乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)

乙型肝炎病毒標(biāo)志物檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第1頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和要求1、熟悉ELISA（

enzyme-linkedimmunosorbentassay

）原理及操作方法2、掌握乙型病毒標(biāo)志物臨床意義乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第2頁(yè)①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不一樣步驟與固相載體表面抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，最終結(jié)合在固相載體上酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量成一定百分比。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，故可依據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析。（一）基本原理乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第3頁(yè)（一）基本原理③用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，最終結(jié)合在固相載體上酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量成一定百分比。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，故可依據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第4頁(yè)（二）試驗(yàn)試劑ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要試劑：①固相抗原或抗體，②酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體，③酶作用底物。依據(jù)試劑起源和標(biāo)本性狀以及檢測(cè)具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不一樣類型檢測(cè)方法。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第5頁(yè)1、雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最慣用方法，操作步驟以下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中抗原與固相載體上抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其它未結(jié)合物質(zhì)。

（三）試驗(yàn)方法乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第6頁(yè)（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量正相關(guān)。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中酶催化底物成為有色產(chǎn)物。依據(jù)顏色反應(yīng)程度進(jìn)行該抗原定性或定量。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第7頁(yè)1、把抗體固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去未結(jié)合雜蛋白；3、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一個(gè)供檢測(cè)用酶（辣根過(guò)氧化物酶）4、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測(cè)定。雙抗體夾心法——測(cè)抗原乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第8頁(yè)2、間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最慣用方法，其原理為利用酶標(biāo)識(shí)抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟以下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋受檢血清：其中特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其它免疫球蛋白及血清中雜質(zhì)因?yàn)椴荒芘c固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。

乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第9頁(yè)（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)識(shí)上酶。洗滌后，固相載體上酶量就代表特異性抗體量。比如欲測(cè)人對(duì)某種疾病抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體量。本法只要更換不一樣固相抗原，能夠用一個(gè)酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原對(duì)應(yīng)抗體。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第10頁(yè)間接法——測(cè)抗體乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第11頁(yè)步驟一

將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第12頁(yè)步驟二原理：將待測(cè)血清加入，溫育，血清中如有HBsAb，則抗原抗體結(jié)合操作：陽(yáng)性血清，陰性血清，待檢血清各加1孔，每孔50ul(1滴)乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第13頁(yè)步驟三原理：加入酶復(fù)合物，(HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合操作：加酶復(fù)合物1滴,混勻,置37℃溫育30分鐘倒出液體,洗滌5次，拍干。

乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第14頁(yè)步驟四加入酶底物，酶與底物反應(yīng)，顯色操作：每孔加顯色液A液,B液，各1滴，37℃溫育15分鐘，使充分顯色。

乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第15頁(yè)終止反應(yīng)：每孔加終止液50μl（一滴）肉眼觀察或上機(jī)比色步驟五乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第16頁(yè)1、乙肝病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)（四）應(yīng)用

——乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第17頁(yè)大球形顆粒（Dane顆粒，有感染性完整顆粒）HBsAg（外衣殼蛋白）HBcAg（內(nèi)衣殼蛋白）HBVDNADNAP乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第18頁(yè)小球形顆粒過(guò)剩衣殼（HBsAg）管形顆粒乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第19頁(yè)2、HBV抗原組成表面抗原HBsAg：外衣殼關(guān)鍵抗原HBcAg：內(nèi)衣殼，僅感染肝細(xì)胞核內(nèi)e抗原HBeAg：自肝細(xì)胞分泌而存在于血清中乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第20頁(yè)（1）表面抗原（HBsAg）與表面抗體（抗-HBs）存在于三型顆粒中是HBV感染主要標(biāo)志，見于急性、慢性、攜帶者抗-HBs，保護(hù)性抗體（中和抗體），標(biāo)志著機(jī)體對(duì)HBV有免疫力，見于恢復(fù)期、既往感染者或接種疫苗后3、HBV抗原抗體系統(tǒng)乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第21頁(yè)（2）關(guān)鍵抗原（HBcAg）與關(guān)鍵抗體（抗HBc）內(nèi)衣殼，僅存在于感染肝細(xì)胞核內(nèi)，不易在血液中檢出抗原性強(qiáng)，刺激機(jī)體先產(chǎn)生IgM，后產(chǎn)生IgG，后者可在血清中存在多年抗HBc無(wú)中和作用，高效價(jià)抗HBc–IgM提醒病毒在體內(nèi)復(fù)制增殖。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第22頁(yè)（3）e抗原（HBeAg）與e抗體（抗-HBe）可溶性蛋白，游離存在于血液中它消長(zhǎng)與DNA聚合酶及Dane顆粒出現(xiàn)時(shí)間一致，為病毒復(fù)制和血清有強(qiáng)傳染性標(biāo)志?？?HBe有一定保護(hù)作用，是傳染性低、預(yù)后好征象。乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第23頁(yè)HBsAg:感染主要標(biāo)志抗-HBs：對(duì)HBV有免疫力HBcAg：

普通血清學(xué)方法檢測(cè)不到抗HBc：提醒病毒在體內(nèi)復(fù)制增殖。HBeAg：病毒復(fù)制和血清有傳染性標(biāo)志抗-HBe：傳染性低、預(yù)后好征象。HBVDNA：病毒復(fù)制和有傳染性最直接證據(jù)乙肝五項(xiàng)臨床意義

乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)第24頁(yè)結(jié)果分析HBsAgHBeAg抗-HBs抗-HBe抗-HBc結(jié)果分析+----肝功效正常為無(wú)癥狀攜帶者肝功效異常為乙肝患者++---同