基因工程的基本操作程序3

（優(yōu)選）基因工程的基本操作程序當前1頁，總共32頁。當前2頁，總共32頁。基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟：1）目的基因的獲取2）基因表達載體的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細胞4）目的基因的檢測與鑒定當前3頁，總共32頁。當前4頁，總共32頁。步驟一：目的基因的獲取目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。當前5頁，總共32頁。目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法當前6頁，總共32頁。1.鳥槍法（散彈射擊法）

用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來。用限制酶切斷成許多片段當前7頁，總共32頁。1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2.人工合成基因法當前8頁，總共32頁。2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成當前9頁，總共32頁。上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮姴僮鬟^程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因當前10頁，總共32頁。哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術(shù)：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。當前11頁，總共32頁。當前12頁，總共32頁。3）從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫:將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫:基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.當前13頁，總共32頁。用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個個片段，然后將這些片段隨機地連接在某些質(zhì)?；蚱渌d體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎?，通過細胞的增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系（克?。斶@些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA，分別稱為某種生物的線粒體基因文庫或葉綠體基因文庫。為了有效地保存基因文庫，可通過細菌在固體培養(yǎng)基上繁殖而使包含各個特定DNA片段的細菌增多。通過分子雜交的方法，可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細菌（或噬菌體）。經(jīng)過擴增得到大量這樣的細菌（或噬菌體），從中便可分離出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文庫是分離高等真核生物基因的有效手段，對于基因定位和基因工程的研究都很有用。當前14頁，總共32頁。當前15頁，總共32頁。步驟二：基因表達載體的構(gòu)建1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。當前16頁，總共32頁。當前17頁，總共32頁。常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞當前18頁，總共32頁。①直接導入法有電擊、顯微注射、直接吸收、基因槍等方法。（1）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細胞。（2）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主細胞混在一起，讓其吸收。（4）基因槍法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發(fā)射到宿主細胞中。②間接導入法常用的載體是質(zhì)粒、λ噬菌體、科斯質(zhì)粒。（1）質(zhì)粒是細菌染色體DNA以外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它能自我復制，也可整合到細胞染色體DNA中與其一起表達。質(zhì)粒通常還含有標記基因，這可以從細胞的表型特征來識別。（2）λ噬菌體是一種細菌病毒，其環(huán)狀雙鏈DNA可以作為目的基因的載體。（3）科斯質(zhì)粒是一種雜種質(zhì)粒，含有質(zhì)粒和λ噬菌體的部分順序，很適合用作真核生物基因的載體。當前19頁，總共32頁。1.將目的基因?qū)胫参锛毎斍?0頁，總共32頁。2.將目的基因?qū)雱游锛毎斍?1頁，總共32頁。3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?/p>

大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:首先用Ca2+處理細胞,以增大細菌細胞壁的通透性,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細胞稱為感受態(tài)細胞.第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程.第二步目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。當前22頁，總共32頁。1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。3）目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。當前23頁，總共32頁。步驟四：目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因當前24頁，總共32頁。不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。當前25頁，總共32頁。當前26頁，總共32頁。

前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。當前27頁，總共32頁。多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應變化的個體進一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。當前28頁，總共32頁。1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習當前29頁，總共32頁。2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A、能復制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習當前30頁，總共32頁。3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因