放射配基受體結(jié)合法演示文稿

放射配基受體結(jié)合法演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共26頁(yè)。優(yōu)選放射配基受體結(jié)合法當(dāng)前2頁(yè)，總共26頁(yè)。

一、受體制備

1.目的：受體制備是在放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)前將含有某種受體的組織進(jìn)行預(yù)處理，使之更符合實(shí)驗(yàn)的要求。2.步驟1）將組織或細(xì)胞在低滲緩沖液中勻漿。通常大部分受體在數(shù)小時(shí)是比較穩(wěn)定的。但為了保持活性，經(jīng)常將組織盡快地放置在冰內(nèi)。纖維組織，例如肺，應(yīng)該用尼龍網(wǎng)（～50μm）加以過(guò)濾。2）慢速離心（500g）可幫助除去組織中某些不需要的部分(細(xì)胞核及大碎片)

。當(dāng)前3頁(yè)，總共26頁(yè)。

3）將勻漿在盡可能快的轉(zhuǎn)速下離心5-10min，但不要用超速（即50,000g）。盡管對(duì)于很多受體并不需要低溫，但離心常規(guī)是在4℃下進(jìn)行。4）將沉淀用相同緩沖液再度勻漿和離心。最終的組織制備被稱為粗微粒部分或膜部分。5）兩步離心的目的是去除任何可溶性干擾物，如內(nèi)源性的神經(jīng)遞質(zhì)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸等，它們可能干擾放射配基結(jié)合測(cè)定。當(dāng)前4頁(yè)，總共26頁(yè)。

3.注意事項(xiàng)1）勻漿緩沖液勻漿緩沖液的選擇通常不是關(guān)鍵，對(duì)于大部分受體制備，在中性pH下的任何緩沖液已經(jīng)足夠。對(duì)于某些受體推薦在勻漿緩沖液和/或溫孵液中加入EDTA，以完全去除各種內(nèi)源性物質(zhì)。質(zhì)當(dāng)前5頁(yè)，總共26頁(yè)。

2）受體制備的貯存大部分在冷凍下是穩(wěn)定的，原組織或膜部分均能貯藏在-20℃或-80℃一段時(shí)間。某些受體和小塊組織（10mg）儲(chǔ)存后效果不好，應(yīng)該用新鮮組織進(jìn)行測(cè)定。

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二、放射配基

對(duì)于任何受體系統(tǒng)，商業(yè)上可提供若干種放射配基，要根據(jù)放射配基的特征和要解決的問(wèn)題加以選擇。應(yīng)考慮的問(wèn)題包括：放射性同位素的種類（通常是3H或125I），非特異結(jié)合的程度，放射配基對(duì)受體的選擇性和親和力以及放射配基是激動(dòng)劑還是拮抗劑等。

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1.放射配基的種類

3H放射配基的優(yōu)點(diǎn)是在化學(xué)上較穩(wěn)定，生物學(xué)上與非標(biāo)記的化合物沒(méi)有差異，有較長(zhǎng)的半衰期（12年），標(biāo)記配基經(jīng)常使用數(shù)月或更長(zhǎng)時(shí)間，但它的特異活性較低（30-100Ci/mmol）。而125I的半衰期短（60天），它的放射配基通常每4-6周購(gòu)買和準(zhǔn)備一次。碘標(biāo)放射配基的優(yōu)點(diǎn)是比較高的特異活性（2,200Ci/mmol），在受體密度低和組織數(shù)量少時(shí)特別有用。使用碘標(biāo)配基不需要閃爍液，免除了購(gòu)買閃爍液的費(fèi)用和操作步驟，因而方便和價(jià)廉。當(dāng)前8頁(yè)，總共26頁(yè)。

2.放射配基的親和力

放射配基與受體親和力越高越好，因?yàn)闇y(cè)定中可以使用較低濃度的放射配基，且非特異結(jié)合的水平也較低。另外，親和力越高，解離速率越慢，操作較方便。當(dāng)前9頁(yè)，總共26頁(yè)。

3.放射配基的稀釋有時(shí)，為了將一個(gè)測(cè)定管的特異活性的最大值限制在106計(jì)數(shù)/min（cpm），可以用非標(biāo)記配基稀釋125I放射配基，從而降低其特異活性。另外，非標(biāo)記配基應(yīng)該使用非活性的含碘配基，而不是非碘的配基，因?yàn)楹笳吲c放射配基在化學(xué)上是不同的，可能有不同的藥理學(xué)特征。當(dāng)前10頁(yè)，總共26頁(yè)。

4.放射配基的總結(jié)合通常放射配基的非特異結(jié)合越低越好。一個(gè)測(cè)定中如果50%總結(jié)合是特異的，它被認(rèn)為是合格的；70%是好的，90%是非常好的。當(dāng)前11頁(yè)，總共26頁(yè)。

三、溫孵條件

1.時(shí)間和溫度

對(duì)于飽和和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，所用的模型是平衡實(shí)驗(yàn)。溫孵的時(shí)間要足夠長(zhǎng)，以保證達(dá)到平衡（或至少是穩(wěn)態(tài)）。由于達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間依賴放射配基的濃度，在預(yù)測(cè)溫孵時(shí)間時(shí)，應(yīng)使用低濃度的放射配基。室溫下，使用接近它們Kd的濃度，20-60min可達(dá)到穩(wěn)態(tài)。如果在20和60min之間結(jié)合是恒定的，那麼可選定溫孵時(shí)間為30min。盡管有人認(rèn)為生理溫度（37℃）更好，但實(shí)際上在室溫下（22℃）測(cè)定最為方便。另外，某些測(cè)定選在冰中（4℃）進(jìn)行，因?yàn)樵谶@個(gè)溫度下的數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。當(dāng)前12頁(yè)，總共26頁(yè)。

2.緩沖液

通常緩沖液pH在生理范圍，即pH7和8之間。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用Tris作為緩沖液，主要原因是使用方便，因?yàn)樯唐稵ris是預(yù)先配制好的，不需要調(diào)整pH。但Tris不一定是最好的，可試用其它的緩沖液。當(dāng)前13頁(yè)，總共26頁(yè)。

3.放射配基的濃度

在測(cè)定中，放射配基采用的濃度要依據(jù)實(shí)驗(yàn)的類型。對(duì)于動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，濃度應(yīng)較低，只要保證測(cè)定計(jì)數(shù)（例如＞300cpm）即可，大約為0.2×Kd較好。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，使用相似的濃度，約為Kd或更低一些。對(duì)于飽和實(shí)驗(yàn)，如果可能，放射配基濃度范圍應(yīng)該是～0.1×Kd～10×Kd。如果放射配基與一個(gè)以上受體位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)高親和力位點(diǎn)（低Kd）應(yīng)采用0.1×Kd，對(duì)低親和力位點(diǎn)（高Kd）應(yīng)采用10×Kd。當(dāng)前14頁(yè)，總共26頁(yè)。

4.受體濃度

在合理的范圍內(nèi)，組織（受體）濃度越高，結(jié)合越好。增加受體濃度將增加特異結(jié)合對(duì)非特異結(jié)合的比率，因?yàn)榉翘禺惤Y(jié)合中的大部分是與玻璃纖維濾膜的結(jié)合。粗略地看，如果加入的放射配基有＞10%被結(jié)合，那麼組織的濃度就太高了。另外，特異結(jié)合的量與組織濃度應(yīng)該呈線性關(guān)系。對(duì)于大部分受體測(cè)定實(shí)驗(yàn)，一般采用的組織濃度范圍是2-10mg/ml濕重組織，或者～100-500μg/ml膜蛋白。對(duì)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，它們的受體是過(guò)表達(dá)的，測(cè)定采用的蛋白濃度應(yīng)該大大降低。當(dāng)前15頁(yè)，總共26頁(yè)。

5.非放射活性藥物的濃度

如果競(jìng)爭(zhēng)性藥物抑制放射配基結(jié)合是按照單一位點(diǎn)模型，那麼大約10倍抑制劑濃度是足夠的。如果涉及多位點(diǎn)結(jié)合或親和力狀態(tài)，那麼至少需要20倍濃度，跨越更大范圍。當(dāng)前16頁(yè)，總共26頁(yè)。

6.確定特異性結(jié)合1）特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合

在所有放射配基結(jié)合測(cè)定中最重要的是確定特異性結(jié)合。從概念上講，特異性結(jié)合可以被定義為與受體的結(jié)合。非特異結(jié)合是除此以外其它的結(jié)合。實(shí)際操作上講，非特異結(jié)合是有適當(dāng)?shù)倪^(guò)量非標(biāo)記藥物存在（例如：比IC50高100倍），受體被完全阻斷時(shí)的結(jié)合。非特異結(jié)合包括放射配基與其它受體位點(diǎn)、玻璃纖維濾膜的結(jié)合，組織的吸附和溶解于膜脂類等。特異性結(jié)合是總結(jié)合與非特異結(jié)合的差值。特征上講，非特異結(jié)合達(dá)到穩(wěn)態(tài)比特異性結(jié)合要快，當(dāng)放射配基濃度增加時(shí)不會(huì)飽和。當(dāng)前17頁(yè)，總共26頁(yè)。

2）注意事項(xiàng)用于確定非特異結(jié)合的藥物濃度不要太高，因?yàn)楹芨叩乃幬餄舛纫部赡芤种品翘禺惤Y(jié)合。確定非特異結(jié)合的一個(gè)好方法是用不同的非標(biāo)記配基進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。在比IC50高100倍濃度下，它們對(duì)結(jié)合的抑制程度應(yīng)該是相同的。在測(cè)定非特異結(jié)合時(shí)，最好用與放射配基化學(xué)上不相似的藥物。這是因?yàn)橄嗨扑幬锟赡芤种婆c放射配基同樣“特異的”結(jié)合，但并不是受體的結(jié)合位點(diǎn)。如果可能，應(yīng)避免使用放射配基的非放射活性形式。有很多例子表明，在確定非特異結(jié)合時(shí)，由于未很好選擇藥物或濃度，導(dǎo)致錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)和結(jié)論。當(dāng)前18頁(yè)，總共26頁(yè)。放射配基的總結(jié)合、非特異性結(jié)合和特異性結(jié)合。當(dāng)前19頁(yè)，總共26頁(yè)。

四、結(jié)合與游離放射配基的分離

受體結(jié)合測(cè)定的一個(gè)關(guān)鍵步驟是分離結(jié)合與游離放射配基。在進(jìn)行分離時(shí)，防止受體-放射配基復(fù)合物的解離是很重要的。降低溫度可以減慢解離的速率，快速操作可以縮短解離的時(shí)間。

當(dāng)前20頁(yè)，總共26頁(yè)。

對(duì)于膜結(jié)合測(cè)定經(jīng)常使用的技術(shù)是玻璃纖維濾膜的真空過(guò)濾。通過(guò)過(guò)濾將含有放射配基-受體復(fù)合物的膜碎片留在濾膜上，游離的（未結(jié)合的）放射配基與濾液一起穿過(guò)濾膜被棄去。用大量的緩沖液洗滌膜碎片和濾膜可降低非特異結(jié)合。另外，預(yù)先將濾膜用某種溶液（如0.1%聚乙烯亞胺水溶液）洗滌或浸泡一段時(shí)間，也可減少濾膜上的非特異結(jié)合。在某些測(cè)定中，選擇濾膜的材料也是很重要的。當(dāng)前21頁(yè)，總共26頁(yè)。

過(guò)濾法的優(yōu)點(diǎn)是快速和方便。缺點(diǎn)是只有在放射配基-受體復(fù)合物的親和力高于10nM時(shí)才能應(yīng)用。它的主要非特異結(jié)合是與濾膜而不是與組織制備的結(jié)合。對(duì)于放射配基與受體的親和力在10nM-1μM范圍（這時(shí)解離可能太快）的測(cè)定，以及與濾膜的非特異結(jié)合高得不能應(yīng)用時(shí)，經(jīng)常使用離心技術(shù)來(lái)代替過(guò)濾。當(dāng)前22頁(yè)，總共26頁(yè)。五、配體結(jié)合試驗(yàn)類型和結(jié)果分析

（一）飽和曲線

用一固定濃度的受體蛋白和不同濃度的放射配體一起孵育，將特異性結(jié)合與配體濃度作圖，可畫出一矩形拋物線即飽和曲線。當(dāng)前23頁(yè)，總共26頁(yè)。放射配基受體結(jié)合的飽和曲線當(dāng)前24頁(yè)，總共26頁(yè)。

1.

Clark模型：配體受體結(jié)合反應(yīng)為可逆雙分子反應(yīng)（L+R→LR）；所有受體都是等效和獨(dú)立的；配體本身不代謝，也不與其它位置結(jié)合；生物效應(yīng)正比于結(jié)合受體數(shù)目。根據(jù)質(zhì)量作用定律：平衡時(shí)（LT）>>(RL)(LT)≈(L)KD＝

（1）

故

KD=

（2）

(LT)總