臨床微生物學檢驗：實驗2

臨床微生物學檢驗

實驗第二周實驗內容第一天：生物化學鑒定葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氫、Indol、枸椽酸鹽、雙糖鐵

第二天：生物化學鑒定苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、DNA酶、硝酸鹽還原、氧化發(fā)酵（O/F）

第三天：生物化學鑒定氧化酶、觸酶、DNA酶試驗結果觀察目的要求1.掌握鑒別細菌常用生化反應的原理、結果判定及接種方法。2.熟悉鑒別細菌常用的復合生化培養(yǎng)基(KIA)的原理、結果判定和應用第一天實驗內容試劑（微量生化管）：葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氫、Indol、枸椽酸鹽、KIA

以上各種生化微量管2支/人菌種：大腸埃希菌、腸沙門菌、陰溝腸桿菌、福氏Ⅰa志賀菌等其他：砂輪、接種針、酒精燈常用指示劑變色范圍指示劑顏色改變感應pH范圍酸→堿溴甲酚紫黃→紫5.2～6.8溴麝香草酚藍黃→藍6.0～7.6甲基紅紅→黃4.4～6.0中性紅紅→黃6.8～8.0酚紅黃紅6.8～8.4碳水化合物代謝試驗1、糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗原理：細菌含發(fā)酵糖(苷、醇)類的酶不同，分解糖（苷、醇）能力不同，代謝產(chǎn)物不同，指示劑呈酸性或堿性反應。

指示劑為溴甲酚紫

結果：

產(chǎn)酸：分解糖(苷醇)產(chǎn)酸，培養(yǎng)基變黃色＋產(chǎn)酸產(chǎn)氣：培養(yǎng)基變黃且出現(xiàn)氣泡＋無變化：－原理：某些細菌在代謝過程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進一步被分解為乳酸、乙酸、甲酸等，而使培養(yǎng)基的pH值下降至4.5以下，故加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色（陽性）。有些細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉化為其它物質如醇、酮、醛、氣體和水，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色（陰性）原理：細菌在葡萄糖代謝過程中生成丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧后可產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化為二乙酰（丁二酮），進而與培養(yǎng)基內的蛋白胨的精氨酸所含的胍基發(fā)生反應，生成紅色化合物，即VP反應陽性。

2、甲基紅試驗（MR）及VP試驗

葡萄糖

丙酮酸乙酰甲基甲醇混合酸(甲、乙、乳酸、琥珀酸)

KOH+空氣甲基紅指示劑丁二烯醇二乙酰PH<4.4紅色

α奈酚+肌酸(MR+)

紅色化合物

(VP+)

培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水

VP試驗

MR試驗試劑：甲液：6%α-萘酚酒精溶液。乙液：40%KOH溶液、0.3%肌酐。結果判定：陽性:紅色

陰性:黃色/棕色

（再35℃0.5～1小時后觀察）甲基紅試劑：

結果判定：加入甲基紅試劑1滴,

陽性:紅色陰性:黃色-

+MR結果與VP結果相反3、硫化氫試驗原理：細菌分解含硫氨基酸(胱aa、半胱aa)生成H2S，遇醋酸鉛Pb或Fe2+形成黑色PbS或FeS沉淀培養(yǎng)基：硫化氫培養(yǎng)基結果判定：培養(yǎng)基變黑

+

-原理：細菌分解培養(yǎng)基中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與試劑中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色結果：反應結束加試劑數(shù)滴，兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性

-

+4、吲哚試驗原理：以枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸銨為唯一氮源，若細菌能利用這些鹽作為碳源和氮源而生長，則利用枸櫞酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽，與利用銨鹽產(chǎn)生的NH3反應，形成（NH4）2CO3，使培養(yǎng)基變堿，pH升高，指示劑溴麝香草酚藍由草綠色變?yōu)樯钏{色結果:

陽性:藍色;

陰性:綠色5、枸櫞酸鹽利用試驗

-

+培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基6.克氏雙糖鐵培養(yǎng)基(KliglerIronAgar,KIA)組成：無糖培養(yǎng)基+1份葡萄糖+10份乳糖+鐵鹽+酚紅

營養(yǎng)底物底物底物指示劑②分解葡萄糖+乳糖產(chǎn)酸(乳糖多，產(chǎn)酸多）上下層均變黃原理：①只分解葡萄糖產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）上層酸氧化，紅色下層缺氧，不氧化，黃色③產(chǎn)生硫化氫+鐵鹽FeS黑色沉淀

應用：檢測腸桿菌科細菌對乳糖、葡萄糖的分解和產(chǎn)H2S能力。未接種菌的KIA乳（－）葡（＋）H2S(-)乳（-）葡（+）H2S(+)乳（+）葡（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）H2S(-)克氏雙糖鐵試驗結果示意圖各種生化培養(yǎng)基接種的細菌葡萄糖：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌乳糖：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌硫化氫：大腸埃希菌或志賀菌、沙門菌VP試驗：大腸埃希菌、陰溝腸桿菌甲基紅MR試驗：大腸埃希菌、陰溝腸桿菌吲哚試驗：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌枸椽酸鹽：大腸埃希菌或志賀菌或沙門菌、陰溝腸桿菌KIA：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌每種生化試驗每人均做！每個生化反應微量管分別接種兩種不同的細菌！課后作業(yè)復習今天接種細菌的各種生化反應原理與結果預習第二天的各種生化反應原理及結果觀察第二天實驗內容試劑：苯丙、尿素、（賴氨酸、鳥氨酸、氨對）、DNA酶、硝還、O/F

以上各種生化微量管2支/人

O/F管4支/人菌種：大腸、變形、沙門、志賀、金葡、銅綠其他：砂輪、接種針、酒精燈觀察昨天的生化反應結果并記錄-

+MR和VP加試劑后觀察+無色紅色VP試驗甲基紅試驗+-紫紅色橘黃色加試劑后觀察乳（+）葡（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）H2S(-)大腸埃希菌在KIA中結果乳（-）葡（+）H2S(+)傷寒沙門菌在KIA中結果乳（－）葡（＋）H2S(-)志賀菌在KIA中生長結果KA-+KA-+KA--AA+-原理：若細菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，苯丙酮酸能使三氯化鐵指示劑變?yōu)榫G色加入苯丙氨酸脫氨酶試劑:10%FeCl3陽性:培養(yǎng)基與試劑接觸處出現(xiàn)綠色陰性:不變色培養(yǎng)基：苯丙氨酸培養(yǎng)基AB

+-1、苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：細菌具有的尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨(氨在溶液中形成碳酸銨)，培養(yǎng)基pH↑

培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基

指示劑：酚紅

結果：培養(yǎng)基呈堿性指示劑顯紅色+－

＋

AB2、尿素酶試驗原理：不同細菌對不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異，有氧條件下能分解稱為氧化型，無氧條件下能分解稱為發(fā)酵型,兩種情況下均不分解的為產(chǎn)堿型。結果判定:僅在沒有覆蓋石蠟油的一管分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者屬氧化型；兩管均分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為發(fā)酵型；兩管都不生長者為產(chǎn)堿型。指示劑：溴麝香草酚藍或溴甲酚紫培養(yǎng)基：Hugh-Leifson培養(yǎng)基3、氧化－發(fā)酵試驗（OF）氧化－發(fā)酵試驗（OF）發(fā)酵型ABC氧化型

產(chǎn)堿型4、氨基酸脫羧酶試驗脫羧酶分解氨基酸使脫羧生成胺、CO2，培養(yǎng)基變堿性。

-coo賴氨酸尸胺

-coo鳥氨酸腐胺培養(yǎng)基：賴、鳥氨基酸脫羧酶及氨基酸對照培養(yǎng)基結果：對照管黃色測定管紫色+

接種細菌后，在培養(yǎng)基中加入石蠟油！原理：細菌如果能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與試劑中的對氨基苯磺酸生成對偶氮苯磺酸，對偶氮苯磺酸再與試劑中的α-萘胺反應，生成可見的紅色N-α-萘胺偶氮苯磺酸。硝酸鹽還原的過程可因細菌的不同而異，①有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；②有的細菌使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽后，進一步將亞硝酸鹽分解成為氮，此時加入硝酸鹽還原試劑不顯色，但可以在培養(yǎng)基的小倒管中出現(xiàn)氣泡，如假單胞菌等。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果被還原成氣體的終未產(chǎn)物如氮或氧化氮，就稱為脫硝化或脫氮化作用。

5、硝酸鹽還原試驗甲液：甲基α-萘胺乙液：對氨基苯磺酸培養(yǎng)后加試劑：甲液、乙液各一滴陽性:紅色陰性:無色在無色的培養(yǎng)基中再加入鋅粉，判定結果硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗ABAB-/+

+加鋅粉+-加試劑后

DNA酶

原理：長鏈DNA寡核苷酸鏈

（可被酸沉淀）（可溶于酸）

方法：點種

-+6、DNA酶試驗實驗內容：各種培養(yǎng)基接種細菌苯丙：大腸埃希菌、變形桿菌尿素：大腸埃希菌、變形桿菌賴氨酸：傷寒沙門菌、奇異變形桿菌鳥氨酸：傷寒沙門菌、奇異變形桿菌對照管：分別接種傷寒沙門菌或奇異變形桿菌DNA酶：金葡菌、大腸埃希菌或銅綠假單胞菌硝還：大腸埃希菌或變形桿菌、銅綠假單胞菌O/F：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌每種生化反應每個同學均做并分別接種兩種細菌??！第三天實驗內容試劑：氧化酶、觸酶、1%鹽酸菌種：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌其他：砂輪、接種針、酒精燈觀察昨天的生化反應結果OF試驗發(fā)酵型氧化型＋－加入試劑后觀察苯丙氨酸脫胺酶試驗尿素酶試驗－＋硝酸鹽還原試驗

－＋在無色的培養(yǎng)基中再加入鋅粉紅色（－）不產(chǎn)氮氣無色（＋）產(chǎn)氮氣氨基酸脫羧酶＋－＋－顏色與對照管一致的為陰性，顏色不同的則為陽性

－＋DNA酶試驗結果加1%鹽酸1、氧化酶試驗

原理：

鹽酸二甲基對苯二胺（無色）紫紅色的醌類化合物

OR

鹽酸四甲基對苯二胺（無色）藍色的醌類化合物

方法：直接法、間接法（濾紙法、試劑紙片法）

結果：在10秒內呈紫紅色－－陽性

注意事項：不宜用生銹的接種針或接種環(huán)

不宜用熱的鑷子