核酸的物理化學性質

關于核酸的物理化學性質第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四一.核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH參與作用有很大的關系。在RNA水解時，2′-OH首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產物。第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四酸易水解N-糖苷鍵，嘌呤堿基比嘧啶堿基易被酸水解，脫氧核糖比核糖的糖苷鍵易水解，DNA的嘌呤堿在pH2以下即脫落而成嘌呤酸。堿易水解磷酸酯鍵，RNA在0.3N堿中即被水解，DNA對堿相對穩(wěn)定。第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四

酶水解生物體內存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。核酸酶的分類按底物專一性分：以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。按作用方式分：核酸外切酶和核酸內切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。按作用鍵分：水解3-磷酸酯鍵和5-磷酸酯鍵的核酸酶，產物分別是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四核糖核酸酶舉例牛胰核糖核酸酶（RNaseI）,內切酶，水解嘧啶3'-磷酸和其他核苷酸5'-OH形成的酯鍵，產生3'-磷酸核苷。核糖核酸酶T1，內切酶，發(fā)現(xiàn)于米曲霉，水解3‘-鳥苷酸與其他核酸5’-OH形成的酯鍵，產物為3‘-鳥苷酸為末端的寡核苷酸。第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四脫氧核糖核酸酶舉例1.牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI），內切酶，水解DNA3‘-磷酸酯鍵，產生5’-磷酸的寡核苷酸，平均長度為4個核苷酸。2.牛脾脫氧核糖核酸酶（DNaseII），內切酶，水解DNA5‘-磷酸酯鍵，產生3’-磷酸的寡核苷酸，平均長度為6個。3.限制性內切酶，可識別特異的堿基序列并水解斷開，產物帶5‘-磷酸基，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，是基因工程的重要工具酶。N-糖苷酶水解糖苷鍵，產物為含氮堿基和無堿基末湍的寡核苷酸第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四二.核酸的酸堿性質兩性解離：DNA無，只有酸解，堿基被屏蔽（在分子內部形成了氫鍵）。RNA有兩性解離，有pI。核酸的堿基、核苷、核苷酸均能發(fā)生解離，因此核酸是兩性電解質堿基的解離：嘧啶和嘌呤環(huán)上的N及各取代基具有結合和釋放質子的能力。核苷的解離：堿基和核糖具有結合和釋放質子的能力核酸的解離：磷酸基具有較強的酸性，核酸的兩性解離主要決定于磷酸基和含氮堿基。

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三.核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組分定性和定量測定的依據。以A260/A280進行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外線下發(fā)出熒光。用A260/A280還可用來表示核酸的純度：大于1.8，DNA很純；大于2，RNA很純。

第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四樣品中如含有雜蛋白及苯酚，比值明顯降低。對于純的樣品，只要讀出260nm的A值即可算出含量。通常以A值為1相當于50μg/ml雙螺旋DNA，或40μg/ml單鏈DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸計算。第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四有時核酸的紫外吸收以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷酸。先測定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)ε(P)。

ε(P)=A/cLA為吸收值，c為每升溶液中磷的摩爾數(shù)，L為比色杯內徑。

c=每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（30.98）

ε(P)=30.98A/WL一般天然DNA的ε(P)為6600，RNA為7700-7800。核酸的ε(P)值較所含核苷酸單體的ε(P)要低40%-45%。單鏈多核苷酸的ε(P)值比雙螺旋結構多核苷酸的ε(P)要高，所以核酸發(fā)生變性時，ε(P)升高約25%，此現(xiàn)象稱為增色效應（hyperchromiceffect）。復性后ε(P)又降低，這現(xiàn)象稱減色效應(hypochromiceffect)。第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四四.核酸的變性，復性及雜交(一)變性穩(wěn)定核酸雙螺旋的次級鍵斷裂，空間結構破壞，變成單鏈結構的過程。核酸的一級結構(核苷酸順序)保持不變。變性表征

生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應）變性因素

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）低離子強度加熱第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四

熱變性與TmDNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。（或者把加熱變性使DNA的雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度）。一般DNA的Tm值在82-95C之間。第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四DNA的Tm值大小與下列因素有關：（1）DNA的均一性。均質DNA，如一些病毒的DNA，人工合成的polyd(A-T),polyd(G-C)熔解過程發(fā)生在一個較小的范圍內。異質DNA熔解的過程發(fā)生在一個較寬的范圍內。所以Tm值可作為衡量DNA樣品均一性的標準。（2）分子中G和C的含量。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)Χ2.44（3）介質的離子強度。一般離子強度較低的介質中，DNA的熔解溫度較低，而且溶解溫度的范圍較寬。第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四鹽濃度對DNA變性的影響第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四RNA的變性：RNA也具有螺旋線團之間的轉變。但這種較變不如DNA明顯。變性曲線不陡，Tm值較低。tRNA具有較多的雙螺旋區(qū)，所以具有較高的Tm值，變性曲線也較陡。第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四

（二）復性變性核酸的互補鏈在適當?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結構的過程稱為復性。DNA復性后，一系列性質將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復，具有減色效應。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。變性的DNA緩慢冷卻時可復性，因此又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃復性影響因素片段濃度/片段大小/片段復雜性（重復序列數(shù)目）/溶液離子強度第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四將熱變性的DNA驟然冷卻時，DNA不可能復性DNA的片段越大，復性越慢DNA的濃度越大，復性越快在一定條件下，復性反應的速度用Cot1/2來衡量，Co為變性DNA復性時的初始濃度，t為時間，Cot?表示復性一半時的DNA濃度。兩種濃度相同但來源不同的DNA，復性時間的長短與基因組的大小有關有很多重復序列的DNA復性也快第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四

（三）核酸的雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結構的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。Southern雜交（Southernbolting）Northern雜交（Northernbolting）Western雜交（Westernbolting）第36頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術

核酸分子雜交技術，是在1968年由華盛頓卡內基學院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。

第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四核酸的雜交第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四<1>核酸分子雜交的意義：

發(fā)現(xiàn)原核生物的基因是連續(xù)基因，而真核生物的基因是斷裂基因。

連續(xù)基因：基因中的bp序列能夠連續(xù)的在成熟的蛋白質中找到其相應的AA，電鏡顯示這種基因能夠和它的成熟mRNA形成平滑的雜交分子。

斷裂基因：基因中的bp序列能夠斷續(xù)的在成熟的蛋白質中找到其相應的AA，電鏡顯示這種基因和它的成熟mRNA只能形成帶泡的雜交分子。發(fā)現(xiàn)癌基因的普遍性：腫瘤病毒的RNA能夠與人類正常的DNA分子形成帶泡的雜交分子。

第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四<2>核酸分子雜交的技術

SouthernBlotting（南印跡）：用于釣基因，即用已知的DNA單鏈或RNA，釣取未知DNA分子中的基因，方法如下：

未知的DNA--DNA限制性內切酶DNA片段瓊脂糖電泳分離堿液變性影印在硝酸纖維薄膜上與放射性標記的已知DNA單鏈或RNA雜交放射自顯影NorthernBlotting（北印跡）：用已知的DNA釣mRNA，方法如下：

眾多未知的RNA電泳分離變性影印用標記的已知DNA單鏈雜交放射自顯影WesternBlotting（西印跡）：蛋白質與抗體的雜交，跟核酸無關。第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四

Southern

DNA印跡雜交

根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同位素標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉移技術。

第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期四Southern凝膠轉移雜交技術（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段