高致病性禽流感(H5N1)病毒感染模型的制作步驟及方法

高致病性禽流感(H5N1)病毒感染模型的制作步驟及方法禽流感(avianinfluenza,Al)是由A型流感病毒(avianinfluenzaviruses,AIV)引起的一種禽類的急性、高度接觸性、烈性傳染病，可引起禽類的感染或疾病綜合征。該病毒屬正黏病毒科、流感病毒屬，其含有神經(jīng)氨酸酶和血凝素，可凝集某些動物的紅細胞，對消化道、呼吸道系統(tǒng)具有致病性。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染，而家養(yǎng)的雞和火雞引起的危害為嚴(yán)重，國外報道，已發(fā)現(xiàn)帶毒鳥類達88種。根據(jù)其對易感雞致病性強弱，可將禽流感病毒分為高致病性AIV(如H5N1等)和低致病性AIV(如H9N2等)?；痣u、雞、鴨和鵝自然狀態(tài)下容易感染禽流感病毒，是常用的實驗動物。其他可用作AIV人工接種的實驗動物有：雪貂、貓、倉鼠、小鼠、猴、水貂及豬。1嚙齒類動物模型⑴復(fù)制方法4~6周齡SPF級ICR小鼠或NIH小鼠。首先將病毒無菌接種于10日齡雞胚的尿囊腔，病毒毒株為A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)，待活化增殖后，病毒的血凝滴度可達到1:256。將小鼠麻醉后，經(jīng)其鼻腔接種AIV,接種量為0.1ml/只，然后通過模型動物體溫、體重、臨床癥狀、病理變化、病毒分離和抗體測定進行比較分析。接種后ICR及NIH小鼠的肺臟肉眼可見，充血和水腫，肺體積變大，肺組織表面局部有輕度實變，呈現(xiàn)斑點狀充血；鏡下病理組織學(xué)觀察可見，肺間質(zhì)充血，血管周圍有炎癥細胞浸潤；細支氣管內(nèi)充血，部分管壁黏膜上皮細胞壞死、脫落(2)模型特點機體呼吸道是AIV病毒的主要感染途徑，敏感動物可出現(xiàn)支氣管和肺組織內(nèi)明顯病理變化；部分動物尚可出現(xiàn)體液免疫反應(yīng)，有接近1/2的感染小鼠可檢測到AIV抗體，且出現(xiàn)抗體的時間為接種后第6日。部分動物體內(nèi)有病毒復(fù)制，大部分ICR和NIH模型小鼠分離到AIV,ICR和NIH小鼠對AIV敏感，較適宜作為AIV小動物模型。(3)比較醫(yī)學(xué)接種感染后ICR小鼠和NIH小鼠均出現(xiàn)較為明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、食欲減退、呼吸急促，出現(xiàn)皺毛、弓背等現(xiàn)象，并日益嚴(yán)重；體重與體溫均呈降低趨勢，其臨床癥狀及病理變化比較典型。而人感染禽流感病毒后的主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在39C。以上，可伴有鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛、肌肉酸痛和全身不適。在實驗過程中近半數(shù)接毒小鼠死亡。模型動物臨床癥狀和人的臨床癥狀并不完全相同，但組織病理變化基本相似。到目前為止，人工感染途徑主要有鼻腔、氣管、結(jié)膜、皮下、肌肉等，模型動物的發(fā)病率和臨床癥狀受多種因素(動物易感性、病毒毒力、接種途徑和動物年齡等)的影響。2非人靈長類動物模型復(fù)制方法采用“環(huán)甲膜穿刺術(shù)”接種病毒。恒河猴取仰臥位，頭盡量后仰，在甲狀軟骨與環(huán)狀軟骨之間確定環(huán)甲膜的位置；在鎖骨中線處，與皮膚成35°~45°角向足部方向進針，可用16號注射針頭刺向環(huán)甲膜進入氣管腔，經(jīng)氣管注射雞胚培養(yǎng)的禽流感H5N1病毒(病毒血凝滴度達1：256以上，毒株為ACGoose/Guangdong/11961H5N1)感染恒河猴，觀察恒河猴染毒后出現(xiàn)的臨床體征，用顯微計數(shù)法檢測外周血白細胞的動態(tài)變化，用ELISA檢測禽流感病毒特異性抗體變化規(guī)律，用流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞及其亞群的動態(tài)變化。模型動物以肺部損傷為主，伴多器官病變。肺部的病變主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，先后經(jīng)歷滲出期、增生期和纖維化期；在肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也觀察到變性、壞死等病理變化。模型特點接種病毒后動物急性發(fā)病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，呼吸困難，精神萎靡，活動減少，食欲下降，并有咳嗽和紫紺等，肺部聽診模型動物雙肺可聞及干、濕音。鏡下病理組織學(xué)觀察以肺病理損傷變化為主，伴多器官病變；肺組織病變主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，可先后出現(xiàn)滲出期、增生期和纖維化期；在肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也可見變性、壞死等病理變化。病毒僅在模型動物的呼吸系統(tǒng)中復(fù)制，不在呼吸道以外的組織器官中復(fù)制；肺內(nèi)支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和肺巨噬細胞是禽流感病毒侵犯的主要細胞類型。接種感染早期，模型動物外周血白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)可出現(xiàn)短暫的下降，而中性粒細胞數(shù)則先升后降，但均于感染第7日后逐漸恢復(fù)至正常水平。感染后第7~11日，機體抗體水平可持續(xù)快速升高；感染第11日后，抗體水平呈漸進性緩慢升高趨勢(觀察到染毒后50d為止)。感染后模型動物機體細胞免疫功能受損，表現(xiàn)為CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞均出現(xiàn)短暫的下降，但這種細胞免疫功能受損是可逆的，至感染第7日后可逐漸恢復(fù)回升正常。比較醫(yī)學(xué)恒河猴感染后的臨床特點、病理變化