微生物資源與微生物新藥發(fā)現(xiàn)

第一節(jié)稀有放線菌是產(chǎn)生微生物新藥的重要源泉第二節(jié)黏細菌是一類值得關(guān)注的微生物新資源第三節(jié)從植物內(nèi)生菌中篩選微生物新藥第四節(jié)從海洋微生物中篩選微生物新藥當前1頁，總共78頁。第一節(jié)稀有放線菌是產(chǎn)生微生物新藥的重要源泉所謂的稀有放線菌（rareactinomycetes)即為除鏈霉菌屬外的其它屬的放線菌。當前2頁，總共78頁。稀有放線菌是產(chǎn)生微生物

新藥的重要源泉到1974年止，放線菌來源的抗生素幾乎都是由鏈霉菌屬產(chǎn)生的（約占2000種抗生素中的95%）。但在隨后6年的報導(dǎo)中，由放線菌產(chǎn)生的僅占25%。事實證明，稀有放線菌是發(fā)現(xiàn)新抗生素的極好來源，且它們產(chǎn)生各種不同抗生素的能力不亞于鏈霉菌屬。同樣，細菌和霉菌也仍是產(chǎn)生新的生理活性物質(zhì)的源泉，特別是近年來從霉菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的生理活性物質(zhì)的數(shù)目正在不斷增加。當前3頁，總共78頁。當前4頁，總共78頁。當前5頁，總共78頁。小單孢菌能產(chǎn)生獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)能產(chǎn)生獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)。近年來從小單孢菌中發(fā)現(xiàn)了引人注目的結(jié)構(gòu)新穎的烯二炔類抗腫瘤抗生素calicheamicinγ1（結(jié)構(gòu)如圖所示），由棘孢小單孢菌Ｍ.echinosporaspcalichensis所產(chǎn)生，與腫瘤細胞作用時,當前6頁，總共78頁。Calicheamicinγ1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

當前7頁，總共78頁。小單孢菌能產(chǎn)生獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)碳黑小單孢菌Ｍ.carbonacea產(chǎn)生強效的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的寡糖類抗生素ziracin(如圖3－所示)。它對甲氧西林和萬古霉素耐藥菌作用很強。對甲氧西林敏感和耐藥的肺炎鏈球菌的ＭＩＣ為0．032～0．125μｇ/ｍｌ，對青霉素Ｇ耐藥菌的ＭＩＣ為0．125～8μｇ/ｍｌ，對萬古霉素敏感和耐藥菌的ＭＩＣ為0．45～2μｇ/ｍｌ。ＥＤ50為2．5ｍｇ/ｋｇ。靜注劑量1ｍｇ/ｋｇ的血濃度為10μｇ/ｍｌ。雖已進入Ⅲ期臨床試驗，但沒有獲得ＦＤＡ批準。除產(chǎn)生抗生素外，小單孢菌還產(chǎn)生許多非抗生素的生物活性物質(zhì)。

當前8頁，總共78頁。Ziracin的化學(xué)結(jié)構(gòu)

當前9頁，總共78頁。游動放線菌(Actinoplanesp.)ATCC3076產(chǎn)生的抗細菌抗生素雷莫拉寧。

當前10頁，總共78頁。黏細菌

一類值得關(guān)注的微生物新資源Epothilons是由粘細菌纖維束菌(Sorangiumcellosum)產(chǎn)生的新型細胞毒化合物。它是一種新的16元環(huán)多酮大環(huán)內(nèi)酯,含有一個噻唑基和環(huán)上的一個環(huán)氧結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)如圖所示)。該菌產(chǎn)生Ａ和Ｂ兩種主要組分、Ｃ～Ｆ四種次要組分以及36種極微量成分。當前11頁，總共78頁。Epothilons的化學(xué)結(jié)構(gòu)

當前12頁，總共78頁。從植物內(nèi)生菌中篩選微生物新藥

要利用植物內(nèi)生菌這一資源豐富的寶庫，首先要將內(nèi)生菌從植物中有效地分離出來，然后應(yīng)用分離色譜層析等生物分析方法從內(nèi)生菌培養(yǎng)物濾液中分離并鑒定出令人感興趣的生物活性物質(zhì)，如：紫杉醇、cryptocin、oocyclin、isopestacin、pseudomycin和ambuicacid等。本文主要闡述了植物內(nèi)生菌分離的一般規(guī)則，其生物活性代謝產(chǎn)物的最新研究進展，以期讀者對植物內(nèi)生菌的重要性有更深刻的認識。當前13頁，總共78頁。

天然藥物的篩選已成為現(xiàn)今的一個研究熱點，植物是天然藥物的主要來源之一。生活在植物組織中的植物內(nèi)生菌，由于其與植物的關(guān)系密切，同時其產(chǎn)生的豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，因此從中發(fā)現(xiàn)新的有意義的化合物的潛力相當大，其作為新的治療藥物或前體藥物的潛在來源已經(jīng)引起人們的廣泛重視。當前14頁，總共78頁。一、歷史概況1898年Vogl從黑麥草的種子中首次分離出第一株內(nèi)生真菌。但在此后的70年間，內(nèi)生菌的研究進展緩慢；直到70年代，Bacon等人發(fā)現(xiàn)高羊茅中的內(nèi)生真菌和毒素的產(chǎn)生有關(guān)，從此以后植物內(nèi)生菌的研究在國際范圍內(nèi)引起了廣泛的重視。當前15頁，總共78頁。二、植物內(nèi)生菌當前16頁，總共78頁。目前較常用的寬泛實用性概念：

植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌和細菌，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織學(xué)方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生。即我們可以把植物內(nèi)生菌理解為植物組織內(nèi)的正常菌群，它們不僅包括了互惠共利的和中性的內(nèi)共生微生物，也包括了那些潛伏的宿主體內(nèi)的病原微生物。當前17頁，總共78頁。三、植物內(nèi)生菌的生物多樣性宿主植物種類多樣性內(nèi)生菌自身種類多樣性內(nèi)生菌在植物組織中分布多樣性當前18頁，總共78頁。內(nèi)生菌普遍存在于目前已研究過的各種陸生及水生植物中。目前全世界至少已在80個屬290多種禾本科植物中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌。自20世紀70年代后期，內(nèi)生菌在一些重要的經(jīng)濟林木如針葉類的各種冷杉、云衫、紅杉、紫杉、松柏等以及闊葉的桉樹、櫟樹、樺樹、榿木等植物樹皮、枝葉中相繼被發(fā)現(xiàn)并得到了廣泛的研究。進而在多種灌木、草本植物以及栽培作物、果樹甚至藻類、苔蘚和蕨類植物中也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。當前19頁，總共78頁。對于一種植物而言，從中可分離到的內(nèi)生真菌和細菌通常為數(shù)種至數(shù)十種，有的甚至多達數(shù)百種。在熱帶雨林植物中，內(nèi)生菌的多樣性更為突出。例如：Anorld等人最近分析了巴拿馬中部雨林中兩種植物葉子中的內(nèi)生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離自83片健康葉子上的內(nèi)生菌可多達418個形態(tài)學(xué)種當前20頁，總共78頁。主要內(nèi)生真菌子囊孢子類：核菌綱盤菌綱腔菌綱廣泛分布的種屬：半殼霉屬擬隱孢霉屬擬莖點霉屬葉點霉屬當前21頁，總共78頁。常見內(nèi)生細菌大多數(shù)為土壤微生物類群：假單孢菌屬芽孢桿菌屬腸桿菌屬土壤桿菌屬當前22頁，總共78頁。內(nèi)生真菌的菌絲生長于植物組織的細胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根。其中葉鞘和種子的菌絲含量最多而葉片和根的含量極微。當前23頁，總共78頁。四、植物內(nèi)生菌的作用促進宿主植物的生長增強宿主植物的抗逆性產(chǎn)生具有生理活性的代謝產(chǎn)物當前24頁，總共78頁。

內(nèi)生菌能產(chǎn)生IAA等植物生長激素內(nèi)生菌增強宿主植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收如：禾本科農(nóng)作物上的內(nèi)生細菌具有很強的固氮能力。感染內(nèi)生真菌的牧草對氮、磷的攝取能力也有所提高。

當前25頁，總共78頁。

感染內(nèi)生菌的宿主植物對環(huán)境具有很強的抗逆性，如抗干旱、抗病原細菌和真菌、抗線蟲、阻抑昆蟲和食草動物的采食等。當前26頁，總共78頁。

在內(nèi)生菌中，有對宿主植物體內(nèi)某些活性成分的形成有重要影響者，也有產(chǎn)生和宿主植物相同或相似的生理活性成分。當前27頁，總共78頁。五、植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)抗生素類物質(zhì)抗腫瘤活性物質(zhì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)殺昆蟲物質(zhì)其他類型的活性產(chǎn)物當前28頁，總共78頁。1.抗生素類物質(zhì)隨著細菌耐藥性的出現(xiàn)激發(fā)了人們尋求更多更好的抗菌素；同時，由于艾滋病和器官移植引起的真菌感染人數(shù)不斷增加，對于高效抗真菌制劑的需求也不斷增強；加之目前治療原生動物寄生感染藥物的匱乏，尋找更新更有效的治療藥物來解決這些問題已迫在眉睫。以往，抗生素的主要來源是土壤微生物。而今，植物內(nèi)生菌這一多樣性十分豐富卻尚未開發(fā)的微生物類群看來是一巨大資源

當前29頁，總共78頁。刺盤孢屬內(nèi)生菌Colletotrichumgloeosporicoides產(chǎn)生的Colletotricacid抗微生物活性當前30頁，總共78頁。內(nèi)生菌Colletotrichumsp產(chǎn)生的6-isopenylindole-3-carboxylicacid3β,5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7,22-diene

3β,5α-dihydroxy-6β-phenylacety-loxy-ergosta-7,22-diene抗微生物活性，對人畜和植物病原真菌和細菌有良好抑制作用當前31頁，總共78頁。內(nèi)生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina產(chǎn)生的新型環(huán)肽抗生素cryptocandin對癬菌及白色念珠菌等人類病原真菌具有強烈抑殺作用其MIC與臨床應(yīng)用的抗真菌藥amphotericinB相當，具有良好開發(fā)前景當前32頁，總共78頁。內(nèi)生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina產(chǎn)生的酰胺類生物堿cryptocin對稻瘟病菌及其他多種植物病原真菌具有很強的抑殺作用當前33頁，總共78頁。內(nèi)生菌Cytonaemasp.產(chǎn)生的CytonicAcidA(1)

和CytonicAcidB(2)抑制人細胞肥大病毒組裝當前34頁，總共78頁。鐮孢霉屬內(nèi)生真菌Fusariumsp.CR377產(chǎn)生的一種新型的酮內(nèi)酯（pentaketide）化合物對白色念珠菌有較強活性當前35頁，總共78頁。內(nèi)生真菌FungusCR115產(chǎn)生的一個二萜化合物GuanacastepeneA對多種革蘭氏陽性和陰性細菌和白色念珠菌有活性當前36頁，總共78頁。內(nèi)生菌Geniculosporiumsp.產(chǎn)生的Geniculol(1)

和CytochalsinF(2)殺藻劑當前37頁，總共78頁。內(nèi)生真菌Pestalotiopsisjesteri產(chǎn)生的新的環(huán)己烯酮環(huán)氧化合物Jesterone對引起大多數(shù)植物致病的致病真菌有選擇性活性當前38頁，總共78頁。內(nèi)生菌Pestalotiopsismicrospora產(chǎn)生的Ambuicacid抗真菌劑當前39頁，總共78頁。內(nèi)生菌Phomasp.NRRL2

5697產(chǎn)生的5種新的化合物PginadecakubsA-D(1-4)&PginaoebtebibeA(5)具有抗革蘭氏陽性菌活性當前40頁，總共78頁。擬點霉屬內(nèi)生菌Phomopsissp.產(chǎn)生的PhomoxanthonesA(1)&B(2)是兩個新的氧雜蒽酮二聚體具有顯著的抗瘧疾和抗結(jié)核活性當前41頁，總共78頁。

分離自錫蘭桂小枝的內(nèi)生菌Muscodor，其所釋放的揮發(fā)性物質(zhì)（醇，酯，酮，酸和脂）對人及植物的致病真菌和細菌有很強的殺傷性。當前42頁，總共78頁。

分離自歐洲紫杉（Taxusbaccata）的內(nèi)生真菌Acremoniumsp.產(chǎn)生的白灰制菌素A具有抗真菌活性。當前43頁，總共78頁。

分離自歐洲杜松（Juniperuscommunis）的內(nèi)生真菌Hormonema，從其發(fā)酵液中分離出一種新的三萜糖苷對念珠菌屬和曲霉屬的真菌具有很強的活性

當前44頁，總共78頁。2.抗腫瘤活性物質(zhì)1）紫杉醇（Taxol）紫杉醇是一種以極低含量存在于各種紫杉屬植物樹皮和樹葉中的萜類化合物，臨床上是治療乳腺癌、子宮癌和卵巢癌的良效藥物，自1992年投入市場以來，取得了臨床療效和市場效應(yīng)的極大成功。當前45頁，總共78頁。Taxol當前46頁，總共78頁。

1993年美國學(xué)者Stierle等人首次從短葉紫杉（Taxusbrevifolia）的樹皮中分離出一株內(nèi)生的真菌新種Taxomycesandreanae，在培養(yǎng)液種能產(chǎn)生紫杉醇和其他紫杉烷類化合物。當前47頁，總共78頁。

至今已在短葉紫杉、喜馬拉雅紅豆衫、歐洲紅豆衫、南方紅豆衫、云南紅豆衫、落羽衫、榧樹中分離到了許多種能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌和放線菌。其中內(nèi)生真菌微孢擬盤多毛孢的紫杉醇產(chǎn)量已初步顯示出其商業(yè)潛力。當前48頁，總共78頁。HostplantsFungalentophytesFounderandyearTaxusbrevifoliaTaxomycesandreanaeStierleetal.,1993TaxuswallichianaPhomasp.Yangetal.,1994TaxustaxifoliaPestalotiopsismicrosporaLeeetal.,1995TaxuswallichianaPestalotiopsismicrosporaStrobeletal.,1996TaxodiumdistichumPestalotiopsismicrosporaLietal.,1996TaxusbrevifoliaPestalotiopsisspp.Pulicietal.,1997WolemianobilisPestalatiopsisguepiniStrobeletal.,1997TorreyagrandifoliaPericiniasp.Lietal.,1998TaxuswallachiaraSeimatoantleriumtepuienseBashyaletal.,1999TaxusmaireiTuberculariasp.Wangetal.,2000TaxuswallichianaSporormiaminimaTrichotheciumsp.Shresthaetal.,2001一些能夠產(chǎn)生紫杉醇類物質(zhì)的植物內(nèi)生菌及其植物宿主

當前49頁，總共78頁。這些發(fā)現(xiàn)為人類突破植物資源周期長、不可再生等限制，利用植物內(nèi)生菌來工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)重要植物藥物提供了新的思路。當前50頁，總共78頁。2）ras－法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制物

抑制法呢基－蛋白轉(zhuǎn)移酶（FPTase）或ras－法呢基轉(zhuǎn)移酶的化合物往往具有抗腫瘤活性。

當前51頁，總共78頁。A.LinghamRB等曾報道毛殼屬內(nèi)生真菌Chaetomellaacutisea產(chǎn)生的長鏈脂肪酸ChaetomellicacidA和B以及從一種小檗葉的某種內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物oreganicacid可選擇性抑制法尼基－蛋白轉(zhuǎn)移酶（FPTase），具有抗癌活性。當前52頁，總共78頁。B.IshiiT等報道，從Phomasp.中分離得到的一種生物堿TAN－1813可抑制鼠腦ras－法尼基轉(zhuǎn)移酶，對各種人體腫瘤細胞的增殖也有抑制作用，并可引起NIH3T3/k－ras細胞形態(tài)的改變。

此外，內(nèi)生菌Coniothyriumsp.產(chǎn)生的醌類化合物對ras－法呢基轉(zhuǎn)移酶也具有很高的抑制活性。當前53頁，總共78頁。3）植物黃酮類物質(zhì)植物中的一些黃酮類物質(zhì)，如香豆素，異香豆素等，具有綜合的抗癌活性，在分離自加拿大Cirsiumarvense的一個內(nèi)生真菌Myceliasterila的發(fā)酵液提取物中發(fā)現(xiàn)了新的異香豆素。從中國南海紅樹嫩葉分離出來的內(nèi)生真菌No.2533，其發(fā)酵液提取物分離出2種新的異香豆素類化合物enalinA和B，均具有抗癌活性。當前54頁，總共78頁。4）生物堿類

從來源于傳統(tǒng)藥用植物雷公藤的內(nèi)生真菌Rhinocladiellasp.

中發(fā)現(xiàn)了三種新生物堿，實驗結(jié)果表明它們對多種人腫瘤細胞有很強的抑制作用當前55頁，總共78頁。此外，從FicusmicrocarpaL的樹皮中分離到的一株未鑒定的內(nèi)生菌的發(fā)酵液中分離到一種新的生物堿nomofungin，該化合物能干擾培養(yǎng)的哺乳類細胞微絲并且對于LoVo和KB細胞有輕微的毒性，是一種新型的微絲干擾劑當前56頁，總共78頁。5）其它BradySE等通過BIA法從一株內(nèi)生真菌分離到具有抗癌活性的二蒽醌類化合物cytoskyrinA。HuangY等也使用MTT法從三種藥用植物中篩選具有抗癌活性的植物內(nèi)生真菌。這些結(jié)果表明植物內(nèi)生真菌是新的抗癌藥物或前體的重要來源。當前57頁，總共78頁。已有多篇文章報道內(nèi)生真菌可產(chǎn)生植物生長激素物質(zhì)如：Mcinroy等人從玉米、棉花上分離到具有促進植物生長的內(nèi)生細菌。從柑橘屬果樹中分離出來的Penicillium.Italicum也能產(chǎn)赤霉素（GA）。

在對5種從藥用植物中分離到的內(nèi)生菌進行研究時發(fā)現(xiàn)，它們各自的發(fā)酵液中都含有至少一種植物激素：GA，IAA，ABS（Abscisicacid），Z（Zeatin），ZR（Zeatinriboside）,這些由內(nèi)生真菌產(chǎn)生的植物激素是揭示內(nèi)生真菌促進藥用植物生長機制的重要物質(zhì)當前58頁，總共78頁。禾本科植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生4大類即：有機胺類（peramine）吡咯里西啶類（loline）吲哚二萜衍生物類（lolitremB）麥角堿類（ergovaline）多達十種的生物堿，這些生物堿具有抗病原菌，抗線蟲，增強植物他感作用等多種生物學(xué)活性，其中大多數(shù)對食草昆蟲乃至哺乳動物（牛、羊）具較強的毒性。當前59頁，總共78頁。從內(nèi)生菌感染的一種草熟禾中分離到數(shù)個對蚊子幼蟲有毒性的黃酮類化合物。從云杉等針葉樹的內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中，F(xiàn)indlay等人發(fā)現(xiàn)了一系列具抗蟲活性的物質(zhì)。當前60頁，總共78頁。

雷公藤的內(nèi)生真菌Fusariumsubglutinans產(chǎn)生的2中二萜化合物subgutinolA和B具有無細胞毒性的免疫抑制作用subgutinolA當前61頁，總共78頁。六、前景從各個層次上深入探討內(nèi)生菌－寄主之間的相互作用，將有助于了解內(nèi)生菌的生物學(xué)本質(zhì)以及未知生態(tài)學(xué)作用從傳統(tǒng)藥用植物以及一下特殊環(huán)境中植物的內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中尋找新型活性物質(zhì)，將繼續(xù)是內(nèi)生菌研究的主流分子生物學(xué)手段將在內(nèi)生菌研究的各個方面發(fā)揮重要作用當前62頁，總共78頁。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應(yīng)用潛力，是個潛力巨大，尚待開發(fā)的微生物新資源。當前63頁，總共78頁。第四節(jié)

從海洋微生物中篩選微生物新藥一、研究背景和現(xiàn)狀二、海洋微生物的生活習(xí)性及其多樣性三、海洋微生物活性成分的研究及藥物的開發(fā)四、海洋微生物藥物研究展望當前64頁，總共78頁。一、研究背景和現(xiàn)狀陸棲微生物的代謝產(chǎn)物，已成為像抗生素這樣生物活性物質(zhì)的源泉。根據(jù)下列的理由，深信海洋微生物的代謝產(chǎn)物，也是希望之所在。當前65頁，總共78頁。一、研究背景和現(xiàn)狀(1)自然界里，微生物的種類和數(shù)量是明顯地隨著環(huán)境不同而改變。(2)微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，會受所使用的培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)。(3)已經(jīng)知道許許多多生物活性物質(zhì)是通過次級代謝而產(chǎn)生的，也因此將同時產(chǎn)生小量其他的相關(guān)物質(zhì)。如果引進更敏感的測定方法來檢測；更有效的的分離方法來純化；更精密的方法來分析，將能得到新生物活性化合物，即使其在發(fā)酵液里含量甚少。當前66頁，總共78頁。一、研究背景和現(xiàn)狀(4)已經(jīng)知道大多數(shù)生物活性化合物的產(chǎn)生是菌株特異的，而不是分類學(xué)上種屬特異的。因此，可以直接培養(yǎng)分離到的菌株以取得新生物活性化合物，而無須先進行菌株分類。

(5)要成功地發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)，用于分離微生物菌株的樣品的采集是一個重要環(huán)節(jié)。近來，樣品采集的設(shè)計已為發(fā)現(xiàn)新生物活性化合物作出了重大貢獻。最近，已實