基因工程 考試 重點(diǎn) 噬菌體載體

第二章DNA重組克隆的單元操作練習(xí)題噬菌體載體(練習(xí)題)一、填空題噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是；二是。第一個(gè)報(bào)道的全測(cè)序的單鏈DNA噬菌體是？X174,DNA長(zhǎng)5386個(gè)堿基對(duì)，共個(gè)基因，為一環(huán)狀DNA分子，基因組的最大特點(diǎn)是。A噬菌體的基因組DNA為kb，有多個(gè)基因。在體內(nèi)，它有兩種復(fù)制方式，擴(kuò)增時(shí)(早期復(fù)制)按—復(fù)制，成熟包裝(晚期復(fù)制)則是按復(fù)制。它有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，進(jìn)行向復(fù)制。A噬菌體的DNA既可以以線性存在又可以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。其原因主要是松噬菌體線性DNA分子的兩端各有一個(gè)—個(gè)堿基組成的天然黏性末端。這種黏性末端可以自然成環(huán)。成環(huán)后的黏性末端部位就叫—位點(diǎn)。根據(jù)噬菌體的包裝能力，將野生型入噬菌體的基因組DNA改造成插入型載體，該載體的最小分子大小約為kb,插入的外源片段最大不超過(guò)kb。野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因和。黏粒(cosmid)是質(zhì)粒一噬菌體雜合載體，它的復(fù)制子來(lái)自、COS位點(diǎn)序列來(lái)自—，最大的克隆片段達(dá)到kb。有兩類改造型的A噬菌體載體，即插入型和取代型。從酶切點(diǎn)看，插入型為個(gè)，取代型為個(gè)。野生型的丸噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：(1)(2)(3)。M13單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制分為三個(gè)階段：(1)(2)(3)。噬菌粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA共同構(gòu)成的，其中來(lái)自質(zhì)粒的主要結(jié)構(gòu)是，而來(lái)自噬菌體的主要結(jié)構(gòu)是。11.M13單鏈?zhǔn)删w基因2和基因4之間的IG區(qū)有三個(gè)最重要的功能，即(1)⑵(3)。野生型的M13有10個(gè)基因，分為三個(gè)功能集團(tuán)，其中與復(fù)制有關(guān)的兩個(gè)基因是：—和。以A噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，起始DNA的長(zhǎng)度是不同的，前者為kb，后者為kb。A噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長(zhǎng)度應(yīng)在噬菌體基因組的的范圍內(nèi)。二、判斷題取代型載體(replacementvector)是指同一種限制性內(nèi)切核酸酶在),DNA中具有兩個(gè)切點(diǎn)，外源DNA通過(guò)取代這兩個(gè)切點(diǎn)間的片段被克隆?，F(xiàn)在最常用的pUC載體是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位點(diǎn)和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制。另外，這種載體可在輔助質(zhì)粒的幫助下合成單鏈DNA。噬菌粒(phagemid)pUCll8/pUCll9載體是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體有利特征于一身的載體，既能合成單鏈DNA，又能合成雙鏈DNA。入噬菌體DNA和M13單鏈?zhǔn)删wDNA在成熟前的DNA復(fù)制都是用滾環(huán)模型。M13噬菌體每個(gè)世代裂解宿主后，可釋放100個(gè)子代噬菌體。以黏粒為載體的重組體雖然在平板上生長(zhǎng)的速度不同，但是轉(zhuǎn)化子中插入片段的擴(kuò)增量是相同的。三、選擇題(單選或多選)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI在野生型的丸噬菌體DNA中有5個(gè)切點(diǎn)、HindO有7個(gè)切點(diǎn)，BamHI也有5個(gè)切點(diǎn)。調(diào)整這些酶切位點(diǎn)的數(shù)量，主要通過(guò)()(a)體內(nèi)突變(b)完全酶切后連接(c)部分酶切(d)先用甲基化酶修飾后再酶切PBluescriptMl3載體在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)引入了丁7和T3兩個(gè)噬菌體的啟動(dòng)子，這樣增加了該載體的功能，如：可以對(duì)插入到多克隆位點(diǎn)的外源片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析利用這兩個(gè)啟動(dòng)子的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增利用通用引物進(jìn)行序列分析利用這兩個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行定點(diǎn)突變上述四種功能中哪一種是不正確的?()下面關(guān)于細(xì)菌人工染色體(BAC)的特征描述，除了(。)外都是正確的。通過(guò)電激法將大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌比酵母的轉(zhuǎn)化率提高了10—100倍BAC載體在細(xì)菌中以環(huán)形超螺旋狀態(tài)存在，使分離操作起來(lái)相對(duì)容易BAC載體在大腸桿菌宿主保持高拷貝克隆到BAC載體上的外源片段可以直接進(jìn)行測(cè)序以獲得末端序列以黏粒為載體轉(zhuǎn)染受體菌后，平板上生長(zhǎng)的菌落會(huì)大小不一、生長(zhǎng)速度不一的現(xiàn)象，其原因是()營(yíng)養(yǎng)成分不足重組后的質(zhì)粒復(fù)制不穩(wěn)定重組后的黏粒整合到宿主染色體上重組體中插入片段的大小不同M13K07是一種輔助噬菌體DNA,可用它幫助噬菌粒制備單鏈DNA，這是因?yàn)?)M13K07能夠進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，得到大量的單鏈?zhǔn)删wDNAM13K07能夠提供成熟包裝的蛋白M13K07提供了成熟包裝所需的信號(hào)M13K07的10個(gè)基因都是正常的黏粒(cosmid)是一種人工建造的載體，()它具有COS位點(diǎn)，因而可進(jìn)行體外包裝它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起裂解反應(yīng)進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶源化反應(yīng)Mu噬菌體也是一種轉(zhuǎn)座元件，這種轉(zhuǎn)座元件()可引起寄主的突變可用于細(xì)胞內(nèi)的基因工程具有轉(zhuǎn)座酶基因以上說(shuō)法都正確關(guān)于M13的IGIX,下列說(shuō)法中哪一項(xiàng)不妥當(dāng)?()具有正負(fù)鏈的復(fù)制起點(diǎn)具有噬菌體DNA被包裝的信號(hào)具有150個(gè)堿基的AT富集區(qū)具有八個(gè)回文序列，可形成五個(gè)發(fā)夾環(huán)9.M13噬菌體基因組編碼10個(gè)基因，在它的成熟過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白是()(a)gp2蛋白(b)gp5蛋白(c)gp7蛋白(d)gp9蛋白四、簡(jiǎn)答題在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，通常需要把受體菌和在供體中生長(zhǎng)的噬菌體懸浮液分別鋪在選擇性培養(yǎng)基上，為什么？如何將野生型的九噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體？用SalI切割從噬菌體J2分離的DNA時(shí)，得到8個(gè)片段，分別是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。但是，用SaII切割從被感染的寄主細(xì)胞中分離到的J2噬菌體DNA時(shí)，只得到7個(gè)片段，分別是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb，根據(jù)這些結(jié)果，您得到哪些信息？在cI基因正常時(shí)為什么也會(huì)出現(xiàn)渾濁的噬菌斑?不正常則是清亮的噬菌斑？入噬菌體DNA被包裝到噬菌體的頭部，需要哪些基本條件?為什么？五、問(wèn)答題為什么野生型的A噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？什么是藍(lán)白斑篩選法？藍(lán)白斑篩選法為什么也會(huì)有假陽(yáng)性？什么是cI篩選法？K噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？什么是M13的IG序列區(qū)?有何特點(diǎn)和功能？將野生型的M13改造成基因工程載體，首先是進(jìn)行酶切位點(diǎn)的改造，請(qǐng)問(wèn)M13中的EcoRI最初是如何引入的？以置換秋噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說(shuō)能夠形成噬菌斑的就一定是重組體？M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足？輔助噬菌體DNA和相應(yīng)的噬菌粒是如何協(xié)同工作的？噬菌體載體(參考答案)一、填空題它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增；對(duì)某些噬菌體(如入噬菌體)的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究得比較清楚，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡10；基因的重疊48.5；60；凱恩斯模型；滾環(huán)；雙；12；COS36；14沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；選擇標(biāo)記質(zhì)粒；丸噬菌體；451；2(1)分子量大，(2)酶的多切點(diǎn)，(3)無(wú)選擇標(biāo)記(1)SS---?RF；(2)RF---?RF；(3)RF-*SS復(fù)制區(qū)；IG區(qū)(1)正鏈復(fù)制起點(diǎn)；(2)負(fù)鏈復(fù)制起點(diǎn)；(3)包裝信號(hào)基因II；基因V100kb；200kb75%—105%二、判斷題

錯(cuò)誤。不一定是同一種酶，如果兩種不同的限制性內(nèi)切核酸酶在載體上各只有一個(gè)切點(diǎn)，兩切點(diǎn)間的片段被取代后又不影響噬菌體的生活力，也是取代型載體。錯(cuò)誤。pUCl8沒(méi)有IG區(qū)，不可能形成單鏈。錯(cuò)誤。如果沒(méi)有助手噬菌體的存在，則不能形成單鏈DNA。正確。錯(cuò)誤。M13噬菌體不會(huì)使宿主裂解，導(dǎo)致噬菌體從細(xì)胞釋放出來(lái)。錯(cuò)誤。由于重組體在乎板上生長(zhǎng)的速度不同，轉(zhuǎn)化子中插入片段的擴(kuò)增量就不相同，三、選擇題(單選或多選)4.d；5.d；8.d；9.b第一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)和估計(jì)自發(fā)突變?yōu)橐吧偷念l率；第二1.a；2.d；3.c；6.a，b，c；7.d；四、簡(jiǎn)答題TOC\o4.d；5.d；8.d；9.b第一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)和估計(jì)自發(fā)突變?yōu)橐吧偷念l率；第二這些平板起對(duì)照作用。個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)確證噬菌體懸液中無(wú)菌情況(即不能有任何活的供體細(xì)菌)。答：削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))；(2)削減酶切位點(diǎn)；(3)添加選擇標(biāo)記；(4)引入終止突變答：(1)J2噬菌體是一種雙鏈線性的DNA分子；(2)基因組全長(zhǎng)是47.5kb；(3)進(jìn)入宿主后成環(huán)狀；(4)5.3和3.6kb的片段分別位于線性DNA的兩端。答：正常時(shí)，既有裂解途徑也有溶源化途徑。不正常則全部進(jìn)入裂解途徑。答：(1)兩個(gè)COS位點(diǎn)；(2)線性DNA；(3)大小在丸噬菌體基因組的75%—105%的范圍之內(nèi)。五、問(wèn)答題答：噬菌體DNA沒(méi)有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105%，所以要將入噬菌體改造成載體，必須削減分子量。野生型的入DNA對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克隆。沒(méi)有可供選擇的標(biāo)記。野生型的入噬菌體具有感染性，因此不夠安全。答：這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來(lái)篩選重組體。主要是似載體的非必要區(qū)插入一個(gè)帶有大腸桿菌8一半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的入載體轉(zhuǎn)Alac-的宿主菌后，在含有5—漠一4—氯一3—引哚一p—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插入旗。(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解X-gal的能力，轉(zhuǎn)人lac—的宿主菌后，在含有5—漠一4—氯一3—引哚一p—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。答：P—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以進(jìn)行修飾，并不影響酶的活性或。肽的互補(bǔ)性。如果插入的外源DNA引起。肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會(huì)形成白色噬菌斑。如果插"NA的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止密碼的話，仍然會(huì)形成藍(lán)色噬菌斑。這種插人物的長(zhǎng)度可達(dá)幾百個(gè)堿基對(duì)。M13載體的這種性質(zhì)可以用來(lái)檢測(cè)和選擇產(chǎn)生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。答：CI基因的功能是促使噬菌體進(jìn)入溶源化，但在正常情況下，它的噬菌斑是不清楚的，有點(diǎn)渾濁。這是因?yàn)樵谌胧删w感染時(shí)，有少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入溶源化途徑，這些細(xì)胞生長(zhǎng)在噬菌斑中，就造成了噬菌斑渾濁。由于。1基因的產(chǎn)物一一阻遏物的失活，不會(huì)有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很容易將重組體與非重組體區(qū)別開(kāi)來(lái)。cI阻遏物的名字就是指在該基因中插入一段DNA后會(huì)使噬菌斑的形態(tài)變得清亮(c=clear)0答：優(yōu)點(diǎn)：入基因組中有1/3的非必需區(qū)，可以被置換，改造成載體后，克隆的片段較大(可達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個(gè)kb；用噬菌體DNA作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；入可通過(guò)溶源化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓它以溶源性存在，若要表達(dá)，可通過(guò)誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA的拷貝數(shù)就會(huì)很多。不足：需要包裝比較麻煩，包裝率又不穩(wěn)定，購(gòu)買包裝蛋白的費(fèi)用又高；沒(méi)有質(zhì)粒的用途廣泛。答：在M13基因組中的基因2與基因4之間有一個(gè)長(zhǎng)度為507個(gè)核苷酸的基因區(qū)間，簡(jiǎn)稱IG(intergenicregion)，占基因組的8%。該區(qū)具有以下特點(diǎn)：具有正、負(fù)鏈的復(fù)制起點(diǎn)；具有噬菌體DNA被包裝到噬菌體顆粒的包裝信號(hào)；具有150個(gè)堿基的AT富集區(qū)；有5個(gè)回文序列，能夠形成5個(gè)發(fā)夾環(huán)，回文序列A是包裝信號(hào)。IG區(qū)在M13噬菌體的生命周期中的4個(gè)過(guò)程中起重要作用：噬菌體DNA成熟包裝到噬菌體顆粒中的包裝識(shí)別位點(diǎn)；RNA引物合成的位點(diǎn)，合成的引物用于(一)鏈的合成；⑶(+)鏈合成的起始位點(diǎn)，全長(zhǎng)140bp,分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域A長(zhǎng)為40bp,是復(fù)制起始的基本位點(diǎn)，它被gp2識(shí)別，產(chǎn)生一個(gè)切口開(kāi)始復(fù)制，并作為復(fù)制的終止點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域B長(zhǎng)為100bp，起增強(qiáng)子作用，幫助gp2在結(jié)構(gòu)域A起作用。⑷(+)鏈合成的終止位點(diǎn)。答：用識(shí)別4個(gè)堿基的限制酶Haelll切割M13雙鏈DNA，發(fā)現(xiàn)Haelll在M13上有10個(gè)切點(diǎn)。為了將M13構(gòu)建成克隆載體，首先用Haein將RFl進(jìn)行部分消化，使之產(chǎn)生單一切點(diǎn)的全長(zhǎng)的線性M13DNA。Haeffl在M13上有10個(gè)切點(diǎn)，因此產(chǎn)生的線性DNA的末端可能是這10個(gè)切點(diǎn)的任何一個(gè)部位產(chǎn)生的。將外源DNA同線性的M13DNA連接起來(lái)，只有在非必需區(qū)插入并連接起來(lái)的重組體能夠進(jìn)行復(fù)制，從必需區(qū)插入的重組DNA不能復(fù)制，因此將會(huì)被丟失。根據(jù)上述的原理，用Haeffl部分酶切野生型的RFMl3DNA,然后同lac插人片段連接，感染后篩選重組體M13mpl,該重組體中的插入片段是從IG區(qū)的5868位的HaeIII位點(diǎn)插入的。通過(guò)對(duì)lac插入片段的序列分析發(fā)現(xiàn)，只要將8半乳糖苷酶基因內(nèi)的密碼子5的堿基G換成A即可產(chǎn)生一個(gè)EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)(GAATTC)。因?yàn)橹繥中的06甲基化將會(huì)導(dǎo)致G同U的配對(duì)，將單鏈的M13mpl的(+)鏈用甲基化試劑N一甲基一N一亞硝酸脲進(jìn)行處理，用突變的DNA去轉(zhuǎn)染細(xì)菌，分離RF型DNA，由于分離的RFDNA并非都具有EcoRI位點(diǎn)的突變體，所以用EcoRI切割后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢查，根據(jù)線性DNA與環(huán)狀DNA的電泳遷移率的不同，將線性化的DNA分離出來(lái)，重新連接成環(huán)，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分離到三個(gè)克隆，每個(gè)克隆都有一個(gè)EcoRI的位點(diǎn)，但所在位置有所不同，將它們分別命名為：M13mp2、M13mp3、M13mp4。答：改造的置換型噬菌體載體，重組人外源片段之后，總體積不能超過(guò)\基因組的105%，不能少于入基因組的75%。以置換型入噬菌體DNA作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA重組。如果沒(méi)有外源片段，僅是兩臂連接，長(zhǎng)度短于入基因組的75%，不能被包入噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長(zhǎng)度超過(guò)丸基因組105%后，也不能包入噬菌體顆粒，自然不能形成噬菌斑。答M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大，有報(bào)道，有些噬菌體顆粒可以包裝比野生型絲狀噬菌^DNA長(zhǎng)6?7倍的DNA(插入片段可達(dá)40kb)。可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對(duì)于DNA測(cè)序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。⑶單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13克隆系列的不足：較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過(guò)程中往往不夠穩(wěn)定，一般說(shuō)，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機(jī)率越大。單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混