酶的分類與命名70課件

第三章酶第三章酶第一節(jié)酶的分類與命名第二節(jié)酶催化作用的特性第三節(jié)酶催化作用的機(jī)制第四節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第五節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第六節(jié)酶活力及其測(cè)定第七節(jié)酶工程酶是生物催化劑酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有催化功能的生物分子，所以又稱為生物催化劑(biocatalysts）

絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)。酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)（Enzymaticreaction）。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物（substrate）。第一節(jié)酶的分類與命名一酶的分類（一）根據(jù)酶的化學(xué)組成可將酶分為：1單純蛋白酶類：只含有蛋白質(zhì)成分2結(jié)合蛋白酶類（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（輔助因子）

全酶=酶蛋白+輔助因子輔助因子與酶蛋白結(jié)合比較疏松的小分子有機(jī)物與酶蛋白結(jié)合緊密的小分子有機(jī)物。金屬離子作為輔助因子。金屬離子輔酶輔基酶蛋白和輔助因子單獨(dú)存在均無(wú)催化活性，只有二者結(jié)合為全酶才有催化活性。酶蛋白決定酶催化專一性，輔助因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體決定反應(yīng)的性質(zhì)。某些小分子有機(jī)化合物與酶蛋白結(jié)合在一起并協(xié)同實(shí)施催化作用，這類分子被稱為輔酶（或輔基）。輔酶是一類具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的化合物。參與的酶促反應(yīng)主要為氧化-還原反應(yīng)或基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。大多數(shù)輔酶的前體主要是水溶性B族維生素。許多維生素的生理功能與輔酶的作用密切相關(guān)。酶分子中的金屬離子根據(jù)金屬離子與酶蛋白結(jié)合程度，可分為兩類：金屬酶和金屬激酶。在金屬酶中,酶蛋白與金屬離子結(jié)合緊密。如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2等。金屬酶中的金屬離子作為酶的輔助因子，在酶促反應(yīng)中傳遞電子，原子或功能團(tuán)。金屬酶中的金屬離子與配體金屬離子配體酶或蛋白

Mn2咪唑丙酮酸脫氫酶Fe2+/Fe3+卟啉環(huán)，咪唑，血紅素，含硫配體氧化-還原酶，過(guò)氧化氫酶Cu+/Cu2+咪唑，酰胺細(xì)胞色素氧化酶Co2+卟啉環(huán)變位酶Zn2+-NH3，咪唑，（-RS）2碳酸酐酶，醇脫氫酶Pb2-SHd-氨基-g-酮戊二酸脫水酶Ni2-SH尿酶金屬激酶中的金屬離子激酶是一種磷酸化酶類，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。其中的金屬離子與酶的結(jié)合一般較松散。在溶液中，酶與這類離子結(jié)合而被激活。如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。金屬離子對(duì)酶有一定的選擇性,某種金屬只對(duì)某一種或幾種酶有激活作用。（三）、酶的分類根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，按照國(guó)際系統(tǒng)分類方法，將酶分為六大類：氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1氧化-還原酶OxidoreductaseAH2+B（O2）+BH2（H2O2，H2O）A轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2轉(zhuǎn)移酶TransferaseA·X+BA+B·X裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。

4裂合酶Lyase

ABA+B異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。

5異構(gòu)酶Isomerase

AB常見(jiàn)的有消旋和變旋、醛酮異構(gòu)、順?lè)串悩?gòu)和變位酶類。合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2草酰乙酸

6合成酶LigaseorSynthetase

（一）習(xí)慣命名方法

（1）根據(jù)作用底物來(lái)命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根據(jù)所催化的反應(yīng)的類型命名，如脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等。（3）兩個(gè)原則結(jié)合起來(lái)命名，如丙酮酸脫羧酶等。（4）根據(jù)酶的來(lái)源或其它特點(diǎn)來(lái)命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。二酶的命名（二）國(guó)際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。例如：習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶系統(tǒng)名稱:丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶催化的反應(yīng):谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸酶的編碼乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號(hào)每個(gè)酶都有一個(gè)有四個(gè)數(shù)字組成的編碼一酶和一般催化劑的共性1.用量少而催化效率高；2.它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。3.只能催化熱力學(xué)允許的反應(yīng)，在反映前后不發(fā)生改變。二酶催化作用特性1．高效性2．專一性3．反應(yīng)條件溫和4.酶的催化活性可調(diào)節(jié)控制（1）絕對(duì)專一性有些酶對(duì)底物的要求非常嚴(yán)格，只作用于一個(gè)特定的底物。這種專一性稱為絕對(duì)專一性（Absolutespecificity)。有些酶的作用對(duì)象不是一種底物，而是一類化合物或一類化學(xué)鍵。這種專一性稱為相對(duì)專一性(RelativeSpecificity)。包括族(group)專一性。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所構(gòu)成的糖苷水解，但對(duì)于糖苷的另一端沒(méi)有嚴(yán)格要求。和鍵(Bond)專一性。如酯酶催化酯的水解，對(duì)于酯兩端的基團(tuán)沒(méi)有嚴(yán)格的要求。（2）相對(duì)專一性（3）立體化學(xué)專一性酶的一個(gè)重要特性是能專一性地與手性底物結(jié)合并催化這類底物發(fā)生反應(yīng)。例如，淀粉酶只能選擇性地水解D－葡萄糖形成的1，4－糖苷鍵I,光學(xué)專一性O(shè)pticalSpecificityStereochemicalSpecificity幾何專一性有些酶只能選擇性催化某種幾何異構(gòu)體底物的反應(yīng)，而對(duì)另一種構(gòu)型則無(wú)催化作用。如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸水合生成蘋(píng)果酸，對(duì)馬來(lái)酸則不起作用。geometricalspecificity酶促反應(yīng)一般在pH5-8水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度范圍為20-40C。高溫或其它苛刻的物理或化學(xué)條件，將引起酶的失活。3．反應(yīng)條件溫和4.酶的催化活性可調(diào)節(jié)控制如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。某些酶催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。第三節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，同樣具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，有些酶還具有四級(jí)結(jié)構(gòu)。作為生物催化劑，酶的結(jié)構(gòu)又有一些特點(diǎn)。第三節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并催化底物發(fā)生反應(yīng)的部位。酶活性中心包括兩個(gè)部位。酶活性中心結(jié)合中心：酶與底物結(jié)合的部位，決定酶的專一性催化中心：催化底物發(fā)生反應(yīng)的部位，決定酶的催化效率、反映性質(zhì)。主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。必需基團(tuán)：在酶分子中和酶的催化活性直接有關(guān)的基團(tuán)，活性中心內(nèi)外都有。酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。必需基團(tuán)：二變構(gòu)酶亦稱別構(gòu)酶，由兩個(gè)以上亞基組成，除了具有與底物結(jié)合的活性中心外，還具有與調(diào)節(jié)劑結(jié)合的調(diào)節(jié)中心。當(dāng)酶與調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起酶活性的變化。酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)示意圖效應(yīng)劑別構(gòu)中心活性中心一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位；具有別構(gòu)效應(yīng)。指酶和一個(gè)配體（底物，調(diào)節(jié)物）結(jié)合后可以影響酶和另一個(gè)配體（底物）的結(jié)合能力。相同（均為底物）：同促效應(yīng)（homotropiceffect）不同（效應(yīng)調(diào)節(jié)物）：異促效應(yīng)（heterotropiceffect）根據(jù)配體結(jié)合后對(duì)后繼配體的影響根據(jù)配體性質(zhì)正協(xié)同效應(yīng)（positivecooperativeeffect）負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativeeffect）動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)：不符合米曼方程雙曲線。別構(gòu)酶的特點(diǎn)別構(gòu)酶與非調(diào)節(jié)酶動(dòng)力學(xué)曲線的比較別構(gòu)酶舉例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡(jiǎn)稱ATCase三酶原及酶原的激活

1酶原：酶無(wú)活性的前體。

2酶原的激活：從無(wú)活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿傅倪^(guò)程。4酶原激活的本質(zhì)：：酶原的激活實(shí)質(zhì)上是酶活性部位形成或暴露的過(guò)程。3激活劑

：能使無(wú)活性的酶原激活的物質(zhì)。胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖

胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對(duì)各種胰臟蛋白酶的激活作用

胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶

四同工酶(isoenzyme)

能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但在蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。乳酸脫氫酶（LDH)MMMMMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3HHHHH4HLDH5LDH4LDH3LDH2LDH1骨肌型心肌型乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖

多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a

b乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點(diǎn)樣線不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌腎肝骨骼肌血清-+原點(diǎn)同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用

(1)遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一種精良的判別遺傳標(biāo)志的工具。(2)發(fā)育學(xué)：有效地標(biāo)志細(xì)胞類型及細(xì)胞在不同條件下的分化情況，以及個(gè)體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。(3)生物化學(xué)和生理學(xué)：根據(jù)不同器官組織中同工酶的動(dòng)力學(xué)、底物專一性、輔助因子專一性、酶的變構(gòu)性等性質(zhì)的差異，從而解釋它們代謝功能的差別。（4）醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機(jī)體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分化的的分子標(biāo)志。第四節(jié)酶的催化作用機(jī)理酶促反應(yīng)：E+S===ES===ES*

EPE+P反應(yīng)方向,主要取決于反應(yīng)自由能變化H。而反應(yīng)速度快慢,則主要取決于反應(yīng)的活化能Ea。

（一）活化能降低

催化劑的作用是降低反應(yīng)活化能Ea,從而起到提高反應(yīng)速度的作用一酶作用高效率的機(jī)制

反應(yīng)過(guò)程中能的變化一酶作用高效率的機(jī)制

（二）中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)

在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E+S====E-SP+E

許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了E－S復(fù)合物的存在。E－S復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。E+SP+EES能量水平反應(yīng)過(guò)程GE1E2酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個(gè)低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。酶催化作用的本質(zhì)是酶的活性中心與底物分子通過(guò)短程非共價(jià)力(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成E-S反應(yīng)中間物，其結(jié)果使底物的價(jià)鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，起到激活底物分子和降低過(guò)渡態(tài)活化能作用。在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。1鄰基效應(yīng)和定向效應(yīng)(三)與酶作用高效性有關(guān)的因素

鄰近定向效應(yīng)2與反應(yīng)過(guò)渡狀態(tài)結(jié)合作用

按SN2歷程進(jìn)行的反應(yīng)，反應(yīng)速度與形成的過(guò)渡狀態(tài)穩(wěn)定性密切相關(guān)。在酶催化的反應(yīng)中，與酶的活性中心形成復(fù)合物的實(shí)際上是底物形成的過(guò)渡狀態(tài)，所以，酶與過(guò)渡狀態(tài)的親和力要大于酶與底物或產(chǎn)物的親和力。3張力學(xué)說(shuō)這是一個(gè)形成內(nèi)酯的反應(yīng)。當(dāng)R＝CH3時(shí)，其反應(yīng)速度比R＝H的情況快315倍。由于-CH3體積比較大，與反應(yīng)基團(tuán)之間產(chǎn)生一種立體排斥張力，從而使反應(yīng)基團(tuán)之間更容易形成穩(wěn)定的五元環(huán)過(guò)渡狀態(tài)。

4酸－堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過(guò)質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過(guò)質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過(guò)程。廣義酸基團(tuán)廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子供體）（質(zhì)子受體）酶分子中可以作為廣義酸、堿的基團(tuán)His是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。5.共價(jià)催化

催化劑通過(guò)與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。

6金屬離子催化作用

金屬離子可以和水分子的OH-結(jié)合，使水顯示出更大的親核催化性能。提高水的親核性能

電荷屏蔽作用電荷屏蔽作用是酶中金屬離子的一個(gè)重要功能。多種激酶(如磷酸轉(zhuǎn)移酶)的底物是Mg2+－ATP復(fù)合物。

電子傳遞中間體

許多氧化-還原酶中都含有銅或鐵離子，它們作為酶的輔助因子起著傳遞電子的功能。

二酶作用專一性的機(jī)制

酶分子活性中心部位，一般都含有多個(gè)具有催化活性的手性中心，這些手性中心對(duì)底物分子構(gòu)型取向起著誘導(dǎo)和定向的作用，使反應(yīng)可以按單一方向進(jìn)行。酶能夠區(qū)分對(duì)稱分子中等價(jià)的潛手性基團(tuán)。(a)“三點(diǎn)結(jié)合”的催化理論。認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個(gè)點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對(duì)稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)。鎖鑰學(xué)說(shuō)鎖鑰學(xué)說(shuō)：認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣

誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.第五節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)定義：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及各種條件下對(duì)酶反應(yīng)速度的影響。

在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，為一級(jí)反應(yīng)。底物濃度增大與速度的增加不成正比,為混合級(jí)反應(yīng).當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。一底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響(一)V-S曲線1913年，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)對(duì)酶促反映的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km—米氏常數(shù)Vmax—最大反應(yīng)速度（二）米氏方程根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:米氏方程的推導(dǎo)：米氏方程Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。（三）米氏常數(shù)的意義及測(cè)定米氏常數(shù)Km的意義不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。

米氏常數(shù)的測(cè)定

基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。例：雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的雙倒數(shù)形式：

1Km11—=——.—+——

vVmax[S]Vmax

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測(cè)定：酶的Km在實(shí)際應(yīng)用中的意義鑒定酶：通過(guò)測(cè)定Km，可鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。判斷酶的最適底物。（天然底物）計(jì)算一定速度下底物濃度。了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平。判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)。判斷抑制類型。從米氏方程中求得：當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的90%，則90%V=100%V[S]/(km+[S])v=——————Vmax·[S]km+[S]即[S]=9km在進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)，通常用4km的底物濃度即可。計(jì)算一定速度下底物濃度二pH的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。pHv最適pH（optimumpH）pH穩(wěn)定性：在一定pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定pH對(duì)酶作用的影響機(jī)制：1.環(huán)境過(guò)酸、過(guò)堿使酶變性失活；2.影響酶活性基團(tuán)的解離；3.影響底物的解離。三溫度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。高溫兩種不同影響：1.溫度升高，反應(yīng)速度加快；2.溫度升高，酶熱變性速度加快。Tv最適溫度低溫影響：1.溫度降低，酶活性降低2.溫度過(guò)低,酶無(wú)活性但不變性四激活劑對(duì)酶作用的影響

凡能提高酶活力的物質(zhì)都是酶的激活劑。如Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+Co2+、Fe2+陰離子：

Cl-、Br有機(jī)分子還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA-

這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用一般情況下，一種激活劑對(duì)某種酶是激活劑，而對(duì)另一種酶則起抑制作用；對(duì)于同一種酶，不同激活劑濃度會(huì)產(chǎn)生不同的作用。應(yīng)用激活劑時(shí)應(yīng)注意五抑制劑對(duì)酶活性的影響使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。抑制劑類型和特點(diǎn)

競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可逆抑制劑非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

非專一性不可逆抑制劑不可逆抑制劑

專一性不可逆抑制劑抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，引起酶活力喪失，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。（一）不可逆抑制1、非專一性不可逆抑制劑

抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團(tuán)，這些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。類型：2、專一性不可逆抑制劑

這類抑制劑選擇性很強(qiáng)，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。（二）可逆抑制抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過(guò)透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類1竟?fàn)幮砸种颇承┮种苿┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。

+IEIESP+EE+S競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

實(shí)例：磺胺藥物的藥用機(jī)理H2N--SO2NH2對(duì)氨基苯磺酰胺H2N--COOH對(duì)氨基苯甲酸對(duì)氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤葉酸競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)：1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分相似，二者競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合部位。4）Vmax不變，Km增大[S]vV/2km2）抑制程度取決于I和S的濃度以及與酶結(jié)合的親和力大小。km′無(wú)I有I3）可以通過(guò)增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭(zhēng)能力來(lái)消除。2非竟?fàn)幮砸种泼缚赏瑫r(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。抑制劑與活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，不與底物競(jìng)爭(zhēng)美的活性中心，所以稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

+IEI+SESIESP+EE+S+I實(shí)例：重金屬離子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金屬絡(luò)合劑（EDTA、F-、CN-、N3-）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：1）、抑制劑與底物結(jié)構(gòu)不相似，抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合。2）、Vm下降，Km不變3）、非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^(guò)增大底物濃度的方法來(lái)消除。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示：非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：底物和抑制劑同時(shí)與酶結(jié)合，但形成的EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。S+EESE+P+I↑↓EI+I↑EIS+[S]E+Pv=———————————V1+[I]/ki·[S]km+[S][S]v無(wú)IV/2km有I(′)3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。ESIESP+EE+S+I反競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：1）抑制劑與酶和底物的復(fù)合物結(jié)合。2）Km和Vm下降3）底物濃度增加，抑制作用加強(qiáng)。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：有無(wú)抑制劑存在時(shí)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程

第六節(jié)、酶活力測(cè)定

又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力。通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來(lái)表示。因此酶活力可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為濃度\單位時(shí)間等。酶是蛋白質(zhì)，種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，一般對(duì)酶的測(cè)定，不是直接測(cè)定其酶蛋白的濃度，而是測(cè)定其催化化學(xué)反應(yīng)的能力，這是基于在最優(yōu)化條件下，當(dāng)?shù)孜镒銐颍ㄟ^(guò)量），在酶促反應(yīng)的初始階段，酶促反應(yīng)的速度（初速度）與酶的濃度成正比（即V=K［E］），故酶活力測(cè)定的是化學(xué)反應(yīng)速度，一定條件下可代表酶活性分子濃度一、酶活力2.酶活力的測(cè)定(1)測(cè)一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量(2)測(cè)定完成一定量反應(yīng)所需時(shí)間測(cè)定時(shí)確定三種量：①加入一定量的酶；②一定時(shí)間間隔；③物質(zhì)的增減量。測(cè)定酶活力常有以下幾種方法：在一個(gè)反應(yīng)體系中，加入一定量的酶液，開(kāi)始計(jì)時(shí)反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間反應(yīng)后，終止反應(yīng)，測(cè)定在這一時(shí)間間隔內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)量（終止時(shí)與起始時(shí)的濃度差），這時(shí)測(cè)得的是初速度。在一定條件下，加入一定量底物（規(guī)定），再加入合適量的酶液，測(cè)定完成該反應(yīng)（底物反應(yīng)完）所需的時(shí)間，（非初速度，為一平均速度）。動(dòng)態(tài)連續(xù)測(cè)定法。在反應(yīng)體系中，加入酶，用儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)整個(gè)酶促反應(yīng)過(guò)程中底物的消耗或產(chǎn)物的生成?？焖俜磻?yīng)追蹤法。近年來(lái)，追蹤極短時(shí)間（10-3s以下）內(nèi)反應(yīng)過(guò)程的方法和裝置已經(jīng)應(yīng)用。其代表有停流法（stopped-flow）和溫度躍變法（temperaturejump）。酶活力測(cè)定方法：反應(yīng)計(jì)時(shí)。反應(yīng)計(jì)時(shí)必須準(zhǔn)確。反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)到時(shí)，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時(shí)間。終止酶反應(yīng)，常使酶立刻變性，最常用的方法是加入三氯乙酸或過(guò)氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來(lái)停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來(lái)停止反應(yīng)。反應(yīng)量的測(cè)定。測(cè)底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物是從無(wú)到有，變化量明顯，極利于測(cè)定，所以大都測(cè)定產(chǎn)物的生成量。

具體物質(zhì)量的測(cè)定，據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過(guò)定量分析法測(cè)定。常用的方法有：光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個(gè)可用分光光度法或熒光光度法測(cè)出的化合物?；瘜W(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出的化合物，然后再反過(guò)來(lái)算出酶的活性。放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時(shí)間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。

二酶活力單位：是衡量酶活力大小的計(jì)量單位,規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位或又稱酶單位。(一）國(guó)際單位：1、國(guó)際單位U（Unit）：在最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。1U=1μmol/min2、“Katal”單位：指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。1Kat=1mol/sKat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，1U=16067nKat以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶單位表示1分鐘使1μmol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個(gè)相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2μmol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無(wú)法計(jì)算。比活力（比活性）：每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（酶單位/mg蛋白）。實(shí)際應(yīng)用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示（如：酶單位/mL（液體制劑），酶單位/g（固體制劑）），對(duì)同一種酶來(lái)講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少），所以比活力是評(píng)價(jià)酶純度高低的一個(gè)指標(biāo)。在評(píng)價(jià)純化酶的純化操作中，還有一個(gè)概念就是回收率。

回收率=某純化操作后的總活力/某純化操作前的總活力［總活力=比活力×總體積（總重量）］三比活力第六節(jié)酶工程簡(jiǎn)介一、化學(xué)酶工程

天然酶固定化酶

化學(xué)修飾酶人工模擬酶二、生物酶工程克隆酶

突變酶

新酶

將酶學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合，產(chǎn)生了酶工程(enzymeengineering)這樣一個(gè)新的領(lǐng)域。酶工程主要研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等方面的應(yīng)用。（一）天然酶的分離純化1、基本原則：提取過(guò)程中避免酶變性而失去活性；防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學(xué)試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液.2、基本操作程序：選材：微生物（微生物發(fā)酵物:胞內(nèi)酶，胞外酶），動(dòng)物（動(dòng)物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等），分離：先進(jìn)行凈化處理（過(guò)濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，超離心等）。純化：可采用離子交換層析，凝膠過(guò)濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。（二）固定化酶固定化酶是通過(guò)吸附、耦聯(lián)、交聯(lián)和包埋等物理或化學(xué)的方法把酶連接到某種載體上，做成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特點(diǎn)：穩(wěn)定性提高，易分離，可反復(fù)使用，提高操作的機(jī)械強(qiáng)度。固定化酶

將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，固定于高分子支持物(或載體)上而成為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，稱固定化酶(immobilizedenzyme)。包埋法吸附法共價(jià)偶聯(lián)法交聯(lián)法溴化氰亞氨碳酸基偶聯(lián)法OHOHBrCNH2OOOC=N-EO-CO-NH-EOHO-C-NH-ENHOHH2N-E（多羥基載體）O-CONH2OH（惰性）OOC=NH（活潑）O—C—NOH戊二醛交聯(lián)法

OHC(CH2)3CHO戊二醛H2N-EN

-HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N-

E-NCHCH（三）化學(xué)修飾酶：功能基團(tuán)的化學(xué)修飾酶酶蛋白側(cè)鏈的化學(xué)修飾酶分子內(nèi)或間的交聯(lián)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：提高穩(wěn)定性，增強(qiáng)催化效率（三）化學(xué)修飾酶：（四）人工模擬酶酶的模擬：根據(jù)酶作用的原理摸擬酶的活性中心和催化機(jī)理，用化學(xué)方法制備結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,高效、高選擇性、穩(wěn)定性能好的新型催化劑,可以是無(wú)機(jī)化合物、有機(jī)化合物或小肽。酶模型是人工合成的一類具有酶的某些屬性的有機(jī)化合物。雖然它的分子比較小，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，但是含有酶所具有的主要活性基團(tuán)以及與酶的活性中心相似的空間結(jié)構(gòu)，能夠模擬酶的某些關(guān)鍵性功能。目前研究得比較多的主要是水解酶和單加氧酶模型。人工模擬酶-benzyme

環(huán)糊精催化側(cè)鏈催化側(cè)鏈連接到環(huán)糊精上，可模擬胰凝乳蛋白酶環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)環(huán)糊精結(jié)構(gòu)模型二生物酶工程生物酶工程是以酶學(xué)和DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，也稱高級(jí)酶工程。包括：1、用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）2、對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）3、設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然界沒(méi)有的酶（新酶）生物酶工程示意圖

酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能新酶分子藍(lán)圖選擇性修飾方案突變酶

新酶克隆酶產(chǎn)品效用發(fā)展酶基因遺傳設(shè)計(jì)遺傳修飾DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)抗體酶

抗體酶（abzyme）又稱催化抗體（catalyticantibody）,是指通過(guò)一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)性質(zhì)，還類似于酶，能催化某種活化反應(yīng)。抗體與酶相似，都是蛋白質(zhì)分子，酶與底物的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合都是高度專一性的，但這兩種結(jié)合的基本區(qū)別在于酶與高能的過(guò)度態(tài)分子結(jié)合，而抗體則與抗原（基態(tài)分子）相結(jié)合。利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理可用過(guò)度態(tài)類似物作為半抗原來(lái)誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異地識(shí)別反應(yīng)過(guò)程中真正的過(guò)渡分子，從而降低反應(yīng)的活化能。達(dá)到催化反應(yīng)的目的，這種具有催化功能的抗體就被稱為催化抗體或抗體酶。O–C–A.酯酶的底物–酯B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成四面體過(guò)渡態(tài)C.設(shè)計(jì)的磷酸酯類似物,作為抗原去免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物磷酸酯類似物(半抗原)對(duì)酯水解反應(yīng)有催化作用的單克隆抗體免疫免疫反應(yīng)誘導(dǎo)法制備具有酯酶活性的抗體基因工程抗體酶的制備

對(duì)已產(chǎn)生的單抗，分析氨基酸的組成或相應(yīng)基因的堿基序列，對(duì)抗體結(jié)合的部位的基因進(jìn)行定位突變，在抗體結(jié)合部位換上有催化活性的氨基酸，基因工程的技術(shù)使得建立抗體基因的組合文庫(kù)，并根據(jù)需要構(gòu)建適當(dāng)程序的基因片段成為可能。抗體酶的篩選

在抗體酶研究中，一個(gè)不可少的步驟是在細(xì)胞融合后篩選到能分泌催化抗體的細(xì)胞克隆。一般的方法是先篩選其抗體能結(jié)合特異抗原的細(xì)胞克隆，再?gòu)募兓目贵w中篩選出有催化能力的單抗。主要篩選方法有生物學(xué)篩選法和純化學(xué)篩選法。抗體酶的研究和應(yīng)用前景

催化抗體的出現(xiàn)不僅為人們開(kāi)創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新方法，也使人們對(duì)催化過(guò)程中催化劑的作用機(jī)理和催化劑和底物的相互識(shí)別有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有催化作用的自身抗體在生物體內(nèi)的存在，其不僅和疾病相關(guān)，可能還參與了生物體內(nèi)的某些或基本的生物學(xué)反應(yīng)。有可能成為抗體酶研究的新熱點(diǎn)。充分利用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導(dǎo)、可改造的特點(diǎn)，可望制備出具有治療和輔助治療某些疾病或催化某類具有特殊意義反應(yīng)的抗體酶?？贵w酶的研究無(wú)疑會(huì)對(duì)化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。酶的制劑形式：固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）液體保存：低溫下短期保存。2.酶活力的測(cè)定概念酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來(lái)表示?；驹?酶是蛋白質(zhì)，種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，一般對(duì)酶的測(cè)定，不是直接測(cè)定其酶蛋白的濃度，而是測(cè)定其催化化學(xué)反應(yīng)的能力，這是基于在最優(yōu)化條件下，當(dāng)?shù)孜镒銐颍ㄟ^(guò)量），在酶促反應(yīng)的初始階段，酶促反應(yīng)的速度（初速度）與酶的濃度成正比（即V=K［E］），故酶活力測(cè)定的是化學(xué)反應(yīng)速度，一定條件下可代表酶活性分子濃度。酶的保存：1.低溫（0~4℃，-20℃）；2.高濃度較穩(wěn)定；3.加入穩(wěn)定劑；4.固定化。酶的固定化就是把水溶性酶經(jīng)物理（吸附法與包埋法）或化學(xué)方法（共價(jià)偶聯(lián)法與交聯(lián)法）處理后，使酶與惰性載體結(jié)合或?qū)⒚赴衿饋?lái)成為一種不溶于水的狀態(tài)。吸附法：使酶被吸附于惰性固體的表面，或吸附于離子交換劑上。包埋法：使酶包埋在凝膠的格子中或聚合物半透膜小膠囊中。偶聯(lián)法：使酶通過(guò)共價(jià)鍵連接于適當(dāng)?shù)牟蝗苡谒妮d體上。交聯(lián)法：使酶分子依靠雙功能基團(tuán)試劑交聯(lián)聚合成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)。!EYAUwQsipflb^7>3@0-K&G#CWyTvPrhnd 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