第六章-光學(xué)檢測(cè)技術(shù)-張靜

第一節(jié)旋光檢測(cè)技術(shù)利用旋光計(jì)測(cè)量出旋光物質(zhì)（光學(xué)活性物質(zhì)）對(duì)偏振光旋轉(zhuǎn)角度的方向（左旋或右旋）和大小，從而進(jìn)行定性與定量分析的技術(shù)，稱為旋光檢測(cè)技術(shù)。旋光物質(zhì)對(duì)偏振光的旋轉(zhuǎn)方向和角度大小是該物質(zhì)的固有特性。偏振光旋轉(zhuǎn)的方向和角度稱為旋光度。左旋（－），右旋（＋）。物質(zhì)的旋光度主要取決于物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，此外與入射光的波長(zhǎng)及溫度有關(guān)，對(duì)溶液而言，還與溶液性質(zhì)、溶液濃度和溶液厚度有親密關(guān)系。

旋光法：應(yīng)用旋光儀測(cè)量旋光性物質(zhì)的旋光度以確定其含量的分析方法。

旋光度和比旋光度是旋光性物質(zhì)的主要物理性質(zhì)。通過旋光度和比旋光度的測(cè)定，可以檢查光學(xué)活性化合物的純度，也可以定量分析有關(guān)化合物溶液的濃度。光是一種電磁波，即光波的振動(dòng)方向與其前進(jìn)方向相互垂直。自然光有多數(shù)個(gè)與光的前進(jìn)方向相互垂直的光波振動(dòng)面。若光線前進(jìn)的方向指向我們，則與之相互垂直的光波振動(dòng)平面可表示為如圖（a），圖中箭頭表示光波振動(dòng)的方向。若使自然光通過尼科爾棱鏡，由于振動(dòng)面與尼科爾棱鏡的光軸平行的光波才能通過尼科爾棱鏡，所以通過尼科爾棱鏡的光，只有一個(gè)與光的前進(jìn)方向相互垂直的光波振動(dòng)面，如圖（b）。這種僅在一個(gè)平面上振動(dòng)的光叫偏振光。

自然光與偏振光通常用以下兩種方法產(chǎn)生偏振光：尼科爾棱鏡或偏振片。尼科爾棱鏡一塊方解石的菱形六面體末端的表面磨光，使鏡角等于68°，將之對(duì)角切成兩半，把切面磨成光學(xué)平面后，再用加拿大樹膠粘起來，便成為一個(gè)尼科爾棱鏡。其中特別光線MP由方解石到加拿大樹膠是由光疏介質(zhì)到光密介質(zhì)，必將發(fā)生折射通過加拿大樹膠，由棱鏡的另一端面射出，從而產(chǎn)生了平面偏振光。偏振光的產(chǎn)生尼科爾棱鏡示意圖偏振片利用偏振片也能產(chǎn)生偏振光。它是利用某些雙折射晶體（如電氣石）的二色性，即可選擇性吸取尋常光線，而讓特別光線通過的特性，把自然光變成偏振光。分子結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，能把偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)確定角度的物質(zhì)稱為光學(xué)活性物質(zhì)。很多食品成分都具有光學(xué)活性，如單糖、低聚糖、淀粉以及大多數(shù)的氨基酸和羥酸等。其中能把偏振光的振動(dòng)平面對(duì)右旋轉(zhuǎn)的，稱為“具有右旋性”，以（十）號(hào)表示；反之．稱為“具有左旋性”，以（一）號(hào)表示。旋光性、旋光性物質(zhì)旋光度偏振光通過光學(xué)活性物質(zhì)的溶液時(shí)，其振動(dòng)平面所旋轉(zhuǎn)的角度叫做該物質(zhì)溶液的旋光度，以α表示。旋光度的大小與光源的波長(zhǎng)、溫度、旋光性物質(zhì)的種類、溶液的濃度及液層的厚度有關(guān)。對(duì)于特定的光學(xué)活性物質(zhì)，在光源波長(zhǎng)和溫度確定的狀況下，其旋光度α與溶液的濃度c和液層的厚度L成正比。即：α＝KcL比旋光度

當(dāng)旋光性物質(zhì)的濃度為100g/100ml，液層厚度為ldm（分米）時(shí)所測(cè)得的旋光度稱為比旋光度，以表示。由上式可知：＝K×1×1＝K

即：＝式中：[α]－－比旋光度，度；

t－－溫度，

λ－－光源波長(zhǎng)，nm；

α－－旋光度，度；

L－－液層厚度或旋光管長(zhǎng)度，dm；

c－－溶液濃度，g／ml。

比旋光度與光的波長(zhǎng)及測(cè)定溫度有關(guān)。通常規(guī)定用鈉光D線（波長(zhǎng)

589.3nm）在20℃時(shí)測(cè)定，在此條件下，比旋光度用表示因在確定條件下比旋光度是已知的，L為確定，故測(cè)得了旋光度就可計(jì)算出旋光質(zhì)溶液中的濃度c。變旋作用定義具有光學(xué)活性的還原糖類（如葡萄糖，果糖，乳糖、麥芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初快速變更，然后漸漸變得較緩慢，最終達(dá)到恒定值，這種現(xiàn)象稱為變旋作用。這是由于有的糖存在兩種異構(gòu)體，即α型和β型，它們的比旋光度不同。這兩種環(huán)型結(jié)構(gòu)及中間的開鏈結(jié)構(gòu)在構(gòu)成一個(gè)平衡體系過程中，即顯示出變旋光作用。變旋現(xiàn)象因此，在用旋光法測(cè)定蜂蜜，商品葡萄糖等含有還原糖的樣品時(shí)，樣品配成溶液后，宜放置過夜再測(cè)定。若需馬上測(cè)定，可將中性溶液（pH=7）加熱至沸，或加幾滴氨水后再稀釋定容；若溶液已經(jīng)稀釋定容，則可加入碳酸鈉干粉至石蕊試紙剛顯堿性。在堿性溶液中，變旋光作用快速，很快達(dá)到平衡。但微堿性溶液不宜放置過久，溫度也不行太高，以免破壞樣品。旋光儀WXG型半蔭旋光儀檢糖計(jì)WZB自動(dòng)旋光儀WGX型半蔭旋光儀結(jié)構(gòu)和原理

起偏棱鏡一般用尼科爾（Nicol)棱鏡，以獲得偏振光。旋光管盛裝待測(cè)液的玻璃管。檢偏棱鏡仍用尼科爾（Nicol)棱鏡，用以檢測(cè)從旋光管射出的偏振光振動(dòng)平面與原來相比較的角度（可由刻度盤上的數(shù)值讀出）。檢糖計(jì)

檢糖計(jì)專用于糖類的測(cè)定。故刻度數(shù)值干脆表示為蔗糖的百分含量（W/V），其測(cè)定原理與旋光計(jì)相同。在結(jié)構(gòu)上有以下特點(diǎn)檢糖計(jì)的基本光學(xué)元件自動(dòng)旋光儀當(dāng)檢測(cè)池中放進(jìn)存有被測(cè)溶液的試管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋轉(zhuǎn)了一個(gè)角度，零度視場(chǎng)便發(fā)生了變更，轉(zhuǎn)動(dòng)檢偏鏡確定角度，能再次出現(xiàn)亮度一樣的視場(chǎng)。這個(gè)轉(zhuǎn)角就是溶液的旋光度，測(cè)得溶液的旋光度后，就可以求出物質(zhì)的比旋度。依據(jù)比旋度的大小，就能確定該物質(zhì)的純度和含量了。旋光法測(cè)定味精濃度樣品溶液配制精確稱取味精樣品10.00g，加40～50mL蒸餾水溶解，攪拌加入分析純鹽酸16mL，使味精全部溶解。冷卻至室溫，蒸餾水定容至100mL。旋光儀調(diào)零預(yù)熱10min，放進(jìn)濾光片。取16mL分析純鹽酸蒸餾水定容至100mL。裝滿旋光管，調(diào)整零點(diǎn)。樣品液測(cè)定樣品洗滌旋光管三次，裝滿旋光管，放進(jìn)樣品室，測(cè)定旋光度，記錄溫度。物質(zhì)被輻射能照射后，分子內(nèi)部獲得外源能量，基態(tài)分子能級(jí)的電子躍遷到較高能級(jí)，轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)分子能級(jí)，使分子處在高能域不穩(wěn)定狀態(tài)，因此，它必需釋放多余的能量，變成穩(wěn)定狀態(tài)的分子。分子發(fā)光：由激發(fā)態(tài)能級(jí)回到基態(tài)能級(jí)的過程中以光的形式釋放多余的能量，并放射出比原波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光譜。熒光分光光度法：檢測(cè)分子放射光譜的分析方法。其次節(jié)熒光檢測(cè)技術(shù)一、特點(diǎn)專一性強(qiáng)靈敏度高：測(cè)定同樣濃度物質(zhì)的含量，通常比吸取光譜靈敏度高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)左右。選擇性強(qiáng)：既可分析放射光譜，也可分析激發(fā)光譜，偏振光譜。發(fā)光方式多：物理發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光。可分析參數(shù)多：可分析熒光光譜，熒光強(qiáng)度，熒光效率，熒光壽命等多種物理參數(shù)。二、方法原理熒光現(xiàn)象：是一種發(fā)光現(xiàn)象，當(dāng)一種波長(zhǎng)的光照射在某一熒光物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)被激發(fā),若能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出較激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光,在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間大約10-8~10-4s.放射的光譜稱為熒光光譜.磷光光譜:若這種光在激發(fā)態(tài)停留較長(zhǎng)的時(shí)間,即在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間大約是10-4~10s,系統(tǒng)內(nèi)放射出比熒光波長(zhǎng)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光.放射的光譜稱為磷光光譜.熒光產(chǎn)朝氣理（1）分子能級(jí)：最低第一級(jí)電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)是產(chǎn)生熒光的基礎(chǔ)。分子吸取能量后，電子躍遷到哪一個(gè)能級(jí)并不重要，重要的是吸取了能量的分子經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)移以后，將能量降到最低第一級(jí)電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)后，能否以光子的形式釋放能量，如能就會(huì)放射熒光，否則不會(huì)。（2）耗能方式:產(chǎn)生熒光:分子內(nèi)在因素和外在條件確定.在同一能級(jí)中分子間的相互碰撞消耗能量;無輻射衰減轉(zhuǎn)給四周分子變成振動(dòng)能消耗;輻射熒光----以光子的形式釋放能量;光分解消耗分子內(nèi)部的能量(光分解以產(chǎn)生熱的方式，使物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變更，發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光能量減弱或丟失).（3）能量的傳遞途徑:

處于較高能級(jí)的激發(fā)態(tài)電子回到基態(tài)途徑當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)特別靠近以致其振動(dòng)能級(jí)發(fā)生重疊時(shí)，電子由高能級(jí)以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移給低能級(jí)不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，如S1→T1。有時(shí)通過熱激發(fā)，就有可能發(fā)生T1→S1，然后產(chǎn)生延遲熒光被激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用把多余的能量轉(zhuǎn)移給四周分子，使熒光或磷光放射的強(qiáng)度減弱或消逝。也稱熒光熄滅或猝滅激發(fā)態(tài)分子把多余的振動(dòng)能量以熱的形式轉(zhuǎn)給四周分子，而自身從Sn的較高振動(dòng)能級(jí)層降低到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)層上處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子回到基態(tài)振動(dòng)能級(jí)時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)放射一個(gè)光子返回到基態(tài)分子的系間竄躍躍遷后，就會(huì)發(fā)生快速的振動(dòng)弛豫到達(dá)第三激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)上，以光子的形式躍遷回到基態(tài)（4）分子熒光的類型:依據(jù)熒光物質(zhì)所需的激發(fā)光源不同和吸能后放射熒光光譜的差異,分為:物理發(fā)光(物理/光致熒光）：熒光分子吸取了光能(如以X射線，紫外光，激光等為光源的輻射能等)而產(chǎn)生的熒光;化學(xué)發(fā)光:通過分子與分子之間的化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)能，在化學(xué)反應(yīng)過程中釋放能量而放射熒光;生物發(fā)光:通過生物體內(nèi)的熒光酶與熒光物質(zhì)相互作用，在生物化學(xué)反應(yīng)過程中所釋放出來的光能.2.激發(fā)光譜和放射光譜任何熒光化合物的分子在吸取能量和釋放能量的過程中，都存在著激發(fā)光譜和放射光譜。激發(fā)光譜：熒光分子首先要從外界得到相應(yīng)的能量，才能具備發(fā)光的基本條件,才有可能放射熒光。在選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，可通過測(cè)量分子的激發(fā)光譜來確定。放射光譜：分子放射熒光的特征波長(zhǎng)比吸取的特征波長(zhǎng)長(zhǎng)。放射光譜的形態(tài)與激發(fā)光譜極為相像,且呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。3.熒光量子產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)（1）熒光分子產(chǎn)生熒光的條件：熒光分子必需具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，能吸取激發(fā)光供應(yīng)的輻射能；分子吸取了與本身特征頻率相同能量后，必需具有產(chǎn)生確定的熒光量子的實(shí)力。產(chǎn)生熒光量子的強(qiáng)弱可用熒光量子產(chǎn)率（也稱熒光效率或量子效率）來表示：（2）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系：共軛效應(yīng)：含有π-π*電子躍遷能級(jí)化合物的熒光最強(qiáng)。絕大多數(shù)能放射熒光的化合物，都是芳香族或雜環(huán)類化合物或者在它們的分子中含有芳香族或雜環(huán)類基團(tuán)。苯類化合物的對(duì)苯基化、間苯基化及乙烯化作用能夠增加苯分子的熒光強(qiáng)度。分子的剛性平面結(jié)構(gòu)：能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光。這種結(jié)構(gòu)可以削減分子的振動(dòng)，分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子相互之間的作用降低了，這樣更有利于熒光的放射（如芴和聯(lián)二苯的熒光效率分別為1.0和0.2；熒光素有很強(qiáng)的熒光，而酚酞沒有熒光）。取代效應(yīng)：給電子基團(tuán)（如-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR等）能使熒光增加，得電子基團(tuán)（如-COOH，-C=O，-NO2，-NO及鹵素離子等）能使熒光減弱三、儀器的結(jié)構(gòu)與原理1.熒光分光光度法定量分析基本原理

溶液的熒光強(qiáng)度和該溶液吸取光能的程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光量子效率有關(guān)。2.熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)激發(fā)光源,激發(fā)單色器,樣品池,放射單色器,檢測(cè)器及顯示系統(tǒng)激發(fā)光源：要求能發(fā)出強(qiáng)度較大，連續(xù)穩(wěn)定的光源。理論上,放射熒光的強(qiáng)度取決于激發(fā)光源的強(qiáng)度.實(shí)際應(yīng)用中選擇光源的強(qiáng)度不能太強(qiáng)也不能太弱。要依據(jù)熒光物質(zhì)的性質(zhì)選擇合適光源:對(duì)光敏感或放射熒光較強(qiáng)的物質(zhì)選用較弱光源,反之可選較強(qiáng)光源.測(cè)量熒光強(qiáng)度儀器：濾光片熒光分光光度計(jì)和結(jié)構(gòu)困難的精密熒光分光光度計(jì)。主要部件：激發(fā)光源:前者常用汞燈,后者常用氙燈(250~700nm).濾光片和單色器：前者接受兩個(gè)濾光片(激發(fā)濾光片/熒光濾光片)；后者接受光柵作單色器。樣品池：低熒光的玻璃或石英制成，形態(tài)以散射光較少的方形為宜。檢測(cè)器：阻擋層光電池(500~600nm最靈敏)，缺點(diǎn)：易疲憊，靈敏度低；光電倍增管檢測(cè)器：靈敏度高，運(yùn)用簡(jiǎn)潔，特殊適用于強(qiáng)度微弱光的測(cè)量。四、試驗(yàn)技術(shù)（影響熒光分析的因素）溶液的pH的影響：在溶液中，絕大多數(shù)熒光物質(zhì)都是以離子狀態(tài)形式存在的，放射熒光的最佳條件是解離的熒光分子。溫度的影響:溫度上升，熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光效率和熒光強(qiáng)度都會(huì)下降，反之。溶劑的影響：熒光物質(zhì)的熒光波峰位置和熒光強(qiáng)度與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)。不同溶劑對(duì)各種熒光物質(zhì)發(fā)生熒光的影響程度是不同的，某些溶劑可使熒光物質(zhì)形成協(xié)作物，某些溶劑可變更熒光物質(zhì)的解離狀態(tài)。激發(fā)光源的影響：光分解:熒光化合物被強(qiáng)激發(fā)光照射會(huì)發(fā)生分解，引起熒光強(qiáng)度快速下降。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。器皿污染的影響：器皿內(nèi)壁含極少量熒光物質(zhì)，會(huì)使測(cè)定結(jié)果造成偏差，最好用30%硝酸清洗。內(nèi)濾效應(yīng)的影響：在樣品溶液中存在著雜質(zhì)或測(cè)試樣品池濃度太大引起熒光變?nèi)醯默F(xiàn)象。自吸?。簶悠窛舛却?，熒光分子吸取光能和放射熒光的同時(shí)有部分重疊，而引起可檢測(cè)的熒光強(qiáng)度變?nèi)酢ｋs質(zhì)吸?。簶悠啡芤褐写嬖谀芪〖ぐl(fā)光或放射光能量的雜質(zhì)，使檢測(cè)到的光強(qiáng)度變?nèi)?。稀樣品溶液的影?氧化作用：熒光物質(zhì)的稀溶液不如濃度高的溶液穩(wěn)定，易發(fā)生氧化作用(腎上腺素，1μg/mL，100μg/mL)光分解：稀溶液相對(duì)于高濃度溶液更易發(fā)生光分解，尤其對(duì)光較敏感的物質(zhì)。表面吸附：某些非待測(cè)的熒光物質(zhì)吸附在比色皿內(nèi)壁表面上，在分析過程中這些熒光物質(zhì)放射相應(yīng)的熒光，干擾測(cè)定。對(duì)稀溶液影響大。另外，表面吸附對(duì)不同溶劑吸附程度不同，有機(jī)溶劑表面吸附更明顯。五、熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用依據(jù)發(fā)光機(jī)理，能吸取能量后以光子的形式釋放能量的化合物都屬熒光物質(zhì)。發(fā)光方式分：自熒光物質(zhì)(分子中含熒光發(fā)光基團(tuán)或化學(xué)鍵)外源熒光物質(zhì)(要與某些熒光物質(zhì)或熒光燃料以共價(jià)鍵或離子鍵的形式結(jié)合)

分析方法:1、定量分析方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）外標(biāo)法（干脆比較法）：在確定濃度范圍內(nèi)，選擇一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，將其在熒光分光光度計(jì)上測(cè)得的值與在同樣條件下的未知樣品的值進(jìn)行比較，得出未知樣品的濃度。未知樣品濃度（mg/mL）=(A1/A2)c式中，A1為未知樣品的熒光發(fā)光值，A2為標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光發(fā)光值，c為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。2、定性分析：依據(jù)熒光放射的波長(zhǎng)和出現(xiàn)的峰位，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)的某些特征.

第三節(jié)分光光度檢測(cè)技術(shù)a、目視比色法用眼睛比較溶液顏色的深淺以確定物質(zhì)濃度的方法稱為目視比色法。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)潔、操作簡(jiǎn)便；無需單色光；精確度不高。b、分光光度計(jì)基于被測(cè)物質(zhì)的分子對(duì)光具有選擇性吸取的特性而建立起來的分析方法。包括：分光光度檢測(cè)技術(shù)

（Chaptertwospectrophotography)定義:分光光度檢測(cè)技術(shù)是利用物質(zhì)所特有的吸取光譜來鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù)。特點(diǎn):靈敏、精確、快速和簡(jiǎn)便，在困難組分系統(tǒng)中，不須要分別，即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì)。應(yīng)用:生物化學(xué)探討中廣泛運(yùn)用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測(cè)。分光光度檢測(cè)的分類分光光度檢測(cè)的分類紅外分光光度檢測(cè):可見光分光光度檢測(cè):

紫外分光光度檢測(cè):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)

一、分光光度計(jì)工作原理（一）分光光度檢測(cè)的光譜范圍包括波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的放射光譜，因此可接受不同的發(fā)光體作為儀器的光源。鎢燈的放射光譜：鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜，光通過三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜；該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源。氫燈的放射光譜：氫燈能發(fā)出185～400nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外光分光度計(jì)的光源。（二）物質(zhì)的吸取光譜假如在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn)了幾條暗線，即光源放射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸取而消逝，這種被溶液吸取后的光譜稱為該溶液的吸取光譜。不同物質(zhì)的吸取光譜是不同的。因此依據(jù)溶液的吸取光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。用不同波長(zhǎng)的單色光照射，測(cè)定吸光度，假如以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)即可得一條曲線稱為吸取曲線（~A曲線）。吸收曲線清楚地描述了物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。max=510nm（1）不同物質(zhì)吸取曲線的形態(tài)和吸取波長(zhǎng)不同。MnO4-531吸取曲線（2）同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同；同一物質(zhì)不同濃度，其吸取曲線形態(tài)相像。吸取曲線是特征的，可以供應(yīng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一；吸取曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過的光的強(qiáng)度減弱。因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?，一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸取，只有一部分光可透過溶液。入射光=反射光＋分散光＋吸取光＋透過光假如我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為“空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的損失，則：入射光=吸取光十透過光(三）分光光度計(jì)常用術(shù)語C:測(cè)試溶液的濃度I:透過光的強(qiáng)度I0:空白校正后入射光的強(qiáng)度T:透光率（I/I0）A:光吸?。∣D）L:比色杯光程吸光度A：物質(zhì)對(duì)光的吸取程度。定義：A＝lg（I0/It)A越大，表示對(duì)光的吸取越大，透過光越弱。（四）依據(jù)原理：朗伯-比爾定律（Lambert–Beer）1760年朗伯(Lambert)闡明白光的吸取程度和吸取層厚度的關(guān)系：A∝b1852年比耳(Beer)又提出了光的吸取程度和吸取物濃度之間也具有類似的關(guān)系：A∝c二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，A∝bc朗伯—比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式：

A＝lg（I0/It)=εbc

式中：A，吸光度，無量剛；b，液層厚度(光程長(zhǎng)度)，cm；c，溶液的濃度，mol·L-1；ε(epsilon)稱為摩爾吸光系數(shù)，L·mol-１·cm-1，僅與入射光波長(zhǎng)、溶液的性質(zhì)及溫度有關(guān)，與濃度無關(guān)。上式表明：當(dāng)一束單色光通過溶液時(shí)，其吸光度與溶液濃度和寬度的乘積成正比。T、A、c間的關(guān)系：

A

＝lg（I0/It)=-lgT=εbc

透光度(透光率)T：透過光和入射光強(qiáng)度之比，即T=It/I0×100%T越大，表示對(duì)光的吸取越小。朗伯-比爾定律的適用條件單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測(cè)定.稀溶液濃度增大，分子之間作用增加.吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變離解、絡(luò)合、締合會(huì)破壞線性關(guān)系,應(yīng)限制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等).吸光度具有加和性：

在多組分體系中，吸光度具有加和性，即：

A（總）＝A1+A2+…+An

=ε1bc+ε2bc+…+εnbc

(五）

分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)無論哪一類分光光度計(jì)都包括5個(gè)基本部件：光源、單色器、吸取池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:分光光度計(jì)的基本部件光源:分光光度計(jì)上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源；在紫外光區(qū)多運(yùn)用氫燈。單色器：把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置。在分光光度計(jì)中多用棱鏡或光柵作為色散元件。吸取池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用來盛被測(cè)的溶液。在低于350nm的紫外光區(qū)工作時(shí)，必需接受石英池或熔凝石英池。吸取池（比色皿）必需與光束方向垂直。此外，每套比色皿的質(zhì)料、厚度應(yīng)完全相同，以免產(chǎn)生誤差。比色皿上的指紋、油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性，因此在運(yùn)用前務(wù)必徹底清洗。

檢測(cè)器：常用光電池、光電管和光電倍增管三種。測(cè)量?jī)x表：一般常用的紫外光和可見光分光光度計(jì)有3種測(cè)量裝置，即電流表、記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元?，F(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器，可自動(dòng)掃描出吸取曲線。（六）運(yùn)用分光光度法測(cè)定樣品溶液濃度的計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法（常用）標(biāo)準(zhǔn)管法標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法回來分析法其方法和步驟是：1）配制一組濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液(c1、c2……)；2）在確定波長(zhǎng)下，分別測(cè)定其吸光度(A1、A2……)。3）以A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，繪制曲線，得到一條通過原點(diǎn)的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（A-c曲線）。4）用完全相同的方法和步驟測(cè)定待測(cè)溶液的吸光度Ax，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的濃度cx值（Axcx）。標(biāo)準(zhǔn)曲線法Axcx空白標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)溶液BlankStandardSampleSamplec1c2c3c4cxc0標(biāo)準(zhǔn)曲線留意：用比色法測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)，操作