高效液相色譜1課件

高效液相色譜(1)

（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）

——概述、理論與儀器許旭

分析室色譜組

Tel:3426Email:1.緒論，基本概念1.1方法簡介以液體為流動相的色譜法稱為液相色譜法。(包括紙色譜、薄層色譜法、柱色譜等)高效液相色譜法是指，用高壓力輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段的液相色譜法。高效液相色譜InAllianceSystems,the2695isdesignedtoworkwithbothEmpower?andMassLynx?software,Symmetry?andXTerra?columns,andavarietyofdetectors,includingMicromassZQ?andQuattromicro?massdetectors----

高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。高效液相色譜法與氣相色譜法

氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，一般僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分的作用。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。1.2特點與經(jīng)典液相色譜法比較分離性能好分析速度快靈敏度高色譜柱可反復(fù)使用與氣相色譜比較適用范圍廣流動相可選擇范圍寬流出組分容易收集相對安全(不使用高壓氣體、溫度低)總之高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點。1.3發(fā)展歷史古羅馬時期分析染料與色素。1850年德國化學(xué)家Runge的改進(jìn)，發(fā)展成紙色譜。1903年俄國植物學(xué)家Tsweet在華沙生物學(xué)會議上發(fā)表論文（分離植物色素）20多年后，Kuhn和Lederer用于從蛋黃中分離植物葉黃素，證實方法可行。色譜引起注意

液固色譜瑞典Tiselius（諾貝爾獎）和Claesson30年代薄層色譜法1.4分類高效液相色譜法發(fā)展迅猛，新方法相繼涌現(xiàn)，可以簡單地分類如下：按固定相的聚集狀態(tài)分：液液色譜、液固色譜按分離機制分：分配色譜、吸附色譜、離子交換、分子排阻、親合色譜、化學(xué)鍵合相色譜及膠束色譜法等1.5高效液相色譜儀簡介高效液相色譜儀一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)此外，還配有輔助裝置：如梯度淋洗自動進(jìn)樣數(shù)據(jù)處理等1.5.2進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)，常用六通閥進(jìn)樣。有時用自動進(jìn)樣裝置1.5.3分離系統(tǒng)——色譜柱

心臟部件，包括柱管與固定相柱管常用不銹鋼金屬管一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為2～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前有一個預(yù)柱，預(yù)柱內(nèi)填充物和分離柱盡可能完全一樣有時包括柱恒溫裝置1.5.4．檢測系統(tǒng)

選擇性檢測器紫外熒光電化學(xué)檢測器等通用型檢測器示差折光電導(dǎo)檢測器等

1.5.5附屬系統(tǒng)

包括脫氣梯度淋洗柱恒溫自動進(jìn)樣餾分收集數(shù)據(jù)處理等2.基本理論，分離的控制與GC一樣，樣品組分在固定相與流動相之間的吸附與分配平衡的差異產(chǎn)生分離，這是一個負(fù)熵過程。而同時存在的熵增過程--區(qū)帶自發(fā)擴(kuò)散使組分混合。色譜學(xué)理論區(qū)帶在色譜柱中的展寬（色譜過程動力學(xué)）色譜保留值變化的規(guī)律（色譜過程熱力學(xué)）色譜分離條件的選擇與優(yōu)化

(3)其它理論平衡色譜理論（塔板理論之前，Langemur）縱向擴(kuò)散理論（速率理論之前）塊狀液膜模型計量置換模型非平衡色譜理論等等(2)保留的理論基礎(chǔ)平衡常數(shù)K=組分在固定相中的濃度/組分在流動相中的濃度=βk’β=色譜柱內(nèi)流動相所占體積/固定相所占體積

k’=K/β直接與組分的熱力學(xué)常數(shù)和分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與固定相、流動相的性質(zhì)有關(guān)(3)溶劑強度（強弱）還與組分性質(zhì)有關(guān)！！

反相液相色譜甲醇、乙腈、四氫呋喃、水正相液相色譜（相反）水、甲醇、丙酮、氯仿、苯、己烷

溶劑的強度和極性溶劑的選擇性Snyder以溶劑和樣品分子之間的作用力作為溶劑選擇性的依據(jù)，根據(jù)溶劑行為的相似性將其分成8組處于同一組的溶劑，分離中有相似的選擇性；而處于不同組的溶劑，其選擇性差別較大正相色譜中，固定相是極性的，所以增加極性參數(shù)P’，洗脫能力增加反相色譜中，固定相是非極性的，所以增加極性參數(shù)P’，洗脫能力降低(4)保留值與流動相組成液固色譜中，k’對溫度的變化不如氣相色譜敏感，通常不考慮。因此，在流動相線速確定后，影響分離效果合分離時間的主要因素就是流動相組成。通過統(tǒng)計熱力學(xué)的方法可以導(dǎo)出在二元流動相體系中組分容量因子k’與強溶劑的濃度CB之間存在如下關(guān)系：lnk’=a+blnCB+cCB在包含強溶劑B1、B2的三元流動相體系中l(wèi)nk’=a+b1lnCB1+c1CB1+b2lnCB2+c2CB2式中a,b,c都可近似地視為常數(shù)。2.3色譜分離條件的選擇----混合物的分離

(1)優(yōu)化參數(shù)和優(yōu)化指標(biāo)

優(yōu)化色譜參數(shù)：選擇合適的檢測器、分離模式、色譜柱、流動相組成等在高效液相色譜中實際上主要是流動相組成，包括流動相中各種有機溶劑的濃度、緩沖液的種類、濃度和pH、添加劑的種類和濃度等。優(yōu)化指標(biāo)：分離度、選擇性、總分離效能指標(biāo)、各種色譜響應(yīng)函數(shù)和色譜優(yōu)化函數(shù)(2)液相色譜流動相組成優(yōu)化方法a計算化學(xué)的方法（數(shù)學(xué)優(yōu)選法）三角形法（主要是四面體法）圖解法（窗口圖形法、重疊分辨率圖法等）直接法（單純形法、復(fù)合形法、重復(fù)設(shè)計法等）

b

基于色譜理論的方法保留值預(yù)測譜圖模擬3儀器系統(tǒng)與色譜柱高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：

首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

3.1高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由

儲液罐高壓輸液泵過濾器壓力脈動阻力器等組成，(1)輸液系統(tǒng)與流動相A流動相、脫氣及貯液裝置

溶劑基本要求：不損害柱的穩(wěn)定性（液固吸附色譜中的含水溶劑會改變活性，使用鍵合硅膠固定相時，流動相的pH應(yīng)在2-8之間）；有足夠的純度（防止柱被污染，提高檢測靈敏度）；與檢測器匹配（區(qū)別流動相與樣品，提高檢測靈敏度）；對樣品有一定的溶解能力（防止樣品沉積的柱頭上）；制備色譜中要有利于樣品的回收（易于蒸發(fā)除去，堿性氧化鋁柱不用丙酮，避免羥醛縮合）溶劑過濾原因：防止磨損柱塞泵的單向閥和密封圈（影響精度、漏液），防止堵塞管道和不銹鋼燒結(jié)片。方法：通常用直徑0.45或0.22um的微孔濾膜過濾，注意不同濾膜對不同溶劑的適用性。

溶劑脫氣原因：在泵中產(chǎn)生氣泡使流速不穩(wěn)，增加檢測器噪音、降低響應(yīng)以至信號消失。（在出口處由于液體壓力減小，溶解的氣體以氣泡的形式逸出，影響檢測器的工作，形成無規(guī)律的假峰）。溶解氧可使紫外檢測器基線增高，低波長檢測時信號被抵消掉；在熒光檢測器中會使熒光淬滅，降低靈敏度；在還原型的電化學(xué)檢測器中，也不能存在氧；另外，還可能使鍵合相硅膠的鍵合鏈斷裂。溶劑脫氣方法：1.氦脫氣，氦氣在流動相中的溶解度極低，緩慢通過流動相可以趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，10分鐘內(nèi)可以除去溶入氣體的80-90%，而且連續(xù)不斷的通入可以防止空氣的再溶入和反擴(kuò)散。通常開始大流速（>30ml/min），而后維持4ml/min。2.真空脫氣。貯液器被抽真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡逸出，效果僅次于氦脫氣?？梢耘c抽濾聯(lián)用，但效果差些。3.超聲脫氣，只能除去30%的氣體，用于過飽和溶液效果好些，可與真空脫氣聯(lián)用。4.加熱回流脫氣。最有效的脫氣方法，不適于混合流動相。5.聯(lián)機脫氣方法。流動相通過有微孔的特制塑料管路，它只允許溶解在溶劑中的氣體從管壁中滲出，而流動相只能在管內(nèi)通過，最終達(dá)到在線脫氣的目的。

貯液器一般為500-1000ml的玻璃或石英玻璃瓶。普通溶劑瓶應(yīng)不定期廢棄。專用儲液器也要定期清洗，以防止污染。

B高壓泵基本要求：輸出流量穩(wěn)定(基本無脈沖，精度和重復(fù)性優(yōu)于0.3%)；密封性好流量可調(diào)范圍寬（分析型一般0.1-10ml/min）；輸出壓力高（最高應(yīng)達(dá)40-50MPa）；壓力平穩(wěn)死體積小有利于洗脫液更換（一般十幾到幾十微升）；耐腐蝕。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。HPLC主要使用恒流泵恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒流泵，又分注射泵、往復(fù)泵和隔膜泵幾種，應(yīng)用最多的是往復(fù)泵。恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，目前主要用于色譜柱裝填。常用高壓泵a.往復(fù)式柱塞泵b.柱塞隔膜泵c.氣動放大泵a.往復(fù)式柱塞泵泵原理、結(jié)構(gòu)，單向閥，泵密封墊圈。

串聯(lián)泵與并聯(lián)泵

減少脈沖串聯(lián)泵，柱塞不同并聯(lián)泵多一對單向閥b.柱塞隔膜泵 HP1090c.氣動放大泵 以高壓氣源為動力，屬于恒壓泵。目前主要用于裝柱C梯度洗脫裝置改善復(fù)雜混合物（寬k’）的分離，縮短分析時間，提高靈敏度。通常流動相洗脫強度由弱到強。不使用通用型檢測器（如示差折光檢測器）。要求：混合器容積小、無死區(qū)、清洗方便、混合效率高，以提高重現(xiàn)性，減小滯后。可以分為兩種：

高壓梯度

低壓梯度高壓梯度：高壓混合，精度高，易于自動控制，不易產(chǎn)生氣泡，脫氣要求低，多臺高壓泵通過控制各泵的流量來形成洗脫液的梯度，成本高低壓梯度：通常用電磁閥控制各溶劑的開關(guān)比例形成洗脫液梯度。低壓混合，適用性強，成本低，避免了洗脫液混合時體積變化引起的流量變化；混合前后需要脫氣D輔助設(shè)備過濾器“沉子”和管路過濾器，不銹鋼燒結(jié)濾器，孔徑2-10uL。

脈動阻尼器減少脈動，內(nèi)徑0.2-0.5mm不銹鋼細(xì)蛇形管流動型結(jié)構(gòu)優(yōu)選（易于清洗、更換流動相），封頭型死體積小壓力測量裝置阻尼器出口并聯(lián)壓力傳感器（壓敏半導(dǎo)體元件）測壓，電表指示壓力，過壓保護(hù)保證泵的安全3.2進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外效應(yīng)較突出。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

進(jìn)樣方法

A注射器進(jìn)樣

B閥進(jìn)樣

C自動進(jìn)樣

D進(jìn)樣技術(shù)對峰擴(kuò)展的影響A注射器進(jìn)樣裝置壓力小于10MPa時用，采用雙層隔膜和雙隔板進(jìn)樣口，微量注射器直接進(jìn)樣，受進(jìn)樣技術(shù)影響大。不常用。

B閥進(jìn)樣裝置常用。由高壓六通閥和固定體積的定量管（1-1000ul）組成?？梢杂啥抗芎臀⒘窟M(jìn)樣器來選擇進(jìn)樣體積。優(yōu)點：進(jìn)樣量可變范圍大，分析制備通用；重復(fù)性好；可直接高壓進(jìn)樣，不需停流；易于自動化。缺點：死體積稍大，價格高。C自動進(jìn)樣裝置自動控制，儀器化操作一般可放置100多個樣品。軟件操作。價格高。D進(jìn)樣技術(shù)對峰擴(kuò)展的影響進(jìn)樣體積過大會使柱效下降，峰變寬。注意控制樣品濃度不要太大。防止固定相超負(fù)荷。一般認(rèn)為樣品濃度對譜峰擴(kuò)展的影響比樣品體積更為重要。4.3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離柱前有一個預(yù)柱，預(yù)柱內(nèi)填充物和分離柱通常一樣，這樣可以使樣品或流動相中存在的強保留組分被預(yù)柱“吸附”，保證分離柱的性能不受影響。柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。色譜柱A液相色譜填料填料之間存在差異，甚至同一廠商生產(chǎn)的同一種填料因批號不同也會有差異。因此只有相當(dāng)?shù)闹盍希瑳]有相同的柱填料。這與基質(zhì)、鍵合、填裝過程都有關(guān)系。多數(shù)柱填料基質(zhì)采用多孔微粒硅膠，通常有球形和無定形兩種。具有不同的粒度、孔徑和表面積。一般HPLC使用小顆粒球形硅膠，具有分離速度快、阻力大的特點。粒徑一般3-10微米，孔徑6-10nm。而用的最多的是5微米粒度，孔徑8-10nm。用于蛋白質(zhì)分離的大孔硅膠孔徑為30nm。多孔聚合物微球可以使用寬的pH范圍。不同液相色譜法使用的填料將在下一節(jié)課中討論，B柱材料、形狀，柱管清洗柱管為不銹鋼管，內(nèi)壁有很高的光潔度（優(yōu)于8），不能有軸向溝槽。尺寸：分析柱：內(nèi)徑2-4.6mm，長度10-25厘米半制備柱：5-10