多克隆抗體的制備（免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)課件）

多克隆抗體的制備免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)培訓(xùn)課件—*—多克隆抗體的制備抗血清/免疫血清/PcAb概念天然抗原常含有多種抗原決定簇，可刺激動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆針對(duì)該抗原的多種抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，稱為多克隆抗體（PcAb）。將抗原以不同途徑免疫動(dòng)物，可從動(dòng)物血清中分離得到抗體，因而把這類含有抗體的血清稱為抗血清或免疫血清?！?—情景設(shè)計(jì)多克隆抗體的制備假設(shè)現(xiàn)在需要提取雞肝細(xì)胞里面的A蛋白（500KD），配成一定濃度作為抗原，從給定的三種動(dòng)物（鴨、兔、山羊）中選擇合適的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室里免疫，一段時(shí)間后采血，分離血清，若得到抗體，從中提取出Ab1，并鑒定其效價(jià)和純度，最后選一個(gè)最好的方法保存起來(lái)。步驟：制備可溶性抗原（雞A蛋白）→免疫動(dòng)物→采血→提取、純化、鑒定Ab1→保存Ab1—*—提問(wèn)多克隆抗體的制備現(xiàn)準(zhǔn)備了三種動(dòng)物，分別是鴨、兔和山羊，在4樓實(shí)驗(yàn)室里用于免疫從雞肝細(xì)胞內(nèi)提取的A蛋白，主要用于驗(yàn)證抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生抗體的特性，選哪一種動(dòng)物好呢？—*—提問(wèn)多克隆抗體的制備1）如果這里分別有小兔子、大兔子、老兔子，選哪一種好呢？2）這里有活潑可愛、毛色發(fā)亮的健康大兔子，也有流鼻涕又拉稀的大兔子，選哪一種好呢？3）健康的雄兔子和健康的雌兔子，最好選哪一種？答案：大兔子；活潑可愛、毛色發(fā)亮；健康的雄兔子。—*—多克隆抗體的制備免疫動(dòng)物選擇（1）種類：家兔、豚鼠、綿羊、馬、雞、山羊等；（2）Ag與免疫動(dòng)物種系差異越大，效果越好；（3）動(dòng)物個(gè)體適齡（體重符合要求）、健壯、無(wú)感染性疾病（宜雄性）；（4）選用多只條件相同的動(dòng)物同時(shí)進(jìn)行免疫；—*—多克隆抗體的制備免疫動(dòng)物選擇（5）抗原的性質(zhì)：適宜（蛋白質(zhì)→家兔、山羊/類固醇激素→家兔/酶類→豚鼠）；不適宜（IgE→綿羊/多種酶→山羊/胰島素→家兔）；（6）抗血清的要求：R型（兔型）→等價(jià)帶寬→診斷試劑/H型（馬型）→等價(jià)帶窄→治療試劑；抗體數(shù)量需求多→大動(dòng)物—*—多克隆抗體的制備按設(shè)計(jì)的方案免疫（1）免疫量：在一定范圍內(nèi)，越大越好；（2）免疫途徑：皮內(nèi)（初次免疫）、皮下、肌肉、靜脈（加強(qiáng)免疫）、腹腔、淋巴結(jié)（抗原量少、珍貴）、腳掌等；（3）免疫時(shí)間間隔：第1次與第2次→10-20d；第2次之后→7-10d。—*—多克隆抗體的制備動(dòng)物采血（1）時(shí)間：動(dòng)物免疫3～5次后，可取少量血清檢測(cè)抗體效價(jià)與特異性，測(cè)試合格后，應(yīng)在末次免疫后5～7d及時(shí)采血分離血清，采血前動(dòng)物禁食24h?！?—多克隆抗體的制備動(dòng)物采血（2）方法：1）心臟采血法：小動(dòng)物；2）頸動(dòng)脈放血法：最常用的方法；3）靜脈采血法：可多次采；4）其他方法：摘除眼球、斷尾。—*—多克隆抗體的制備抗血清分離/純化（1）抗血清分離：血液自然凝固，分離血清。（2）抗血清純化：1）IgG類抗體的純化：鹽析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、親和層析。2）特異性抗體的純化：親和層析法、吸附劑方法?！?—設(shè)計(jì)情景提問(wèn)多克隆抗體的制備如免疫抗原有5種（4種雜質(zhì)Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后產(chǎn)生5種抗體：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，現(xiàn)需分離出Ab1，怎樣分離？方法1：親和層析法動(dòng)畫：親和層析法純化特異性抗體—*—設(shè)計(jì)情景提問(wèn)多克隆抗體的制備如免疫抗原有5種（4種雜質(zhì)Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后產(chǎn)生5種抗體：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，現(xiàn)需分離出Ab1，怎樣分離？方法2：吸附劑方法動(dòng)畫：吸附法純化特異性抗體—*—多克隆抗體的制備抗血清鑒定（1）效價(jià)：放射免疫法/凝集反應(yīng)/雙擴(kuò)（舉例）等。（2）特異性：雙擴(kuò)等。（3）純度：電泳等。（4）親和力：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。—*—提問(wèn)多克隆抗體的制備根據(jù)下圖回答：此抗原為顆粒性抗原還是可溶性抗原？抗體的效價(jià)是多少？答案：可溶性抗原；效價(jià)為1：8—*—提問(wèn)多克隆抗體的制備根據(jù)下面的雙擴(kuò)圖結(jié)果判斷：抗體是否純化成功？答案：純化不成功—*—提問(wèn)多克隆抗體的制備現(xiàn)得到PcAb100mL，需要將其保存起來(lái)，每次使用5mL，請(qǐng)問(wèn)是100mL一起保存還是分裝為5mL小袋保存？為什么？保存方法有幾種？答案：小袋分裝；反復(fù)凍融影響抗