普通微生物第十章微生物與基因工程演示文稿

普通微生物第十章微生物與基因工程演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共81頁(yè)。（優(yōu)選）普通微生物第十章微生物與基因工程當(dāng)前2頁(yè)，總共81頁(yè)。

。

載體（Vector）：能容忍外源DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。當(dāng)前3頁(yè)，總共81頁(yè)。

不同來(lái)源的DNA片段共價(jià)連接、通過(guò)重新組合構(gòu)成了具有兩個(gè)DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過(guò)程。DNA重組（recombination)：當(dāng)前4頁(yè)，總共81頁(yè)。轉(zhuǎn)化(transformation)：

以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的載體DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過(guò)程?；蛑窪NA分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程。當(dāng)前5頁(yè)，總共81頁(yè)。

基因工程核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)，因此，基因工程和重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnology)有時(shí)為同義詞

基因工程的出現(xiàn)使得生物科學(xué)迅猛發(fā)展，并帶動(dòng)了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起！當(dāng)前6頁(yè)，總共81頁(yè)。基因工程的特點(diǎn)可設(shè)計(jì)性穩(wěn)定性遠(yuǎn)緣性風(fēng)險(xiǎn)性當(dāng)前7頁(yè)，總共81頁(yè)。一、基因工程發(fā)展歷史基因工程三大理論基礎(chǔ)基因工程三大技術(shù)發(fā)現(xiàn)§1 基因工程概述當(dāng)前8頁(yè)，總共81頁(yè)。20世紀(jì)40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA20世紀(jì)50年代：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)20世紀(jì)60年代：確定了遺傳信息的傳遞方式

基因工程理論基礎(chǔ)

當(dāng)前9頁(yè)，總共81頁(yè)。

(A)注射有莢膜（S型）的致病性肺炎雙球菌，小鼠死亡

(B)注射突變的（R型）非致病性肺炎雙球菌，小鼠存活。

(C)注射加熱殺死的S型，小鼠存活。

(D)注射活的R型與加熱殺死的S型的混合物，小鼠死亡。

圖1-1肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)當(dāng)前10頁(yè)，總共81頁(yè)。

基因工程學(xué)重大的技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因工程酶技術(shù)

1970年限制性核酸內(nèi)切酶的分離和純化（HindIII）分子克隆

1972年Berg首次實(shí)現(xiàn)基因重組

1973年Cohen重組DNA轉(zhuǎn)化DNA測(cè)序

1975年Sanger實(shí)驗(yàn)室建立酶法DNA測(cè)序技術(shù)

1977年Gilbert實(shí)驗(yàn)室又建立化學(xué)法DNA測(cè)序技術(shù)

1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予Berg、Sanger、Gilbert

DNA的分子克隆+DNA測(cè)序

—使重組DNA技術(shù)系統(tǒng)得以產(chǎn)生當(dāng)前11頁(yè)，總共81頁(yè)。相關(guān)理論的復(fù)習(xí)基因的概念和特性DNA的結(jié)構(gòu)與性能DNA的復(fù)制與表達(dá)基因組當(dāng)前12頁(yè)，總共81頁(yè)。

一基因的概念遺傳學(xué)概念：

基因:

是DNA分子中攜帶特定遺傳信息的最小功能單位，控制遺傳性狀分子生物學(xué)定義：編碼功能性蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列，負(fù)載特定的遺傳信息并在一定條件下調(diào)節(jié)、表達(dá)遺傳信息，指令蛋白質(zhì)合成。

當(dāng)前13頁(yè)，總共81頁(yè)?；虻墓δ芊诸?lèi)結(jié)構(gòu)基因（structuregene)：決定蛋白質(zhì)/多肽鏈或酶分子結(jié)構(gòu)的基因調(diào)控基因(regulatorygene)：調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)功能當(dāng)前14頁(yè)，總共81頁(yè)?；虻囊话闾匦园氡Ａ糇晕覐?fù)制決定生物表型或性狀基因突變新的生物性狀當(dāng)前15頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA的結(jié)構(gòu).兩條脫氧核苷酸鏈成反向平行排列，.一條呈5‘3’方向.另一條呈3‘5’方向。.以堿基配對(duì)形成氫鍵而形成雙螺旋結(jié)構(gòu).遵循互補(bǔ)配對(duì)原則即：

A＝TG≡C基本單位：核苷酸（堿基、五碳糖、磷酸）雙螺旋結(jié)構(gòu)(A)腺嘌呤(G)鳥(niǎo)嘌呤(C)胞嘧啶(U)尿嘧啶(T)胸腺嘧啶當(dāng)前16頁(yè)，總共81頁(yè)。當(dāng)前17頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA的三種構(gòu)型：

-超螺旋：共價(jià)閉環(huán)（CCC）

-開(kāi)環(huán)：?jiǎn)捂溔笨冢∣C）

-線型：雙鏈斷裂（L）LC

cccoc當(dāng)前18頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA的性能吸收光譜高峰為260nm

溴化乙啶（EB）嵌入DNA雙鏈配對(duì)堿基之間，紫外線照射，可顯示DNA位置在電場(chǎng)中的遷移率與分子量大小、構(gòu)象有關(guān)DNA變性：在物理或化學(xué)因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過(guò)程DNA復(fù)性：變性因素去除后在適當(dāng)條件下恢復(fù)成雙鏈的過(guò)程。當(dāng)前19頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA變性(DNADenature)

指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，均可引起核酸分子變性。解鏈溫度:TmTm=69.3＋0.41(%G+C)當(dāng)前20頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA復(fù)性

(DNARenature)是DNA變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。熱變性后的DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱(chēng)之為退火(annealing)。最佳復(fù)性條件一般認(rèn)為是比Tm低25℃左右的溫度復(fù)性時(shí)溫度下降必須緩慢，若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。當(dāng)前21頁(yè)，總共81頁(yè)。DNA的復(fù)制與表達(dá)半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）基因表達(dá)（geneexpression）mRNA蛋白

轉(zhuǎn)錄翻譯當(dāng)前22頁(yè)，總共81頁(yè)?；蚪M（genome)概念：細(xì)胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)常見(jiàn)基因組特點(diǎn)：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組當(dāng)前23頁(yè)，總共81頁(yè)。1.病毒基因組基因組小，基因數(shù)少帶有重疊基因大部分為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因當(dāng)前24頁(yè)，總共81頁(yè)。HBV基因組當(dāng)前25頁(yè)，總共81頁(yè)。2原核生物基因與表達(dá)特點(diǎn)

——細(xì)菌基因表達(dá)

1）基因組較小2）基因是連續(xù)的3）沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程和翻譯后加工過(guò)程。4）轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，可同時(shí)進(jìn)行。當(dāng)前26頁(yè)，總共81頁(yè)。

2.原核生物基因組細(xì)菌染色質(zhì)質(zhì)粒（plasmid）：

細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA?？勺灾鲝?fù)制編碼生物學(xué)形狀基因工程常用載體當(dāng)前27頁(yè)，總共81頁(yè)。

當(dāng)前28頁(yè)，總共81頁(yè)。真核生物基因組基因組龐大3×106bp、染色質(zhì)、染色體.基因不連續(xù)性斷裂基因、內(nèi)含子、外顯子（大部分基因含有內(nèi)含子）含有大量重復(fù)序列非編碼區(qū)域多于編碼區(qū)域非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1）轉(zhuǎn)錄和翻譯不偶聯(lián)當(dāng)前29頁(yè)，總共81頁(yè)。二、基因工程的基本過(guò)程一、目的基因的制備(donorDNA)二、體外DNA重組(DNArecombination)三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞(Transformation)四、重組體的篩選鑒定(identification)五、控制外源基因的表達(dá)(geneexpression)當(dāng)前30頁(yè)，總共81頁(yè)?；蚬こ踢^(guò)程示意圖①?gòu)募?xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達(dá)③③當(dāng)前31頁(yè)，總共81頁(yè)。三、微生物學(xué)與基因工程的關(guān)系1.提供豐富而獨(dú)特的基因資源2.工具酶3.克隆載體4.基因克隆的宿主5.基因表達(dá)的反應(yīng)器6.有關(guān)基因結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達(dá)調(diào)控的理論主要來(lái)自對(duì)微生物的研究一切基因工程操作都離不開(kāi)微生物—操作技術(shù)和理論指導(dǎo)當(dāng)前32頁(yè)，總共81頁(yè)。一、從基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)分離目的基因二、酶法或化學(xué)方法人工合成基因三、PCR擴(kuò)增基因四、基因的定位誘變§2 基因的分離、合成和定位誘變當(dāng)前33頁(yè)，總共81頁(yè)?；蛭膸?kù)基因組DNA片段的全部克隆

一、從基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)分離目的基因建立基因文庫(kù)步驟：1、提取基因組DNA2、DNA片段化3、選擇合適載體4、DNA與載體連接5、重組體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染當(dāng)前34頁(yè)，總共81頁(yè)。當(dāng)前35頁(yè)，總共81頁(yè)。cDNA文庫(kù)：生物體全部mRNA的cDNA的克隆總體mRNA的提取利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚dT或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈利用DNA聚合酶Ⅰ，以cDNA的第一條鏈為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA的第二條鏈，常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成缺口和切口，產(chǎn)生一系列引物，或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機(jī)引物合成第二條鏈其它同基因文庫(kù)的構(gòu)建當(dāng)前36頁(yè)，總共81頁(yè)。當(dāng)前37頁(yè)，總共81頁(yè)。適于遺傳背景清楚的細(xì)菌染色體

酶切電泳分離DNA化學(xué)方法人工合成基因應(yīng)用：1、合成基因2、合成核酸探針

探針(probe)：用同位素或其它非放射物質(zhì)標(biāo)記的一段特定的DNA或RNA片段3、合成DNA引物

二、酶法或化學(xué)方法人工合成基因當(dāng)前38頁(yè)，總共81頁(yè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PolymeraseChainReaction,PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法高溫變性92～96℃低溫復(fù)性（退火）40～60℃中溫延伸70～72℃三、PCR擴(kuò)增基因當(dāng)前39頁(yè)，總共81頁(yè)。PCR基本原理當(dāng)前40頁(yè)，總共81頁(yè)。當(dāng)前41頁(yè)，總共81頁(yè)。所用DNA聚合酶：Klenow聚合酶1988年Saiki等從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)分離到TaqDNA聚合酶火球菌(Pyrococcusfuriosus)分離到PfuDNA聚合酶;從Thermococcuslitoralis分離到VentDNA聚合酶從Thermusthermophilus中分離TthDNA聚合酶校正功能當(dāng)前42頁(yè)，總共81頁(yè)。PCR注意事項(xiàng)：引物的設(shè)計(jì)2.退火溫度3.實(shí)驗(yàn)操作當(dāng)前43頁(yè)，總共81頁(yè)。PCR應(yīng)用1、基因擴(kuò)增和制備DNA探針2、臨床醫(yī)學(xué)上傳染病的檢測(cè)等3、法醫(yī)上判定親緣關(guān)系4、定性、定量檢測(cè)基因表達(dá)水平當(dāng)前44頁(yè)，總共81頁(yè)。qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)當(dāng)前45頁(yè)，總共81頁(yè)。四、基因的定位誘變

在基因精確限定的位點(diǎn)引入突變1、寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變2、盒式誘變3、PCR定位誘變當(dāng)前46頁(yè)，總共81頁(yè)。1.寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變當(dāng)前47頁(yè)，總共81頁(yè)。2.盒式誘變(cassettemutagenesis)

較大片段的誘變當(dāng)前48頁(yè)，總共81頁(yè)。PCR定位誘變3.PCR誘變1）變異部位位于基因的末端引物5‘端限制位點(diǎn)的引入2）變異部位位于基因的中間

重組PCR(recombinantPCR)—Higuchi,1988年當(dāng)前49頁(yè)，總共81頁(yè)?！? 微生物與克隆載體

克隆載體(cloningvector)：

以擴(kuò)增外源DNA為目的的載體

到目前為止，基因工程中使用的載體基本上均來(lái)自微生物當(dāng)前50頁(yè)，總共81頁(yè)。克隆載體的基本要求應(yīng)是一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子(replicon)具有多克隆位點(diǎn)具有選擇標(biāo)記安全性當(dāng)前51頁(yè)，總共81頁(yè)。載體的種類(lèi)一、質(zhì)粒克隆載體二、λ噬菌體克隆載體三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector—黏粒載體)四、M13噬菌體載體五、噬菌質(zhì)粒載體(phagemid/phasmid)當(dāng)前52頁(yè)，總共81頁(yè)。一、質(zhì)?？寺≥d體1.質(zhì)?？寺≥d體的特性：具有獨(dú)立的復(fù)制起點(diǎn)含有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量1~200kbp外源DNA<15kbp具有較高拷貝數(shù)具有便于選擇的標(biāo)記易于導(dǎo)入細(xì)胞具有安全性當(dāng)前53頁(yè)，總共81頁(yè)。2.質(zhì)粒pBR322的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1977年Bolivar構(gòu)建環(huán)狀雙鏈DNA4,361bp外源DNA5kbp左右松弛型質(zhì)粒，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)兩個(gè)抗性基因Tetr

Ampr多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite;polylinker;24）插入失活(insertionalinactivation):

因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象當(dāng)前54頁(yè)，總共81頁(yè)。當(dāng)前55頁(yè)，總共81頁(yè)。3.其它質(zhì)粒載體pUCpGEM系列當(dāng)前56頁(yè)，總共81頁(yè)。二、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體克隆載體的優(yōu)點(diǎn)分子遺傳學(xué)背景十分清楚容量較大（23kbp）具有較高的感染率λ噬菌體克隆載體的構(gòu)建刪除基因組中非必需區(qū)除去多余的限制酶切位點(diǎn)當(dāng)前57頁(yè)，總共81頁(yè)。λ噬菌體克隆載體的種類(lèi)插入型載體(insertvector)取代型載體(replacementvector)78%~105%當(dāng)前58頁(yè)，總共81頁(yè)。三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector—黏粒載體)由λ噬菌體的粘性末端(cos位點(diǎn))和質(zhì)粒構(gòu)建而成黏粒的優(yōu)點(diǎn)具有噬菌體的高效感染率，以質(zhì)粒形式存在具有質(zhì)粒的復(fù)制方式具有克隆大片段外源DNA的能力(45kbp)當(dāng)前59頁(yè)，總共81頁(yè)。四、M13噬菌體載體

E.coli絲狀噬菌體環(huán)狀ssDNA6,407bp感染雄性菌后變成復(fù)制型dsDNA,以滾環(huán)方式復(fù)制出ssDNA特點(diǎn)：

1.間隔區(qū)插入β-半乳糖苷酶N端一小段編碼序列，編碼β-半乳糖苷酶的α肽，可與E.coli

lacZ突變基因產(chǎn)物ΔM15進(jìn)行α互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶。在含有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和顯色物5-

溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色噬菌斑

2.在α肽的編碼區(qū)插入多克隆位點(diǎn)，外源基因插入這一區(qū)段，破壞

α互補(bǔ)作用，使β-半乳糖苷酶失活，重組體產(chǎn)生白色噬菌斑當(dāng)前60頁(yè)，總共81頁(yè)。M13噬菌體載體克隆能力較小300~400bp特別適合用于制備單鏈DNA模板、單鏈DNA探針、定位誘變模板當(dāng)前61頁(yè)，總共81頁(yè)。五、噬菌粒載體(phagemid/phasmid)

又稱(chēng)噬粒，由噬菌體M13的基因間隔區(qū)和質(zhì)粒載體共同構(gòu)建的載體

pUC118將野生型M13的基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒載體

pUC18構(gòu)建而成在宿主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，產(chǎn)生雙鏈DNA；當(dāng)輔助噬菌體M13感染宿主細(xì)胞后，以滾環(huán)方式復(fù)制，產(chǎn)生單鏈DNA特點(diǎn)：分子小容量大10kbp可制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外源基因當(dāng)前62頁(yè)，總共81頁(yè)。幾類(lèi)大腸桿菌克隆載體比較載體類(lèi)型 克隆容量 主要用途質(zhì)粒載體 <15kbp 克隆和表達(dá)外源基因，DNA測(cè)序λ噬菌體載體<23kbp 構(gòu)建基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)柯斯質(zhì)粒載體<45kbp 構(gòu)建基因文庫(kù)M13載體 300~400bp 制備單鏈DNA，定位誘變，噬菌體展示噬菌質(zhì)粒載體<10kbp 制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外源 基因當(dāng)前63頁(yè)，總共81頁(yè)。六、真核生物的克隆載體1.酵母質(zhì)粒載體

利用酵母的2μm質(zhì)粒和其他染色體組分與pBR322構(gòu)建而成，為穿梭質(zhì)粒附加體質(zhì)粒（episomalplasmid)復(fù)制質(zhì)粒(replicatingplasmid)整合質(zhì)粒(integratingplasmid)當(dāng)前64頁(yè)，總共81頁(yè)。附加體質(zhì)粒（episomalplasmid)具有較高拷貝數(shù)當(dāng)前65頁(yè)，總共81頁(yè)。酵母染色體的自主復(fù)制序列復(fù)制質(zhì)粒(replicatingplasmid)中等拷貝數(shù)當(dāng)前66頁(yè)，總共81頁(yè)。整合質(zhì)粒(integratingplasmid)當(dāng)前67頁(yè)，總共81頁(yè)。2.真核生物病毒載體哺乳動(dòng)物病毒載體—SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒昆蟲(chóng)病毒載體—桿狀病毒：高容量（100kbp)、高表達(dá)效率(25%)、安全植物病毒載體—花椰菜花葉病毒載體，Ti質(zhì)粒載體當(dāng)前68頁(yè)，總共81頁(yè)。七、人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC) Murray1983年構(gòu)建，Burke等1987年用以構(gòu)建成YAC克隆庫(kù)，1000kbp容量細(xì)菌人工染色體(BAC)-120-300kb當(dāng)前69頁(yè)，總共81頁(yè)?！?微生物與基因工程工具酶

基因工程所用到的工具酶大多數(shù)是從不同微生物中獲得的當(dāng)前70頁(yè)，總共81頁(yè)。一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性酶(restrictionenzyme)：能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近特異切割DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶1.命名與分類(lèi)EcoRⅠHpaⅠ,HpaⅡ(Haemophilusparainfluenzae，副流感嗜血桿菌)HphⅠ(Haemophilusparahaemolyticus，副溶血嗜血桿菌)Ⅰ、Ⅱ

、Ⅲ三種類(lèi)型當(dāng)前71頁(yè)，總共81頁(yè)。2.限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

識(shí)別序列通常由4~8bp組成，具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)軸，序列呈回文結(jié)構(gòu)(paliindromicstructure)

切割片段理論大小為4nA.黏性末端(cohesiveend)HindⅢ5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’PstⅠ 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’當(dāng)前72頁(yè)，總共81頁(yè)。B.平末端HpaⅠ 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’同裂酶(isoschizomers)同尾酶(isocaudomers)Mun

ⅠEcoRⅠ5’-CAATTG-3’ 5’-GAATTC-3’3’-GTTAAC-5’ 3’-CTTAAG-5’表10-2

常用限制酶當(dāng)前73頁(yè)，總共81頁(yè)。二、DNA連接酶(DNAligase)T4DNA連接酶：Mg2+和ATP能催化平端連接大腸桿菌DNA連接酶：Mg2+和NAD+其它酶當(dāng)前74頁(yè)，總共81頁(yè)?！?外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞一、外源基因與載體的體外連接

1.黏性末端連接法

2.接頭或銜接物連接法

3.