腫瘤的血管生成

腫瘤血管生成的分子機(jī)制

及常用探討方法

重慶醫(yī)科高校病理教研室

葉秀峰腫瘤血管生成的分子機(jī)制及常用探討方法

主要內(nèi)容:第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過(guò)程其次節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制第四節(jié)抗血管生成療法在腫瘤治療中的應(yīng)用第五節(jié)腫瘤血管生成常用探討方法人體腫瘤大部分為實(shí)體瘤。實(shí)體瘤瘤組織由瘤細(xì)胞和間質(zhì)構(gòu)成，后者主要包括血管、淋巴管、結(jié)締組織、炎細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等成分。其中血管和結(jié)締組織起養(yǎng)分、支持瘤細(xì)胞的作用。腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過(guò)血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實(shí)現(xiàn)的，并在腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。已有探討證明，腫瘤血管生成活躍程度對(duì)組織病理分級(jí)、放射治療以及在預(yù)后推斷上都有重要的評(píng)估價(jià)值。第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過(guò)程一、血管生成現(xiàn)象1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對(duì)血管生成重要性的相識(shí)，特殊是提出“腫瘤生長(zhǎng)依靠于血管生成”觀(guān)點(diǎn)，始于1971年Folkman對(duì)腫瘤血管生成的探討報(bào)道。

血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過(guò)程。有別于胚胎時(shí)期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過(guò)程即血管形成(vasculogenesis)。二．腫瘤血管生成的基本過(guò)程(一)血管生成的基本步驟：①血管生成因子的產(chǎn)生過(guò)多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；②血管部位細(xì)胞外基質(zhì)變更、基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞芽生、增殖和遷移；③新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫穿。(二)腫瘤血管生成的過(guò)程1．腫瘤生長(zhǎng)的階段性①無(wú)血管期(avascularphase)或稱(chēng)血管前期(prevascularphase)腫瘤直徑不超過(guò)1～2mm②血管期(vascularphase)腫瘤快速生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移2.腫瘤血管的起源腫瘤中的血管可能有3種來(lái)源：①血管生成:以?xún)煞N方式發(fā)生,一是腫瘤細(xì)胞團(tuán)先處于無(wú)血管期生長(zhǎng)，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)血管生成；另一種是瘤細(xì)胞先依靠宿主組織已存在的血管生長(zhǎng)，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成。②血管套疊性生長(zhǎng)③內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell,EPC)EPC為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,參與胚胎的血管生成,也稱(chēng)為成血管細(xì)胞。EPC主要來(lái)源于骨髓,表達(dá)CD133、CD34和VEGFR2。3．腫瘤血管生成的過(guò)程瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞→血管生成因子(VEGF)等→小血管或毛細(xì)血管伸展→內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成毛細(xì)血管芽→新生毛細(xì)血管形成并連通。其次節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個(gè)腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱(chēng)為所謂“血管熱點(diǎn)區(qū)”(hotspots)，這也是進(jìn)行腫瘤微血管密度測(cè)定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長(zhǎng)活躍的邊緣。腫瘤的新生血管分布上常常無(wú)規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍舊不完善。內(nèi)皮細(xì)胞比較無(wú)趣，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時(shí)血管外的腫瘤細(xì)胞可干脆與血管管腔相連。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。不同類(lèi)型腫瘤間質(zhì)血管沒(méi)有本質(zhì)區(qū)分，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。生長(zhǎng)活躍的惡性腫瘤常富于血管。如內(nèi)分泌腫瘤、腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等。不同腫瘤血管的形態(tài)又有確定的差異，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細(xì)胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細(xì)胞癌等血管呈壁薄、明顯擴(kuò)張的血竇?？傊?，腫瘤微血管形態(tài)特點(diǎn)是：遍布整個(gè)腫瘤組織，但分布不均一，無(wú)規(guī)律，分支紊亂；管腔不規(guī)則，結(jié)構(gòu)上不完善；內(nèi)皮細(xì)胞比較無(wú)趣，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時(shí)血管外的腫瘤細(xì)胞可干脆與血管管腔相連。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是其具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。二、腫瘤微血管的生物學(xué)特性①低反應(yīng)性②高通透性③低供氧實(shí)力

第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制一、血管生成因子

(一)VEGF及其受體家族

(二)細(xì)胞外基質(zhì)與基質(zhì)金屬蛋白酶

(三)Ets家族成員

(四)纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族及其受體

(五)血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)（六）其它血管生成因子二.血管生成抑制因子（一）大分子蛋白前體酶解片段

(二)細(xì)胞因子（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑（四）組織金屬蛋白酶抑制劑（五）抑癌基因腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變更的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進(jìn)血管生成。組織中同時(shí)也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對(duì)血管生成起抑制作用。一、血管生成因子血管生成的始動(dòng)須要血管生成因子。一系列血管生成因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機(jī)械性因子均參與了血管生成過(guò)程。(一)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體家族1．血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）又稱(chēng)血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，為分子量34-45kD的同源二聚體糖蛋白。VEGF基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個(gè)氨基酸組成。其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴(kuò)散力強(qiáng)，易于到達(dá)靶細(xì)胞。近年又發(fā)覺(jué)其他一些與VEGF功能相像、結(jié)構(gòu)上有確定同源性的多肽因子，包括胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相關(guān)因子，VEGF-relatedfactor，VRF)，VEGF-C(VEGF相關(guān)蛋白，VEGF-relatedprotein，VRP)，以及VEGF-D／FIGF和VEGF-E等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族。VEGF主要由血管四周的細(xì)胞產(chǎn)生，并通過(guò)旁分泌機(jī)制作用于內(nèi)皮細(xì)胞，在促進(jìn)血管形成、抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及提高血管通透性等方面發(fā)揮重要作用。2．VEGF受體類(lèi)型：VEGF只有與其特異性受體結(jié)合后才能發(fā)揮生物學(xué)功能。目前，已鑒定并克隆出3種受體，即VEGF受體l(VEGFR-1，又稱(chēng)flt-1)、VEGF受體2(VEGFR-2，又稱(chēng)flk-1或KDR)及VEGF受體3(VEGFR-3又稱(chēng)flt-4),均屬酪氨酸激酶受體，稱(chēng)為Flt家族。前兩種受體一般只表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，但間或在其它類(lèi)型細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)；Flt-4在胎兒早期靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞上呈一過(guò)性表達(dá),胎兒后期和誕生后的內(nèi)皮細(xì)胞則不再表達(dá)；在成人Flt-4只在淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。由于Flt家族基因的表達(dá)部位不同，其配體的結(jié)合部位也不同。早期血管的形成須要VEGF的調(diào)整，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過(guò)其受體VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1／KDR)促進(jìn)內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)須要VEGFR-1的表達(dá)和激活，而VEGFR-3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)整纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎全部的人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中皆有過(guò)表達(dá)。VEGF及其受體在腫瘤中的表達(dá)常與腫瘤分化程度親密相關(guān)。大多數(shù)實(shí)體瘤VEGF基因均有過(guò)表達(dá)，VEGF165、VEGF121兩種VEGF最常見(jiàn)。在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有探討報(bào)道，人體多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF-C。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)也證明，腫瘤細(xì)胞VEGF-C的高表達(dá)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGF-C和VEGF-D還來(lái)源于浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。

缺氧是很多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個(gè)猛烈的誘導(dǎo)因子。離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達(dá)的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)整作用。多種癌基因的激活通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)而誘導(dǎo)血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過(guò)程。(二)細(xì)胞外基質(zhì)與基質(zhì)金屬蛋白酶細(xì)胞外基質(zhì)：人體各種組織均由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)構(gòu)成支架，依據(jù)其分布部位、組成成分及功能的不同可將其分為基膜(BM)和間質(zhì)結(jié)締組織兩大類(lèi)。ECM成分由4大家族組成：膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白、ECM糖蛋白。目前發(fā)覺(jué)ECM糖蛋白有10余種，如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等。其中FN主要分布于皮膚、肌腱、血管壁和骨基質(zhì)等組織。多數(shù)ECM糖蛋白具有粘附功能，這種功能的發(fā)揮與其分子內(nèi)部含有的某些特殊的蛋白片段有關(guān)，通過(guò)這些片段，ECM糖蛋白就可以與細(xì)胞及ECM其它成分結(jié)合，參與細(xì)胞的粘附、遷移、生長(zhǎng)和分化。2.基質(zhì)金屬蛋白酶的家族成員：隨著現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)理論和試驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，大量的MMPs被發(fā)覺(jué)、分別、純化及測(cè)序。它們廣泛地分布于動(dòng)植物界，幾乎能降解全部生物體內(nèi)的ECM成分。到目前為止，MMPs家族至少包含20種酶，而且其新成員仍在接著增加。3.基質(zhì)金屬蛋白酶的促新血管形成作用：電鏡視察顯示，新的毛細(xì)血管?chē)森h(huán)狀及新合成的細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積、鋪墊后，血管環(huán)前端新合成的BM就起先了MMPs所介導(dǎo)的蛋白水解過(guò)程，內(nèi)皮細(xì)胞遷移將始于局部水解，形成一個(gè)新的毛細(xì)血管芽，隨后又經(jīng)驗(yàn)了一系列細(xì)胞外蛋白水解酶的活化與抑制的動(dòng)態(tài)循環(huán)。體外細(xì)胞培育發(fā)覺(jué)，當(dāng)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培育于BM樣物質(zhì)上時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞很快排成直線(xiàn)，圍成管狀，編織成血管網(wǎng)。4.MMPs在不同癌組織中的表達(dá)：人類(lèi)癌組織種類(lèi)繁多，探討癌細(xì)胞所產(chǎn)生的各種MMPs分子的特點(diǎn)及其在各種癌組織中的分布狀況，對(duì)了解癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程有重要意義。已有資料表明，不同種類(lèi)的癌細(xì)胞所表達(dá)的MMPs分子種類(lèi)和表達(dá)量也不相同。例如:乳腺癌:MMP-7，-8及-13表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織。5.MMPs激活與癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移：多數(shù)癌組織中潛在型MMP-2的激活程度是癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。因此檢測(cè)癌組織內(nèi)MMP-2活化酶MT-MMP對(duì)癌的治療具有重要意義。

(三)Ets家族成員Ets原癌基因于1983年分別在不同的試驗(yàn)室中分別成功。迄今發(fā)覺(jué)至少有Ets-1、Ets-2等11種Ets基因家族成員。Ets-1與新血管形成：血管四周基膜的分解和內(nèi)皮細(xì)胞本身的遷移力是血管生成的兩個(gè)關(guān)鍵因素。前者主要與MMPl有關(guān)，后者則主要與Ets-1有關(guān)。已發(fā)覺(jué)的4種典型的血管生長(zhǎng)因子aFGF、bFGF、VEGF及EGF都能調(diào)整人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、ECV-304細(xì)胞以及人網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ets-1mRNA的表達(dá)。上述培育的細(xì)胞當(dāng)受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，2小時(shí)后其ets-lmRNA的表達(dá)呈最高值，12小時(shí)后又復(fù)原到原來(lái)水平。如用VEGF刺激培育的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，其DNA-Ets復(fù)合物明顯增多；而用VEGF和GGAA(Ets功能域的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，controlcompetior)，同時(shí)刺激培育的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，DNA-Ets復(fù)合物的量則明顯削減。血管生長(zhǎng)因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞Ets-1mRNA的表達(dá)，而且其作用受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)整。(四)纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族及其受體目前探討最為深化的是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)，兩者在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的。bFGF是一種廣泛存在于人體各組織中的生物活性物質(zhì)，被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等生長(zhǎng)的刺激物。bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長(zhǎng)因子之一，如腦、心、肝、胎盤(pán)和白細(xì)胞等均有存在。bFGF除分布于細(xì)胞內(nèi)，還分布于很多細(xì)胞的胞膜及胞外基質(zhì)中。它也可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等很多培育的細(xì)胞系都可以合成它。其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。bFGF和aFGF均與肝素有很強(qiáng)的親和力，探討表明這種高親和力對(duì)于FGF與細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合是特別重要的。bFGF的生物學(xué)作用是通過(guò)與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)識(shí)別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。FGFR-1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中FGFR-1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織中有些細(xì)胞呈現(xiàn)FGFR-1陽(yáng)性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細(xì)胞亦是如此。(五)血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PDGF)

血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的肽類(lèi)生長(zhǎng)因子。由于其在組織修復(fù)、胚胎發(fā)育、免疫及多種常見(jiàn)疾病的愈復(fù)中起著重要作用。除血小板外，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤(pán)和胚胎細(xì)胞、系膜細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞均可產(chǎn)生和釋放PDGF。纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞均存在PDGF受體。PDGF與細(xì)胞膜上的專(zhuān)一受體結(jié)合后可誘發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要表現(xiàn)在3方面：①促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂：PDGF能刺激多種細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等的分裂、增殖；②趨化性：PDGF對(duì)纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞有趨化性，β受體介導(dǎo)趨化反應(yīng)，而α受體則抑制趨化反應(yīng)；③血管收縮效應(yīng)：PDGF收縮大鼠主動(dòng)脈的作用較經(jīng)典的血管驚惶素II更猛烈。此外，PDGF通過(guò)影響骨骼肌中細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的相互作用而致細(xì)胞骨架重排，還參與胚胎的發(fā)育和生長(zhǎng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程。（六）其它血管生成因子舒血管素(Angiotropin)、血管新生素（Angiogenin）表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等也能刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括缺氧誘導(dǎo)因子-1、-2(hypoxiainducingfactor-l，-2，HIF-1．HIF-2)和NF-κB,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。血管生成因子二.血管生成抑制因子體內(nèi)存在內(nèi)源性的血管生成抑制因子，它們通過(guò)影響血管生成過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗血管生成的活性。血管生成抑制因子大致可分為7類(lèi)：大分子蛋白前體酶解片段、細(xì)胞因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、含TSPI型重復(fù)模序的血管生成抑制因子、組織金屬蛋白酶抑制劑、抑癌基因及其它血管生成抑制因子。（一）大分子蛋白前體酶解片段這些大分子蛋白前體分別來(lái)源于血漿(如纖溶酶原、抗凝血酶)和胞外基質(zhì)(如膠原蛋白、基底膜蛋白多糖、纖連蛋白)。1.纖溶酶原酶解片段——血管生成抑制素血管生成抑制素(angiostatin)是最先發(fā)覺(jué)的內(nèi)源性血管生成抑制因子之一，它是纖溶酶原的蛋白酶解產(chǎn)物，最初在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分別得到。血管生成抑制素特異作用于內(nèi)皮細(xì)胞，它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，它通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮作用。已發(fā)覺(jué)的血管生成抑制素受體：ATP合成酶的α/β、angiomotion和整體聯(lián)蛋白α5β3。2.抗血管生成性抗凝血酶Ⅲ(antiangiogenicantithrombinⅢ，aaAT)探討表明aaAT是切除了羧基端環(huán)的抗凝血酶。aaAT可特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而不作用于其它正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。aaAT對(duì)血管生成的抑制作用有劑量依靠性。3.內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin)

它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素主要的抗血管生成活性是通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)現(xiàn)的：它可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的α5β1整聯(lián)蛋白結(jié)合，抑制FAK的激活,進(jìn)一步影響其下游ERKl／p38MAPK的活化，從而抑制細(xì)胞的遷移、影響細(xì)胞的存活。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。(二)細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-12、IL-18是具有多種功能的調(diào)整性細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤有干脆的抑制作用。近年來(lái)的探討發(fā)覺(jué)它們也可以通過(guò)間接的作用方式抑制血管的生成，來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的。它們可以通過(guò)下調(diào)VEGF和FGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮抑制血管生成的活性。白細(xì)胞介素-12(IL-12)則是通過(guò)提高IFN-γ的表達(dá)水平，引致IP-10水平增高來(lái)發(fā)揮其抗血管生成的功能。（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serineproteaseinhibitor，Serpin)絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族是由一系列具同源性的蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)家族。某些Serpin家族成員有抑制血管生成的活性，這些成員包括PEDF(pigmentepithelium-derivedfactor)、maspin、血管驚惶素原等。PEDF是眼內(nèi)最重要的血管生成抑制因子。它抑制血管生成的作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，它特異性作用于激活的內(nèi)皮細(xì)胞，而不會(huì)影響靜止的內(nèi)皮細(xì)胞。（四）組織金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitorofMMP，TIMP)TIMP是體內(nèi)自然存在的金屬蛋白酶抑制物，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP在兩個(gè)階段對(duì)MMP的活性進(jìn)行抑制。一是在MMP酶原活化階段，TIMP與MMP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制其自我活化；二是在MMP活化之后，與其依據(jù)1：1的比例結(jié)合，對(duì)其活性進(jìn)行抑制。（五）抑癌基因(Tumorsuppressorgene)1.p53p53突變是腫瘤中最常見(jiàn)的基因突變。p53基因編碼的產(chǎn)物P53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)調(diào)整下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能，其中之一是抑制血管生成。P53的靶基因中包括多種調(diào)整細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的基因，它通過(guò)激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。P53還通過(guò)影響血管生成調(diào)整因子VEGF的水平抑制血管生成。2.VHLVHL綜合征(vonHippel-Lindaudisease)是一種以多個(gè)器官發(fā)生腫瘤為特征的遺傳性疾病，它的致病緣由是VHL抑癌基因的種系突變。與VHL綜合征相關(guān)的腫瘤，如視網(wǎng)膜血管瘤、小腦血管瘤、脊柱血管瘤等都是高度血管化的腫瘤。靶向阻斷小鼠肝臟的VHL基因，會(huì)導(dǎo)致小鼠肝實(shí)質(zhì)血管化程度加強(qiáng)。這些現(xiàn)象提示我們，VHL可能有抑制血管生成的作用。3.PTEN探討發(fā)覺(jué)PTEN可以下調(diào)血管生成因子VEGF的表達(dá)，這一結(jié)果說(shuō)明PTEN有抑制血管生成的作用。第四節(jié)抗血管生成療法在腫瘤治療中的應(yīng)用血管生成是腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征，抑制血管的生成對(duì)這些疾病的治療有重要的意義。Fo1kman在1971年提出血管生成與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)，可以通過(guò)抑制腫瘤的血管生成達(dá)到治療腫瘤的目的。在腫瘤生長(zhǎng)的最初階段，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)擴(kuò)散的方式吸取養(yǎng)分。但腫瘤的體積達(dá)到2-3mm3時(shí)，由于缺乏足夠的養(yǎng)分和氧氣，其生長(zhǎng)受到限制，此時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖和死亡達(dá)到平衡，腫瘤處于休眠狀態(tài)，幾乎不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這種狀態(tài)可能維持長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久。此后，在某些因素(缺氧、癌基因)的誘導(dǎo)下，血管生成因子處于上調(diào)狀態(tài)，并且(或者)血管生成抑制因子處于下調(diào)狀態(tài)，打破了兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡，使得血管生成機(jī)制處于開(kāi)啟狀態(tài)，起先血管生成的過(guò)程。新生血管為腫瘤的接著增殖供應(yīng)了足夠的氧氣和養(yǎng)分物質(zhì)，使腫瘤得以快速生長(zhǎng)。絕大多數(shù)實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)都須要有血管的生成。原發(fā)瘤的血管生成過(guò)程也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)人血液循環(huán)，轉(zhuǎn)移到其它器官供應(yīng)了機(jī)會(huì)，因此血管生成不僅是腫瘤生長(zhǎng)的前提條件，也是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。與傳統(tǒng)的以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療方法(放療、化療)相比，血管生成抑制劑以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，具有低毒、廣譜及不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)。一、血管生成抑制劑在腫瘤治療中的應(yīng)用近年來(lái)以血管為靶點(diǎn)治療腫瘤成為腫瘤探討的熱點(diǎn)之一，血管生成過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)都可能成為抗血管生成的潛在靶點(diǎn)。腫瘤的血管生成受到多種血管生成因子的調(diào)控，VEGF是其中作用最強(qiáng)、專(zhuān)屬性最高的血管生成因子，這使它成為抗血管生成藥物探討的熱點(diǎn)之一。目前有多種針對(duì)VEGF、VEGFR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物在探討之中，此外還開(kāi)發(fā)了多種針對(duì)其它生長(zhǎng)因子及MMP的小分子藥物，其中某些已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。二、內(nèi)源性血管生成抑制因子在腫瘤治療中的應(yīng)用目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的內(nèi)源性血管生成抑制因子包括血管生成抑制素、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素等。以?xún)?nèi)皮細(xì)胞抑制素為例:在以L(fǎng)ewis肺癌小鼠為模型的體內(nèi)抑癌試驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞抑制素使腫瘤完全消退的劑量是20mg／kg／d，而血管生成抑制素的用量則高達(dá)100mg／kg／d。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的高效抑瘤活性使它成為第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的此類(lèi)血管生成抑制因子。接受注射重組血管生成抑制因子的方式治療腫瘤存在某些局限性(需長(zhǎng)期用藥、重復(fù)注射、用量高、成本高、蛋白不易獲得)，所以接受血管生成抑制因子進(jìn)行基因治療的方式越來(lái)越受到重視。接受基因療法治療腫瘤，基因可在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)、不需在短期內(nèi)頻繁注射、藥物用量少、成本低，較蛋白療法有更大的應(yīng)用潛力。有人將帶有內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的質(zhì)粒載體對(duì)小鼠進(jìn)行肌肉注射，視察到血清內(nèi)皮細(xì)胞抑制素水平上升，小鼠腦轉(zhuǎn)移腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢。三、抗血管生成療法的發(fā)展趨向雖然已經(jīng)有數(shù)種血管生成抑制劑進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，但它們?cè)谌梭w試驗(yàn)中所顯示的抑瘤效果并不如動(dòng)物試驗(yàn)所顯示的結(jié)果志向，這說(shuō)明體內(nèi)特殊是腫瘤的血管生成過(guò)程是一個(gè)有多種因素參與、多條信號(hào)通路調(diào)控的極其困難的過(guò)程，單獨(dú)運(yùn)用某種血管生成抑制因子或是阻斷與血管生成相關(guān)的某條信號(hào)通路并不能完全阻斷血管的生成。假如可以嘗試將幾種作用機(jī)制不同的血管生成抑制因子(如血管生成抑制素與內(nèi)皮細(xì)胞抑制素)聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)會(huì)取得較單獨(dú)運(yùn)用一種因子更好的效果。此外，抑制腫瘤的血管生成，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，因此將抗血管生成療法與放化療聯(lián)合應(yīng)用，有望取得更好的治療效果。Folkman的理論為腫瘤的治療開(kāi)拓了一條嶄新的道路：抑制腫瘤的血管生成，阻斷腫瘤的養(yǎng)分供應(yīng)，可導(dǎo)致腫瘤的萎縮、退化；同時(shí)，抑制腫瘤新生血管生成，還可以阻斷腫瘤的血道轉(zhuǎn)移，抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。用血管生成抑制劑治療腫瘤具有高效、低毒的特點(diǎn)，不易產(chǎn)生耐藥性，還可以增加放療、化療的效果，削減放、化療的劑量，降低毒性。因此，抗血管生成療法在腫瘤的治療中有廣袤的應(yīng)用前景。第五節(jié)腫瘤血管生成常用探討方法

第一部分體外試驗(yàn)其次部分體內(nèi)試驗(yàn)第三部分整體試驗(yàn)第一部分體外試驗(yàn)1.血管內(nèi)皮細(xì)胞分別培育方法2.內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)3.胎盤(pán)血管培育試驗(yàn)4.腫瘤微血管密度計(jì)數(shù)5.連續(xù)切片三維重建6.微血管鑄型法7.掃描共聚焦顯微鏡三維重建8.血管內(nèi)皮遷移試驗(yàn)9.小管形成試驗(yàn)10.器官培育測(cè)定試驗(yàn)其次部分體內(nèi)試驗(yàn)1.雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)2.角膜微囊試驗(yàn)3.海綿植入試驗(yàn)4.圓盤(pán)血管生成系統(tǒng)5.基質(zhì)膠栓試驗(yàn)6.海綿-基質(zhì)膠試驗(yàn)第三部分整體試驗(yàn)1.斑馬魚(yú)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?.爪蟾蝌蚪試驗(yàn)?zāi)Ｐ?.腫瘤模型第一部分體外試驗(yàn)1.血管內(nèi)皮細(xì)胞分別培育方法微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別方法主要有3種，包括酶消化法、機(jī)械分別法和磁珠分別法，最常用的是酶消化法。酶消化法的優(yōu)點(diǎn)是分別的細(xì)胞多，純度較高，缺點(diǎn)是酶對(duì)某些表面蛋白有破壞作用；后兩種方法可以避開(kāi)酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，缺點(diǎn)是其他細(xì)胞的污染可能性較大。（下面以酶消化法為例）第一步分別血管內(nèi)皮細(xì)胞的分別是將剪碎的組織浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最終被消化下來(lái)的細(xì)胞才是內(nèi)皮細(xì)胞。因此，徹底地消化組織是獲得足夠微血管內(nèi)皮細(xì)胞的前提，且非血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染是不行避開(kāi)的。為了能分別獲得足夠的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，接受過(guò)量的酶消化是必要的。其次步細(xì)胞的純化血管內(nèi)皮細(xì)胞的分別過(guò)程中必定伴隨非血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化是確定血管內(nèi)皮細(xì)胞培育成功與否的關(guān)鍵，也是血管內(nèi)皮細(xì)胞培育的技術(shù)難度所在。目前已經(jīng)建立了多種微血管內(nèi)皮細(xì)胞純化的方法。血管內(nèi)皮細(xì)胞純化的方法主要有：1.用尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液、2.物理刮除法、3.生長(zhǎng)特性選擇法、4.局部消化法、5.差速黏附法、6.免疫磁珠法等，可以依據(jù)不同細(xì)胞的培育特性或生物特性選擇其中幾種方法進(jìn)行純化。第三步內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定目前為止，還沒(méi)有發(fā)覺(jué)不同器官組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有共同的特異蛋白或標(biāo)記。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定大多是依據(jù)器官和組織的起源，從形態(tài)、表型、生化和功能等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。血管內(nèi)皮細(xì)胞一般呈單層生長(zhǎng)，有接觸抑制現(xiàn)象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。其表面可以表達(dá)CD31、CD34、凝血調(diào)整蛋白和第Ⅷ因子等，可以攝取低密度脂蛋白，產(chǎn)生前列腺素(PGI2和PGE2)，表達(dá)E-選擇素，內(nèi)吞功能，結(jié)合植物血凝素，形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。不管利用那種方法，培育的內(nèi)皮細(xì)胞都可依據(jù)某些特征進(jìn)行鑒定。內(nèi)皮細(xì)胞可以利用其表面表達(dá)血管驚惶素合成酶、攝取乙?；兔芏戎鞍准暗冖蜃拥谋磉_(dá)進(jìn)行鑒定。內(nèi)皮細(xì)胞在培育條件下可以形成管形，像原始血管形成或損傷后血管再生，這被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)有的特征。但有報(bào)道說(shuō)培育的上皮也可以形成管形。因此，一般狀況下探討者們接受最有利的方法獲得高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，并用多種方法進(jìn)行鑒定。血管內(nèi)皮細(xì)胞的培育要點(diǎn)依據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，須要接受一些特殊的培育條件，并且這些培育條件可能因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞的起源不同而有所差異。血管內(nèi)皮細(xì)胞的培育一般選用DMEM、M199等基礎(chǔ)培育基，pH7.2，添加150mL/L～200mL/L的胎牛血清、1000單位/mL雙抗，20g/L谷氨酰氨，還需添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(一般添加濃度為1%)。依據(jù)其接觸抑制現(xiàn)象需剛好進(jìn)行傳代培育。2.內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)2.1內(nèi)皮細(xì)胞增殖檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管發(fā)生的重要步驟。目前,已有多種成熟的細(xì)胞增殖測(cè)定方法,如四氮唑鹽還原法和[3H]-胸腺嘧啶摻入法等細(xì)胞增殖測(cè)定方法。2.1.1四氮唑鹽還原法(又稱(chēng)MTT比色法)是一種最常用的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法?；罴?xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。MTT結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已被用于檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,并廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。2.1.2[3H]-胸腺嘧啶摻入法

是一種更好的測(cè)定細(xì)胞增殖的方法。將同位素氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)作為DNA合成的前體摻入到增殖細(xì)胞中,通過(guò)放射自顯影視察細(xì)胞增殖狀況。2.2血管生成調(diào)控因子（生長(zhǎng)/抑制因子）的檢測(cè)血管生成調(diào)控因子很多，但多數(shù)都是蛋白質(zhì)，依據(jù)試驗(yàn)條件和須要可以從核酸水平或蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè):2.2.1血管生長(zhǎng)（抑制）因子核酸水平檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)血管生長(zhǎng)（抑制）因子的mRNA表達(dá)：是以RNA為起始膜板產(chǎn)生cDNA,再以cDNA為膜板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。（略）

2.2.2血管生長(zhǎng)（抑制）因子蛋白質(zhì)水平檢測(cè)2.2.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）定義：用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。用于檢測(cè)體液中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)（抑制）因子。分類(lèi)：間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（CompetitiveELISA)

：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體2.2.2.2免疫組織化學(xué)/免疫熒光標(biāo)記（定位或半定量）免疫組織化學(xué)（略）免疫熒光組織化學(xué)原理：依據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來(lái)的低能態(tài)，這時(shí)發(fā)出光明的熒光（黃綠色或橘紅色），用熒光顯微鏡可見(jiàn)熒光所在的組織或細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及用定量技術(shù)測(cè)定含量。2.2.2.3免疫印記（Westernblot）基本原理:免疫印跡又稱(chēng)Western印跡(Western

blot)，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對(duì)應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分別的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測(cè)特異性組分。不同的是，Westernblot所檢測(cè)的是抗原類(lèi)蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳辨別力高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從困難混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)，以及從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。Westernblot的過(guò)程分四階段:a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測(cè)定b.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）c.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)d.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)(雜交)2.2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞功能定性和定位免疫組織化學(xué)/免疫熒光標(biāo)記定量ELISA、Westernblot及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3.胎盤(pán)血管培育試驗(yàn)特點(diǎn)：該試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒豁氁油庠葱陨L(zhǎng)因子，該模型是篩選人類(lèi)血管生成潛在激活增加因子和抑制因子行之有效的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。試?yàn)步驟：（1）從剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時(shí)之內(nèi)的人胎盤(pán)頂端表面截取約長(zhǎng)2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。

（2）將血管培育在48孔培育板中，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培育基，將血管片段在凝固前快速加入培育孔中心，志向的是使血管片段懸浮于培育膠中。（3）然后將培育板置37℃保濕孵育培育14～21天，每周換培育基2次。（4）用減數(shù)成像系統(tǒng)計(jì)算原來(lái)血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計(jì)數(shù)新生長(zhǎng)形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長(zhǎng)曲線(xiàn)。（5）用免疫組化、流式細(xì)胞儀、電鏡等分別檢測(cè)了CD34，Weibel-Palade小體標(biāo)記物等，證明新生血管中含有內(nèi)皮細(xì)胞。

4.腫瘤微血管密度計(jì)數(shù)(MVD)用CD31或CD34等抗體在組織切片上對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記,血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。MVD計(jì)數(shù)：先在低倍視野內(nèi)找到微血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目。辨別不清或染色模糊的細(xì)胞不計(jì)入結(jié)果，單個(gè)的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個(gè)血管計(jì)數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。計(jì)5個(gè)視野的MVD，取其平均值作為MVD。MVD可以作為腫瘤血管生成的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，提示腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。

5.連續(xù)切片三維重建法物體切片二維參數(shù)為人們供應(yīng)了物體某一截面的二維信息。假如將物體不同截面上的二維圖像依據(jù)截面的空間關(guān)系依次排列，便可組成物體的三維數(shù)據(jù)。連續(xù)切片的計(jì)算機(jī)三維重建技術(shù)是對(duì)某一結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)超薄切片，然后把這一系列切片的圖像，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，從而得到該結(jié)構(gòu)的立體形態(tài)的一種方法。在利用計(jì)算機(jī)圖像處理理論、圖形生成理論以及視覺(jué)心理學(xué)，在二維平面上形象地顯示物體的三維圖像，這就是計(jì)算機(jī)三維重建過(guò)程。該技術(shù)包括：1.連續(xù)切片技術(shù)2.二維圖像的處理技術(shù)3.三維重建技術(shù)6.微血管鑄型法原理：將鑄型材料（聚甲基丙烯酸甲酯）灌注到動(dòng)物體內(nèi)（生前經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至升主動(dòng)脈），灌注12-24小時(shí)后處死動(dòng)物，10%福爾馬林固定2-3天后，用24%鹽酸腐蝕掉組織（留下血管），離子鍍膜機(jī)鍍金，掃描電鏡下視察微血管狀況。微血管鑄型材料接受聚甲基丙烯酸甲酯。聚甲基丙烯酸甲酯是一種高分子合成樹(shù)酯,它是由甲基丙烯酸甲酯通過(guò)聚合反應(yīng)生成,單體是液態(tài),聚合體是固態(tài)。聚合反應(yīng)過(guò)程分為引發(fā)、發(fā)展和終止階段。單體加入引發(fā)劑后,產(chǎn)生活化中心,即為引發(fā)階段放射性骨壞死邊緣的微血管鑄型圖7.激光掃描共聚焦顯微鏡三維重建法激光掃描共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，把光學(xué)成像的辨別率提高了30%~40%，運(yùn)用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上視察諸如Ca2+、pH值，膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變更，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的探討工具。激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于視察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞等，能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和PH值變更探討，神經(jīng)遞質(zhì)探討，熒光原位雜交探討（FISH），細(xì)胞骨架探討，基因定位探討，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白復(fù)原探討（FRAP），胞間通訊探討，蛋白質(zhì)間探討，膜電位與膜流淌性等探討，完成圖像分析和三維重建等分析。

共聚焦顯微鏡的辨別率超過(guò)一般光學(xué)顯微鏡，染色過(guò)程簡(jiǎn)便，可以在活細(xì)胞上進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性的染色，最大程度地維持細(xì)胞的正常形態(tài)。多種自發(fā)性的熒光染料，已被廣泛地用于諸如RNA、DNA細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，將不同波長(zhǎng)的兩三種熒光物質(zhì)標(biāo)記在內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)的相應(yīng)抗體上，以這幾種熒光物質(zhì)特定的光譜特性選擇激發(fā)光和濾光片，則可以視察到細(xì)胞內(nèi)部各結(jié)構(gòu)間的毗鄰關(guān)系。共聚焦顯微鏡生成厚度小于0.2微米的依次相連的光學(xué)切片，即使較厚的組織的三維數(shù)據(jù)也可被計(jì)算機(jī)獲得，運(yùn)用適當(dāng)?shù)膱D像分析軟件，可以測(cè)量并確定所視察結(jié)構(gòu)的表面特征，體積等參數(shù)，為相互結(jié)合定量測(cè)量供應(yīng)了新手段。

激光掃描共聚焦顯微鏡可以將各層面的微血管圖像進(jìn)行三維重建和處理。從而，可以分析微血管的三維立體特征及其空間關(guān)系。8.血管內(nèi)皮遷移試驗(yàn)?zāi)壳?，?duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，已經(jīng)有很多有效的測(cè)定方法。其中以改良的BoydenChamber或Transwell法最常用。這些方法均是通過(guò)觀(guān)測(cè)穿過(guò)確定孔徑(如8μm)硝酸纖維素薄膜的細(xì)胞數(shù)量,確定細(xì)胞遷移實(shí)力。8.1BoydenChamber試驗(yàn):Boyden室由兩層組成,兩層之間為膠原包被的多孔的多聚碳酸鹽濾膜;血管內(nèi)皮細(xì)胞放于上層,同時(shí)加入待測(cè)藥物,共同培育6h后,除去上層的細(xì)胞,下層細(xì)胞用甲醇固定,HE染色,光鏡下計(jì)算下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。該方法優(yōu)點(diǎn)在于它對(duì)藥物濃度梯度差異很敏感。但對(duì)試驗(yàn)技術(shù)要求較高且計(jì)數(shù)方法不同可能會(huì)造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差較大。因此有必要建立一個(gè)嚴(yán)格的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以削減因方法不同產(chǎn)生的誤差。8.2Transwell試驗(yàn)：這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是Transwell小室，其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，依據(jù)試驗(yàn)須要，可有不同選擇。其關(guān)鍵部分都是一樣的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與一般的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1－12.0微米，依據(jù)不同須要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。將Transwell小室放入培育板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培育板內(nèi)稱(chēng)下室，上室內(nèi)盛裝上層培育液，下室內(nèi)盛裝下層培育液，上下層培育液以聚碳酸酯膜相隔。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培育液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以探討下層培育液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培育、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的探討。

8.3劃痕損傷試驗(yàn)：在國(guó)外出現(xiàn)較早。用移液器滴頭或刀片在單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的培育皿上劃痕，為邊緣內(nèi)皮細(xì)胞遷移供應(yīng)一袒露區(qū)域。經(jīng)過(guò)創(chuàng)傷后邊緣的單層內(nèi)皮細(xì)胞可遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，并重新形成新的單層內(nèi)皮細(xì)胞層。在光鏡下計(jì)數(shù)從損傷邊緣遷移出的細(xì)胞數(shù)和遷移的相對(duì)距離，并計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際遷移距離。然而這種方法的定量具有隨意性。9.小管形成試驗(yàn)小管形成試驗(yàn)?zāi)苣M人體內(nèi)毛細(xì)血管生成的過(guò)程,包括內(nèi)皮細(xì)胞出芽增殖和毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成等步驟,接近人體內(nèi)血管生成的實(shí)際過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠、纖維蛋白膠、膠原等基質(zhì)上培育時(shí)能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用電子顯微鏡來(lái)分析小管間的緊密連接,從而定量血管生成狀況。試驗(yàn)一般接受24孔培育板,但它底面積大，Matrigel用量多,計(jì)數(shù)區(qū)域大只能隨機(jī)選擇幾個(gè)典型區(qū)域且數(shù)據(jù)分析耗時(shí)長(zhǎng)。Sanz等接受384孔和536孔培育板培育可節(jié)約膠的用量,借助計(jì)算機(jī)可以計(jì)算整個(gè)孔的小管及小管之間的連接數(shù)及小管的長(zhǎng)度和面積。改進(jìn)方法后削減了原來(lái)分析困難及重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。10.器官培育測(cè)定試驗(yàn)器官培育試驗(yàn)極大地推動(dòng)了對(duì)血管形成的測(cè)定。器官血管形成測(cè)定法包括鼠主動(dòng)脈環(huán)、雞主動(dòng)脈弓、豬頸動(dòng)脈、胎兒鼠骨移植測(cè)定法等。這些測(cè)定法特別相像，其中鼠主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定應(yīng)用最為廣泛。取下大鼠主動(dòng)脈后,剪成1mm寬的血管環(huán),再用纖維蛋白膠或膠原蛋白膠包埋,然后以無(wú)血清的MCDB131培育液培育。培育過(guò)程中每天計(jì)算主動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生的新生微血管數(shù)并進(jìn)行定量分析。用不同膠培育的大鼠主動(dòng)脈環(huán)新生血管的生長(zhǎng)曲線(xiàn)不同。膠原包埋的主動(dòng)脈環(huán),培育1周時(shí)血管數(shù)達(dá)到頂峰,第2周起先萎縮。2002年有人將此方法改進(jìn),接受更薄的膠層包埋動(dòng)脈環(huán)使得新生成血管染色更便利;應(yīng)用雙重染色法和共聚焦顯微鏡在同一層面上視察到內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞及外周細(xì)胞共同存在并證明白新生血管主要由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。動(dòng)脈環(huán)取材范圍廣泛,視察方法簡(jiǎn)潔,可從分子水平闡明血管生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制,是一個(gè)較好的體外血管生成模型。其次部分體內(nèi)試驗(yàn)1.雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)2.角膜微囊試驗(yàn)3.海綿植入試驗(yàn)4.圓盤(pán)血管生成系統(tǒng)5.基質(zhì)膠栓試驗(yàn)6.海綿-基質(zhì)膠試驗(yàn)1.雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)(CAM)特點(diǎn)：1.方法簡(jiǎn)便且成本低，儀器設(shè)備條件要求不高；2.易于操作，便于推廣；3.可用于進(jìn)行大樣本探討，4.可用于影響血管生成因素或藥物的篩選和評(píng)價(jià)。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗(yàn)主要步驟：(1)．雞胚準(zhǔn)備和接種組織：(2)組織接種：

(3)接種組織的收獲與視察：CAM血管生成試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠猛荆孩贆z測(cè)評(píng)價(jià)接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析探討血管生成促進(jìn)因子、抑制因子的活性和作用的檢測(cè)，如腫瘤血管生成的探討等；②對(duì)接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進(jìn)行探討，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用。比照抗血管生成藥物作用以后2.角膜微囊試驗(yàn)1.動(dòng)物模型：4～6周齡雄性裸小鼠。在手術(shù)顯微鏡下，裸鼠角膜建立一個(gè)1.5mm×0.8mm大小的微囊。將腫瘤組織切成0.3mm3小塊，然后接種于微囊中，建立裸鼠角膜微囊移植模型。2.試驗(yàn)分組：分處理組和比照組。3.角膜新生血管的視察與定量探討：手術(shù)后第3、5、7、9、12、15、18、21d，應(yīng)用體視顯微鏡，動(dòng)態(tài)視察角膜微囊內(nèi)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成狀況，顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)記錄視察結(jié)果。依據(jù)新生血管的數(shù)目及生長(zhǎng)速度確定新生血管的活性。依據(jù)Ziche法定量計(jì)算角膜新生血管的積分，即新生血管積分=血管密度×血管長(zhǎng)度。血管密度指數(shù)1相當(dāng)于0～25條血管/角膜、2相當(dāng)于25～50條血管/角膜、3相當(dāng)于50～75條血管/角膜、4相當(dāng)于75～100條血管/角膜、5相當(dāng)于>100條血管/角膜。將角鞏膜緣到角膜中心（瞳孔）的距離分成5等份，以圓周到圓心的距離為5，計(jì)算新生血管長(zhǎng)度。3.海綿植入試驗(yàn)1