常用分子生物學技術的原理及其應用

第一節(jié)分子雜交與印跡技術MolecularHybridizationandBlottingTechniqueDNA的變性和復性

目錄復性RNADNA探針標記技術

探針(probe)???已知序列的多聚核苷酸片段可被標記:同位素、生物素或熒光染料可被檢測

一、基本概念核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)：不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件可以在不同的分子間形成雜化雙鏈。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。探針(Probe)：是帶有特殊可檢測標記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段互補結合，因此可以用以檢測核酸樣品中存在的特定基因。印跡技術(BlottingTechnique)：

將生物大分子物質，核酸或蛋白質進行凝膠電泳分離成若干條帶后，轉移（印跡）到固化介質（常用NC膜、尼龍膜）上，再與探針進行雜交的反應。印跡技術二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡

(SouthernBlot)（二）RNA印跡(NorthernBlot)（三）蛋白質的印跡

(WesternBlot)用于基因組特異基因的定位及檢測，重組質粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性分析.比較不同組織和細胞中同一基因的表達情況。用于蛋白質定性,半定量及蛋白質相互作用研究。其他：斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA芯片技術(DNAchip)（一）DNA印跡(SouthernBlot)1、概念：將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA片段轉移到合適的固相支持物上，再通過特異性探針的雜交檢測被轉移的DNA片段的一種方法。這是由E.Southern于1975年首先設計應用的，因而以其姓氏命名。核酸電泳瓊脂糖凝膠電泳

分子雜交實驗①②③2、基本過程：（1）酶切：用限制性內切酶消化DNA樣品（2）電泳：通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段按小分離（3）變性：將含有DNA區(qū)帶的凝膠在變性溶液中變性（4）轉移：使膠中的DNA分子轉移到固相支持物（NC膜或尼龍膜）上（5）固定：在80℃真空條件下加熱或在紫外交聯(lián)儀內處理使DNA固定于膜上（6）雜交3、應用：用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡(NorthernBlot)：1、利用與DNA印跡相類似的技術分析RNA就稱為RNAblot。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northernblot。2、基本過程：

與SouthernBlot相似，但有以下不同：RNA分子較小，在轉移前無需進行限制性內切酶切割變性RNA的轉移效率比較高3、應用：（1）檢測某一組織或細胞中已知的特異

mRNA的表達水平（2）比較不同組織和細胞中的同一基因的表達情況（三）蛋白質印跡(WesternBlot)

1、概念：蛋白質在電泳之后可以被從膠中轉移和固定到模型材料上，再與溶液中相應的蛋白分子相互結合，其中最常用的是用抗體檢測，因此被稱為免疫印跡。相對于DNA的SouthernBlot和RNA的NorthernBlot，蛋白質印跡被稱為WesternBlot。2、基本過程：(1)電泳（Electrophoresis）：一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。

蛋白質：SDS凝膠

蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體。目前進行的Western印跡反應大多還是從凝膠上直接把蛋白質電轉移至硝酸纖維素濾膜之上。蛋白質的轉移只有靠電轉移方可實現(xiàn)。

(2)轉膜(Transfer)：印跡技術(3)封閉(Blocking)：

封閉可能結合非相關蛋白的位點以降低這類非特異性結合背景的效果。

(4)一抗孵育(Primaryantibodyincubation)：

特異性抗體（一抗）和轉移膜上相應的蛋白分子結合.(5)二抗孵育

(Secondaryantibodyincubation)：

堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶(HRP)或放射性核素標記的二抗與之反應。二抗需根據(jù)一抗進行選擇。(6)顯色：

用放射自顯影或底物顯色檢測蛋白質區(qū)帶的信號，底物亦可與化學發(fā)光劑結合以提高敏感度.蛋白質印跡雜交實驗——Westernblotting放射自顯影照片3、應用：（1）檢測樣品中特異蛋白質的存在（2）細胞中特異蛋白質的半定量分析（3）蛋白質分子的相互作用研究三種印跡技術的比較第二節(jié)

PCR技術的原理與應用PCR技術的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,擴增DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。KaryB.Mullis（1944－）“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize

一、概念：PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶鏈反應:

在體外對目的DNA進行大量擴增的技術，當目的DNA加熱變性時，使其成為單鏈，與一對特異性引物在退火時進行雜交，在耐熱的DNA聚合酶作用下進行反應，并循環(huán)進行幾十次，使目的DNA得到大量的擴增。(其基本理論建立在DNA變性、復性及分子雜交的基礎之上。)PCR特點1.高度敏感性2.高度特異性3.高產(chǎn)率4.可重復、操作簡單

二、PCR的基本原理1、PCR反應體系模板DNA

特異引物底物dNTP

耐熱性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）

Mg2+緩沖液threesteps:HowPCRworksDenaturation

(變性):90～97℃Annealing

(退火):45～55℃Extension

(延伸):

around

72℃2、基本反應步驟：變性（denature）：將反應體系加熱至90-97℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:Denaturation

變性94℃

退火（annealing）：當溫度突然降低至45-65℃,引物與其互補的單鏈DNA模板在局部形成雜交鏈。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:Annealing

退火T

℃

primer-dependent

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAG延伸(extension):將溫度升高至70-74℃下，在TaqDNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下引物沿著模板DNA延伸。TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:Extension

延伸72℃CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATCGCGATATTACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA

以上三個步驟構成一個循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)（25～30）次即可達到擴增DNA片段的目的。聚合酶鏈式反應1.Denaturation2.

Annealing3.

ExtensionPCR.EXE5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。二、PCR技術的主要用途

（一）目的基因的克隆可以利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段（二）基因的體外突變

利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。（三）DNA和RNA的微量分析

PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

（四）DNA序列測定將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。（五）基因突變分析

PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。三、幾種重要的PCR衍生技術（一）逆轉錄PCR技術反轉錄PCR（reversetranscriptionRT-PCR）：以RNA為起始模板產(chǎn)生cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增。逆轉錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。

cDNAcomplementaryDNA再以cDNA為模板進行PCR擴增RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。

（二）原位PCR技術

原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。（三）實時