)殘留p53等位基因己經(jīng)經(jīng)歷了點突變。這種等位／突變模式表明，p33基因很可能象Rb基因那樣，是一個抑癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第81頁深入研究表明，能夠使鼠類細胞發(fā)惡性轉(zhuǎn)化基因?qū)嵸|(zhì)上是突變型p53基因，而野生型p53基因不但不誘發(fā)轉(zhuǎn)化，相反地能抑制轉(zhuǎn)化。腫瘤基因及其調(diào)控機制第82頁依據(jù)現(xiàn)有資料，基因全長16～20kb，由11個外顯子組成．產(chǎn)生長25kbmRNA，編碼含393個氨基酸殘基蛋白，分子量為53kD。腫瘤基因及其調(diào)控機制第83頁蛋白有5個高度保守區(qū)，分別位于第13～19、117～142、171～192、236～258及270～282密碼子區(qū)域。基因突變大多數(shù)發(fā)生于外顯子，與上述保守區(qū)基本相符。腫瘤基因及其調(diào)控機制第84頁檢驗等位基因缺失或突變可采取以下幾個方法：①限制性DNA片段長度多態(tài)性分析②單鏈DNA構(gòu)型多態(tài)性分析③直接DNA測序腫瘤基因及其調(diào)控機制第85頁①限制性DNA片段長度多態(tài)性（restrictionDNAfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析：

提取DNA，用適當限制性內(nèi)切酶酶解，再用電泳分離。正常細胞兩個等位基因是雜合，因而顯示不一樣帶型。假如有一個等位基因缺失，就會顯示單一帶型，這種現(xiàn)象稱為雜合性丟失（lossofheterozygosity,LOH）；腫瘤基因及其調(diào)控機制第86頁②單鏈DNA構(gòu)型多態(tài)性（singleStrandconformationpolymorphism,SSCP）分析：正常細胞在變性后，經(jīng)聚丙烯酸胺凝膠電泳，展現(xiàn)一定帶型。如其中某一個單鏈發(fā)生了突變，就可使單鏈構(gòu)型發(fā)生改變，結(jié)果使其電泳速度發(fā)生改變，造成額外電泳帶出現(xiàn)；

腫瘤基因及其調(diào)控機制第87頁③直接DNA測序：

因為突變經(jīng)常發(fā)生于第5～8外顯子，故可設(shè)計這4個外顯子上下游引物進行聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）擴增，然后分別進行DNA測序（DNAsequencing）。用這一技術(shù)不但能夠測定等位基因缺失或突變性質(zhì)，還可對其進行準確定位。腫瘤基因及其調(diào)控機制第88頁正常野生型p53（wtp53）基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不穩(wěn)定，半衰期僅20分鐘，而突變型p53（mp53）半衰期則延長至1.4～7小時，所以如用原位雜交或免疫組化方法來檢測，則不能檢測到wtp53。而只能檢測到mp53mRNA和蛋白。腫瘤基因及其調(diào)控機制第89頁只有wtp53蛋白才含有抑癌活性，mp53蛋白則不但喪失了抑癌活性，而且還能與wtp53蛋白結(jié)合使其喪失抑癌功效。所以當一個p53等位基因發(fā)生突變時，就足以使細胞展現(xiàn)惡性表型。腫瘤基因及其調(diào)控機制第90頁這一點與必須兩個等位基因同時失活不一樣，說明p53基因突變遺傳型是顯性。這一特殊遺傳學現(xiàn)象稱之為顯性負效應（dominantnegativeeffect）。腫瘤基因及其調(diào)控機制第91頁wtp53基因功效是多方面，主要有以下幾面：①轉(zhuǎn)錄因子活性②wtp53信號區(qū)功效腫瘤基因及其調(diào)控機制第92頁①轉(zhuǎn)錄因子活性

p53蛋白是一個轉(zhuǎn)錄因子，可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄活化區(qū)與通用轉(zhuǎn)錄因子（multisubunittranscriptionfactor,TF11D）結(jié)合并相互作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第93頁TF11D是TATA結(jié)合蛋白（TATAbindingprotein.TBP）和TBP相關(guān)因子（TBPassociatedfactor,TAF）結(jié)合而成復合物。與TF11D中TAF結(jié)合，TF11D再經(jīng)過TBP與其下游基因開啟子中TATAbox結(jié)合而發(fā)揮作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第94頁wtp53轉(zhuǎn)錄活性受腺病毒EIB蛋白及癌基因產(chǎn)物MDM2蛋白抑制。MDM2經(jīng)過與wtp53轉(zhuǎn)錄活性區(qū)相互作用而起到抑制mp53活性作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第95頁②wtp53信號區(qū)功效

此區(qū)34個氨基酸中有12個脯氨酸，含5個脯-X-X-脯重復序列，產(chǎn)生一個SH-3區(qū)結(jié)合部位。wtp53基因借助于SH-3區(qū)結(jié)合活性，把它同信息傳遞通道直接聯(lián)絡(luò)起來，激活一些靶基因如p21／WAFI／cip1轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第96頁WAF1蛋白產(chǎn)物p21是細胞周期調(diào)整因子，可有效抑制細胞周期蛋白依賴性激酶活性，從而阻斷細胞周期演進。腫瘤基因及其調(diào)控機制第97頁總之，wtp53正是經(jīng)過其轉(zhuǎn)錄活性和信號傳遞功效而發(fā)揮其抑癌功效，主要表現(xiàn)為調(diào)整細胞周期和誘導細胞凋亡(將在其它章節(jié)中詳細加以敘述)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第98頁3.p73基因p73基因發(fā)覺極為偶然。Kaghad等于1997年在利用針對IRS-l結(jié)合區(qū)寡核苷酸探針與COS細胞cDNA文庫進行雜交分析中，檢出一假陽性克隆它與IRS-l結(jié)合區(qū)無任何同源性，卻與p53基因大部分保守序列均同源。依據(jù)此序列編碼蛋白分子量，將其命名為p73基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第99頁利用熒光原位雜交技術(shù)將基因定位于lp36區(qū)。此區(qū)域因為在神經(jīng)母細胞瘤及其它各種腫瘤細胞中常發(fā)生缺失因而被認為可能存在著某種抑癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第100頁p73基因由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，其表示產(chǎn)物p73蛋白與p53蛋白有同源性：p73蛋白和p53蛋白一樣含有4個主要功效區(qū)，其氨基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與p5329％同源，中部DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與p5363％同源，p536個突變熱點p73也完全保守，寡聚結(jié)構(gòu)域有38％同源，而羧基端則未檢出顯著同源。腫瘤基因及其調(diào)控機制第101頁迄今共發(fā)覺6種p73基因轉(zhuǎn)錄剪切變異體，它們分別為:

p73α

p73β

p73γ

p73δ

p73ε

p73φ腫瘤基因及其調(diào)控機制第102頁p73α由636個氨基酸殘基組成，是全長p73蛋白，p73β則由499個氨基酸殘基組成，這是因為p73基因轉(zhuǎn)錄時將外顯子13剪切而缺失了96個氨基酸殘基，并造成開放讀框改變。p73β除了最終5個氨基酸殘基為其所特有外，其余均與p73α對應序列完全相同。腫瘤基因及其調(diào)控機制第103頁即使哺乳動物p53蛋白與p73蛋白羧基端沒有顯著同源性，不過人p73α蛋白羧基端與最近在無脊椎動物中發(fā)覺p53蛋白同源，說明p53基因可能是從更為原始“p73樣”基因進化而來。腫瘤基因及其調(diào)控機制第104頁利用酵母菌雜交系統(tǒng)研究蛋白各種剪切變異體之間相互作用時，發(fā)覺p73β蛋白形成同源二聚體能力很強，類似于p53，而p73α則很弱。P73α和p73β蛋白與p53之間有較弱異型間相互作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第105頁這些結(jié)果表明，p73蛋白各種剪切變異體能形成同型或異型相互作用，而且提醒這些作用有可能發(fā)生于體內(nèi)，方便協(xié)調(diào)整個p53-p73系統(tǒng)功效。腫瘤基因及其調(diào)控機制第106頁p73基因在染色體上定位特殊性以及其蛋白產(chǎn)物與p53蛋白在結(jié)構(gòu)上相同性，均提醒它可能是一個抑癌基因，而且可能與p53蛋白在功效上有相同性：腫瘤基因及其調(diào)控機制第107頁試驗證實，p73過表示時能抑制細胞生長和誘導細胞凋亡，而其突變體則無此功效。p73還能激活部分p53靶基因，但對絕大多數(shù)p53靶基因其作用則顯著弱于p53基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第108頁比如p73α和p73β對p21誘導水平分別比p53低了6倍和3倍。但有趣是，對一些靶基因如14-3-3a和PIG7誘導水平卻遠遠高于p53。所以，即使p53和p73均能誘導細胞凋亡，但二者造成調(diào)亡信號路徑可能有所不一樣。腫瘤基因及其調(diào)控機制第109頁另外，不一樣型p73蛋白生物功效強弱不一樣，其中以p73β功效最強。腫瘤基因及其調(diào)控機制第110頁伴隨對p73作用分子機理研究深入，發(fā)覺了一些矛盾現(xiàn)象：①在各種腫瘤中均檢測不到p73突變，甚至在一些癌細胞中發(fā)覺了p73高表示；腫瘤基因及其調(diào)控機制第111頁②p73-/-小鼠中見不到腫瘤易患現(xiàn)象，但卻有嚴重發(fā)育異常，尤其是腦和免疫系統(tǒng)。反之，p53-/-小鼠易患腫瘤，卻無顯著發(fā)有異常，這提醒有一更原始基因能夠替換p53而完成小鼠某階段發(fā)育，而這個基因是否就是p73呢？腫瘤基因及其調(diào)控機制第112頁③三種經(jīng)典病毒癌蛋白（SV40大T抗原、腺病毒EIB55kD和HPVE6）均能作用于p53并使之失活，從而使宿主細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，卻不能與p73蛋白相結(jié)合。腫瘤基因及其調(diào)控機制第113頁以上現(xiàn)象說明，p73抑癌和失活分子機理還有待于深入研究說明。腫瘤基因及其調(diào)控機制第114頁4．與家族性腺瘤樣息肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP）相關(guān)抑癌基因FAP過去通常稱之為家族性結(jié)腸息肉?。╢amilialpolyposiscoli,FPC），是一個常染色體顯性遺傳病。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第115頁近年來對FAP與抑癌基因之間關(guān)系研究得較多:

APC(adenomatouspolyposiscoli)基因MCC（mutatedcolorectalcancer）基因DCC（deletedincolorectalcarcinoma）基因腫瘤基因及其調(diào)控機制第116頁APC(adenomatouspolyposiscoli)基因是FAP易感基因，定位于第5號染色體長臂（5q21），由15個外顯子及14個內(nèi)含于組成，其mRNA全長為8535bp，編碼2842個氨基酸殘基蛋白，分子量為500kD，與酵母菌中調(diào)整ras族癌基因基因中一個小片段有同源性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第117頁其基因產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)，APC不但同F(xiàn)AP相關(guān)，而且同散發(fā)性結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤相關(guān)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第118頁

MCC（mutatedcolorectalcancer）基因

也是FAP易感基因，定位于第5號染色體長臂（5q21），由17個外顯子16個內(nèi)含子組成，其mRNA全長為4181bp，編碼829個氨基酸殘基蛋白，分子量為93kD。腫瘤基因及其調(diào)控機制第119頁在染色體上與APC相鄰，同G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿蕈毒堿受體一小片段有很高同源性。MCC不但同F(xiàn)AP及結(jié)腸癌相關(guān)，還同小細胞肺癌及非小細胞肺癌等相關(guān)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第120頁DCC（deletedincolorectalcarcinoma）基因定位于18號染色體長臂（18q21.3），基因全長約370kb其mRNA長10～12kb，編碼含750個氨基酸殘基蛋白，分子量為190kD。其序列同神經(jīng)細胞粘附分子有同源性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第121頁DCC蛋白與細胞同細胞及細胞同基質(zhì)之間相互關(guān)系相關(guān)。在結(jié)腸癌中可見到DCC基因丟失。腫瘤基因及其調(diào)控機制第122頁5.NF1基因

NF1（neurofibromatosistypel）基因是多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤易感基因，定位于第17號染色體長臂（17q11.2）。腫瘤基因及其調(diào)控機制第123頁基因全長約6okb，轉(zhuǎn)錄成11~13kbmRNA，編碼2485個氨基酸殘基蛋白。NF1蛋白同ras族癌基因編碼GTP酶活性蛋白有一定同源性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第124頁NF1蛋白可能為抗增殖蛋白，表現(xiàn)為對rasp21蛋白負調(diào)整和阻止ras介導有絲分裂信號。NF1失活足以產(chǎn)生良性神經(jīng)纖維瘤，但在惡變時可能還有別基因參加。腫瘤基因及其調(diào)控機制第125頁6.WT1基因

WT1（Wilmstumorstype1）為Wilms瘤(腎惡性胚胎瘤)易感基因，定位于第17號染色作短臂（17p13），基因全長約59kb，轉(zhuǎn)錄成3kbmRNA，編碼345個氨基酸殘基蛋白。腫瘤基因及其調(diào)控機制第126頁該蛋白含4個鋅指紋族，顯示與特異性DNA結(jié)合特征，能同上皮細胞生長因子受體EGFR-l開啟子區(qū)域CGCCCCCGC序列結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第127頁表示有發(fā)育階段特異性及組織特異性：在胚胎腎上皮、睪丸和卵巢，及一些造血細胞中有表示．但在成人細胞中不表示。在純合性缺失Wilms瘤中無WT1mRNA表示，但在絕大多數(shù)Wilms瘤中呈高表示。腫瘤基因及其調(diào)控機制第128頁推測其突變基因可能也象突變型p53那樣，表現(xiàn)出顯性負效應。突變基因可過分表示，并對野生型等位基因起抑制作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第129頁7.ErbA基因同P53基因一樣，erbA基因以前一直被認為是癌基因。用含erbA和erbB基因禽成紅細胞增多癥病毒（AEV）感染紅細胞系造血細胞，可產(chǎn)生紅白血病。腫瘤基因及其調(diào)控機制第130頁近年來研究表明，野生型erbA基因是一個抑癌基因編碼正常甲狀腺素受體．可抑制細胞增值，促進終未分化，而突變型erbA基因也象p53基因那樣僅有顯性負效應，不但無抑癌作用，反而能抑制野生型erbA作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第131頁8.Krevl基因日本學者野田亮等用插入到真核細胞表示性質(zhì)粒人包皮成纖維細胞cDNA文庫提取總DNA，轉(zhuǎn)染經(jīng)K-ras癌基因轉(zhuǎn)化小鼠NIH3T3細胞，從中篩選出扁平型表型逆轉(zhuǎn)細胞克隆。腫瘤基因及其調(diào)控機制第132頁最終從這些克隆中分離到一個能特異地抑制上述細胞惡性表型cDNA片斷，命名為Krevl基因。相關(guān)這一基因結(jié)構(gòu)與功效尚少報道，可能與人類腫瘤關(guān)系不大。腫瘤基因及其調(diào)控機制第133頁

9.INK4基因

INK4基因蛋白產(chǎn)物是一個細胞周期抑制蛋白（CKI）。當前已知CKI可分為兩大類：腫瘤基因及其調(diào)控機制第134頁INK4（inhibitorofCDK4）——特異地抑制CyclinD1·CDK4和cylinD1·CDK6磷酸化激酶活性；Kip（kinaseinhibitionprotein）——抑制現(xiàn)己知大多數(shù)Cyclin·CDK磷酸化激酶活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第135頁現(xiàn)已知INK4包含pl6INK4ap15INK4bp18INK4cp19INK4d其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效含有高度相同性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第136頁為pl6INK4a、p15INK4b編碼基因位于第9號染色體長臂9q21區(qū)。pl6INK4a基因又稱多腫瘤抑制因子（multipletumorsuppressorl,MTSI）、細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制因子（cyclin-dependentkinase4inhibitor,CDK4I），是Kamb和Nobori在1994年發(fā)覺。腫瘤基因及其調(diào)控機制第137頁pl6INK4a基因長約85kb，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，cDNA全長444bp，編碼由148個氨基酸殘基組成。分子量為16kD蛋白質(zhì)。該類蛋白質(zhì)N-末端含有Cyclinbox同源框及由4個回鉤狀重合組成二級結(jié)構(gòu)，該保守結(jié)構(gòu)中氨基酸變異與腫瘤發(fā)生之間相關(guān)性高于其它氨基酸部位。腫瘤基因及其調(diào)控機制第138頁最近發(fā)覺，小鼠INKK4a基因組能產(chǎn)生α、β兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，二者長度基本相同。α產(chǎn)物編碼pl6INK4a，β產(chǎn)物編碼分子量為19kD蛋白質(zhì)稱之為p19ARF（alternativereadingframe，ARF）。INK4a基因和ARF基因分別含有不一樣開啟子，產(chǎn)生不一樣基因產(chǎn)物。腫瘤基因及其調(diào)控機制第139頁pl6INK4a基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由外顯子lα，外顯子2和外顯子3組成，而ARF基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物則由外顯子1β，外顯子2和外顯子3組成。即使INK4a基因和ARF基因共有外顯子2和外顯子3，但因為讀框互不相同，他們編碼蛋白質(zhì)序列沒有同源性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第140頁兩種抑癌機理；

pl6INK4a／pRb路徑p19ARF／p53路徑腫瘤基因及其調(diào)控機制第141頁pl6INK4a／pRb路徑：pl6INK4a與CyclinD1競爭性結(jié)合G1期激酶CDK4／CDK6．，抑制其對Rb蛋白（pRb）磷酸化作用，使游離轉(zhuǎn)錄因子E2F-l與未磷酸化pRb結(jié)合，結(jié)果依賴于E2F-1轉(zhuǎn)錄基因不能被轉(zhuǎn)錄，從而抑制DNA合成，抑制細胞由G1期進入S期，抑制細胞分裂。腫瘤基因及其調(diào)控機制第142頁pl6INK4a還可間接抑制包含DNA合成在內(nèi)各種生化反應，從而抑制細胞周期進程。pl6INK4a失活可造成細胞周期紊亂。腫瘤基因及其調(diào)控機制第143頁p19ARF／p53路徑：

wtp53基因表述受mdm2癌基因產(chǎn)物MDM2負調(diào)控。在肉瘤和其它一些腫瘤中，MDM2過分表示，所以盡管wtp53基因本身無突變，卻檢測不到wtp53mRNA存在。腫瘤基因及其調(diào)控機制第144頁p19ARFN-端結(jié)構(gòu)域能夠與MDM2C-端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止MDM2進入核內(nèi)并加速其降解，因而能夠提升wtp53穩(wěn)定性和在細胞核中水平,抑制腫瘤發(fā)生。腫瘤基因及其調(diào)控機制第145頁pl6INK4a基因中最常見失活機理為純合性缺失，其它兩種可能機理則為突變和甲基化。在各種腫瘤中均可發(fā)覺pl6INK4a基因異常：腫瘤基因及其調(diào)控機制第146頁在胰腺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、急性白血病、惡性黑色素瘤、鼻咽癌等人類腫瘤中pl6INK4a純合性缺失率較高在胰腺癌、食管鱗癌、家族性惡性黑色素瘤及膽管癌等腫瘤中則pl6INK4a突變率較高在乳腺癌及胃癌中pl6INK4a突變率較低腫瘤基因及其調(diào)控機制第147頁近年來發(fā)覺，非小細胞肺癌中pl6INK4a5`-CpG島甲基化達33％，在對大腸癌、前列腺癌、乳腺癌等原發(fā)腫瘤和細胞系檢測中也發(fā)覺了pl6INK4a5`-CpG島高甲基化。由此可見，pl6INK4a基因異常甲基化也可能在腫瘤發(fā)生中起著主要作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第148頁10．p21Cip1基因

細胞周期抑制蛋白CKI包含INK4和KiP兩大類?，F(xiàn)己知Kip包含p21Cip1（cyclininhibitionprotein1）、p27Kip1(kinaseinhitionprotein)及p57Kip2三種細胞周期抑制蛋白。腫瘤基因及其調(diào)控機制第149頁它們在N-末端結(jié)構(gòu)和功效含有高度相同性。p27Kip1與p21Cip1N-端間含有42％同源性，p27Kip1與p57Kip2N-端間含有47％同源性。他們均可特異地抑制以下蛋白激酶活性，含有同INK4相同功效：CyclinD1·CDK4CyclinD1·CDK6CyclinE·CDK2CyclinA·CDK2腫瘤基因及其調(diào)控機制第150頁1993年Harper和EIDeiry兩個試驗小組同時分離出p21基因cDNA。并依據(jù)其功效給予了不一樣命名，如CDK相互作用蛋白（CDKinteractingprotein1，Cip1），野生型p53活化片段（wildtypep53-activatedfragment1,WAF1)等。腫瘤基因及其調(diào)控機制第151頁p21基因定位于第6號染色體短臂（6p21.2），其基因組DNA長度為85kb,由3個外顯子組成。其cDNA長約2.1kb。腫瘤基因及其調(diào)控機制第152頁在p21編碼區(qū)上游24kb和大于8kb處有2個p53結(jié)合區(qū)，p21蛋白定位于細胞核中，由164個氨基酸殘基組成，富含精氨酸。其N末端第21~26個氨基酸殘基可與CyClinD,E結(jié)合，C末端第124~164氨基酸殘基可與PCNA結(jié)合，中間第49～72對氨基酸殘基可與CDK2結(jié)合。腫瘤基因及其調(diào)控機制第153頁p21是當前已知含有最廣泛激酶抑制活性細胞周期抑制蛋白。它能與各種Cyclin·CDK復合物結(jié)合，經(jīng)過各種路徑對細胞周期演進起抑制作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第154頁p21蛋白能與CyclinD1·CDK4,CyclinE·CDK2結(jié)合使其喪失磷酸激酶活性，使pRb不能發(fā)生磷酸化，從而使細胞周期停滯于G1期；p21蛋白還能與增殖細胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）結(jié)合，使PCNA不能與DNA聚合酶δ

形成復合物，從而抑制DNA合成。腫瘤基因及其調(diào)控機制第155頁p21基因活化和表示可經(jīng)過以下兩個路徑來完成：①依賴P53路徑②非依賴p53路徑腫瘤基因及其調(diào)控機制第156頁①依賴p53路徑當細胞受到損傷時（如受γ輻射），在wtp53+/+細胞中常有wtp53,p21表示升高，細胞停滯于G1期，而在p53-/-細胞中則無p21升高，細胞也無G1期停滯，說明wtp53作為轉(zhuǎn)錄因子，可開啟p21表示，使細胞停滯于GI期，以利于DNA修復，維持細胞遺傳信息穩(wěn)定性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第157頁②非依賴p53路徑生長因子（PDGF、FGF、EGF、TGFβ）等作為細胞外信號，刺激p53-/-靜止期細胞，經(jīng)過細胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)路徑調(diào)整p21轉(zhuǎn)錄。佛波酯、γ干擾素等可誘導wtp53-/-人類白血病細胞系p21表示，并出現(xiàn)單核巨噬細胞系分化相關(guān)生長停滯。腫瘤基因及其調(diào)控機制第158頁在大多數(shù)腫瘤細胞中未發(fā)覺p21突變，而只見到其表示改變。在黑色素瘤細胞間變痣、SV40轉(zhuǎn)化黑色素瘤細胞和轉(zhuǎn)移黑色素瘤中，其表示水平依次顯著降低，表明p21表示與黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展有親密關(guān)系。腫瘤基因及其調(diào)控機制第159頁在43例非小細胞性肺癌及其對應正常組織中，經(jīng)過mRNA檢測及免疫組化顯示，在正常肺組織中p21mRNA及蛋白表示很低，而在肺癌組織中p21mRNA及蛋白均高表示，其機理尚不太清楚。腫瘤基因及其調(diào)控機制第160頁

11．p27Kip1

p27Kip1是Polyak等于1994年在TGFβ處理生長抑制細胞，及接觸抑制細胞系中發(fā)覺另一個分子量為27kD耐熱細胞周期抑制蛋白。腫瘤基因及其調(diào)控機制第161頁它在體外與CyclinE·CDK2，CyclinD1·CDK4緊密結(jié)合，其活性發(fā)揮依賴于三者間化學劑量關(guān)系。CyclinE·CDK2濃度是細胞經(jīng)過細胞周期關(guān)卡關(guān)鍵原因，而p27Kip1則特異地抑制CyclinE·CDK2激酶活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第162頁人p27Kip1是由198個氨基酸殘基組成熱穩(wěn)定蛋白，與p21Cip1在N-端有高度同源性。其末端21~87位點60個氨基酸殘基含有兩個Ser磷酸化位點，具CDK激酶抑制活性。腫瘤基因及其調(diào)控機制第163頁153～169位17個氨基酸序列為核定位序列，該序列在Kip三個組員平均存在，與其細胞周期調(diào)控功效親密相關(guān)。p27Kip1C末端有一個Thr磷酸化位點，與其H1組蛋白磷酸化抑制作用相關(guān)。腫瘤基因及其調(diào)控機制第164頁大量試驗證實，在TGFβ處理細胞系、有接觸抑制細胞系及各種外源性生長抑制因子作用細胞系中p27Kip1表示量顯著增多。在TGFβ處理前后細胞內(nèi)p27Kip1mRNA總量無顯著改變，但在處理后G1末期細胞中游離p27Kip1濃度增加。腫瘤基因及其調(diào)控機制第165頁在TGFβ處理細胞中加入過量CyclinD1·CDK4能夠使滯留于G1期細胞重新分裂。這些資料說明，抑制細胞周期最關(guān)鍵原因是細胞內(nèi)游離p27Kip1量，而不是其總量。腫瘤基因及其調(diào)控機制第166頁另外，p27Kip1含有抑制染色質(zhì)H1組蛋白磷酸化作用。細胞內(nèi)DNA聚合酶作用發(fā)揮依賴于H1組蛋白磷酸化介導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，抑制H1組蛋白磷酸化也就間接地抑制了DNA合成。腫瘤基因及其調(diào)控機制第167頁p27Kip1含有各種細胞周期抑制作用，雖其作用弱于p21Cip1，但對正常組織損傷顯著低于后者，所以有可能作為基因治療中可供選擇靶基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第168頁

12．FHIT基因FHIT基因是1996年Ohta等用外顯子捕捉法克隆到一個人類基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第169頁因為該基因定位于第3號染色體短臂（3p14.2），該處存在脆性部位FRA3B，而且．依據(jù)其推算蛋白質(zhì)序列與含有三價組氨酸結(jié)構(gòu)域HIT蛋白質(zhì)高度同源，所以定名為脆性組氨酸三聯(lián)體（fragilehistidinetriad,FHIT）。腫瘤基因及其調(diào)控機制第170頁FHIT基因cDNA全長1.1kb，含有10個外顯子，其開放閱讀讀框（openreadingframe）起于外顯子5，止于外顯子9。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第171頁關(guān)于FHIT異常與腫瘤發(fā)生之間關(guān)系已經(jīng)有許多研究報道，迄今還未發(fā)覺相關(guān)FHI下基因突變報道。腫瘤基因及其調(diào)控機制第172頁有報道在38例有第3號染色體復制（chromosomalduplication）異常非小細胞肺癌病人中，50%有3p特定序列缺失，83%有FHIT基因雜合性丟失（lossofheterozygosity,LOH),說明FHIT等位基因丟失可能在腫瘤發(fā)生中起著主要作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第173頁13.PTEN

PTEN／MMAC1/TEP1基因是1997年由3個研究組分別發(fā)覺和命名一個抑癌基因。

腫瘤基因及其調(diào)控機制第174頁PTEN基因又名MMAC1和TEP1。PTEN——phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10MMAC1——mutatedinmultideadvancedcancersTEP1TGFβ-regulatedandepithelialcellenrichedphosphatase腫瘤基因及其調(diào)控機制第175頁PTEN定位在10q23.3上，并已被克隆。共有9個外顯子，mRNA為5.5kb。PTEN蛋白主要結(jié)構(gòu)功效區(qū)位于N-端，由個1209個核苷酸編碼403個氨基酸殘基組成一條多肽鏈。腫瘤基因及其調(diào)控機制第176頁在第122～123位氨基酸序列（IHCKAGKGRTG）符合酪氨酸磷酸酶關(guān)鍵基序（HCXXGXGRX），是迄今發(fā)覺第一個含有磷酸酶活性抑癌基因。腫瘤基因及其調(diào)控機制第177頁當前對PTEN作用機理已經(jīng)有較多報道，認為PTEN抑癌作用可經(jīng)過以下路徑來完成：

①FAK路徑②三磷酸脂酸肌醇激酶路徑③絲裂原激活蛋白激動路徑

腫瘤基因及其調(diào)控機制第178頁①FAK路徑錨著點激酶（FAK）是整合素(integrin)介導信號路徑中一個關(guān)鍵分子。整合素經(jīng)過與細胞外基質(zhì)相互作用而被活化，繼而激活FAK，促使細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN則可直接使FAK去磷酸化，從而抑制細胞生長。腫瘤基因及其調(diào)控機制第179頁②三磷酸脂酸肌醇（PI3）激酶路徑三磷酸磷脂酸肌醇（PIP）位于細胞膜上，是一個細胞生長調(diào)控路徑中關(guān)鍵分子，主要作用是刺激細胞生長和阻斷凋亡。是胰島素生長因子（IGF）和上皮生長因于（EGF）等一些細胞生長因子在細胞內(nèi)第二信使。腫瘤基因及其調(diào)控機制第180頁生長因于與膜上受體結(jié)合，激活PI3激酶，從而使信使前體PIP2磷酸化生成PIP3。后者隨即激活信號傳導系統(tǒng)中一系列激酶包含絲蘇氨酸激酶（Akt）。這些酶可促使細胞進入分裂周期,并阻止細胞周亡。腫瘤基因及其調(diào)控機制第181頁PTEN能抑制PI3激酶磷酸化作用，阻止PIP2向PIP3轉(zhuǎn)化從而阻斷了Akt及其下游基因活性，從而起到了抑癌作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第182頁

③絲裂原激活蛋白激動（mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）路徑

有報道整合素可激活MAPK路徑及其細胞外調(diào)整激酶（ERK）。整合素可同生長因子協(xié)調(diào)作用，經(jīng)過一系列復雜信號傳導系統(tǒng)，刺激細胞增殖。腫瘤基因及其調(diào)控機制第183頁PTEN可顯擇性地抑制ERK激活MAPK路徑，使其不受整合素和生長因子影響，從而對細胞增殖起抑制作用。腫瘤基因及其調(diào)控機制第184頁關(guān)于PTEN與腫瘤之間關(guān)系已經(jīng)有較多報道。Cowden（CD）綜合癥是一個常染色體隱性遺傳性腫瘤綜合癥，其特征為多個臟器發(fā)生錯構(gòu)瘤，包含甲狀腺、乳腺、皮膚及女性生值系統(tǒng)，而且很輕易發(fā)