浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞系的建立和鑒定培養(yǎng)物的固定、染色顯微鏡觀察當(dāng)前1頁(yè)，總共88頁(yè)。1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的運(yùn)輸當(dāng)前2頁(yè)，總共88頁(yè)。1.1細(xì)胞的原代培養(yǎng)是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、細(xì)胞的衰老、死亡等生命現(xiàn)象。幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)當(dāng)前3頁(yè)，總共88頁(yè)。意義原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來(lái)組織的特性。利用原代培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)（藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面）效果很好。原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必須經(jīng)過(guò)的階段。當(dāng)前4頁(yè)，總共88頁(yè)。掌握無(wú)菌操作技術(shù)了解小鼠解剖操作技術(shù)了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散了解倒置顯微鏡的使用原代細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螽?dāng)前5頁(yè)，總共88頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕鼠或新生小鼠液體：細(xì)胞生長(zhǎng)液（內(nèi)含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡鹽溶液70%乙醇器材：滅菌鑷子、剪刀、滅菌培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、小瓶、燒杯、吸管、酒精燈當(dāng)前6頁(yè)，總共88頁(yè)。原代細(xì)胞培養(yǎng)方法胰酶消化法組織塊直接培養(yǎng)法冷消化溫消化一次性消化分次消化

消化法：采用無(wú)菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)前7頁(yè)，總共88頁(yè)。貼塊法消化法原代培養(yǎng)方法分類當(dāng)前8頁(yè)，總共88頁(yè)。分次消化

消化法的分類當(dāng)前9頁(yè)，總共88頁(yè)。外植塊培養(yǎng)步驟圖解當(dāng)前10頁(yè)，總共88頁(yè)。操作步驟1---取材用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應(yīng)剪去頭、爪），將胚胎放于無(wú)菌的含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中。漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續(xù)用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。當(dāng)前11頁(yè)，總共88頁(yè)。操作步驟2---切割將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)無(wú)菌小瓶中，用平衡鹽溶液漂洗。然后用眼科手術(shù)剪刀小心地絞碎胚胎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄上清。當(dāng)前12頁(yè)，總共88頁(yè)。當(dāng)前13頁(yè)，總共88頁(yè)。胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。加入3-5ml細(xì)胞生長(zhǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。靜置5-10min，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。1000rpm，離心5-10min，棄上清液。加入平衡鹽溶液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。加入細(xì)胞生長(zhǎng)液l-2ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。當(dāng)前14頁(yè)，總共88頁(yè)。胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養(yǎng)也可將此步驟簡(jiǎn)化為：視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次。靜置，吸去上清，用細(xì)胞生長(zhǎng)液漂洗消化后的組織塊，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使細(xì)胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。取細(xì)胞懸液接種至加了細(xì)胞生長(zhǎng)液的培養(yǎng)瓶中（調(diào)整細(xì)胞濃度到5×105/ml左右），37℃下培養(yǎng)。（注意：省略了離心、計(jì)數(shù)等步驟）當(dāng)前15頁(yè)，總共88頁(yè)。組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟

組織塊接種：將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附于瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將細(xì)胞生長(zhǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。37℃靜置3-5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入細(xì)胞生長(zhǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)前16頁(yè)，總共88頁(yè)。原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開(kāi)始生長(zhǎng)如接種的細(xì)胞密度適宜，5-7d即可形成單層當(dāng)前17頁(yè)，總共88頁(yè)。1.2傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增3-6次培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到新的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。當(dāng)前18頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶壁后，將上清培養(yǎng)液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2.半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（HeLa細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3.貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

采用酶消化法傳代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。當(dāng)前19頁(yè)，總共88頁(yè)。消化法傳代培養(yǎng)步驟當(dāng)前20頁(yè)，總共88頁(yè)。選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2-3

ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片(思考：還有什么作用？）加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。以1:2或1:3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法當(dāng)前21頁(yè)，總共88頁(yè)。傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果一般情況，傳代后的細(xì)胞在2h時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2-4d就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代當(dāng)前22頁(yè)，總共88頁(yè)。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻。轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1000rpm/min）5min。(區(qū)別貼壁傳代)在超凈工作臺(tái)中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細(xì)胞，制成懸液。以1:2或1:3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察。懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)前23頁(yè)，總共88頁(yè)。要預(yù)先與臨床外科醫(yī)生和護(hù)士商量，并做好一切必要的準(zhǔn)備工作。爭(zhēng)取拿到的標(biāo)本新鮮、無(wú)菌、少壞死等。聯(lián)系好手術(shù)時(shí)間后，立即做好如下準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備1-2個(gè)貯有培養(yǎng)液和抗生素的標(biāo)本收集瓶，將蓋蓋緊，保持無(wú)菌，瓶外貼上標(biāo)簽，寫上工作人員名字、地點(diǎn)和電話號(hào)碼；將收集瓶送往醫(yī)院，并與醫(yī)生和護(hù)士講清取手術(shù)標(biāo)本的部位及注意事項(xiàng)。1.3人體活檢(或手術(shù))材料當(dāng)前24頁(yè)，總共88頁(yè)。標(biāo)本放入收集瓶后，送出手術(shù)間，立即送往組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。工作人員最好是等在手術(shù)間外。但有時(shí)手術(shù)時(shí)間難以掌握。則請(qǐng)護(hù)士將收集材料的瓶子蓋好后，放入4℃冰箱，盡快打電話通知工作人員。取臨床標(biāo)本時(shí)，雖然盡可能做到無(wú)菌操作，但仍有污染可能性的存在?？蛇x用抗生素類控制污染。如手術(shù)標(biāo)本比較大（約200mg以上），可將其浸于70%酒精中約30-60秒，這樣會(huì)減少表面污染而不損壞內(nèi)部組織的結(jié)構(gòu)和存活。不要用紗布包裹標(biāo)本，紗布纖維易粘附在組織上。人體活檢(或手術(shù))材料當(dāng)前25頁(yè)，總共88頁(yè)。整個(gè)取材過(guò)程中，都要注意保持組織的濕潤(rùn)，隨時(shí)給組織塊滴加一些培養(yǎng)液或平衡鹽溶液。一般情況下，最好是使用冰冷的液體。在剪碎或切割組織塊時(shí)，盡量使用鋒利的刀剪，防止以鈍器對(duì)組織揉、捻、撕拉等而造成細(xì)胞損傷。整個(gè)取材過(guò)程耗時(shí)越短越好。在萬(wàn)不得已的情況下，取材后也可將組織貯存在冷的(4

℃)含平衡鹽溶液(或其它緩沖鹽溶液)的營(yíng)養(yǎng)液中，最好不超過(guò)24-48

h(視不同組織類型而定)。需要注意的事項(xiàng)當(dāng)前26頁(yè)，總共88頁(yè)。1.4培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。方法：細(xì)胞計(jì)數(shù)法臺(tái)盼藍(lán)染色法生長(zhǎng)曲線法

四唑鹽（MTT）比色法

當(dāng)前27頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)是目前采用的最普遍的方法。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)器血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。當(dāng)前28頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。存活測(cè)試為利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。當(dāng)前29頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)具體操作：

1.將計(jì)數(shù)板及蓋片用75%酒精擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。

2.吸取少許混合均勻的細(xì)胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)注意：鏡下偶見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液當(dāng)前30頁(yè)，總共88頁(yè)。由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。而活細(xì)胞反之，能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細(xì)胞對(duì)染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開(kāi)兩種細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（約2min）。臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法當(dāng)前31頁(yè)，總共88頁(yè)。①將1滴細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞可經(jīng)0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液)與2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。②2min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。計(jì)算活細(xì)胞百分比?；铙w染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)當(dāng)前32頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(cellgrowthcurve)是觀測(cè)細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞增殖速度，確定細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或具體實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間。它以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。當(dāng)前33頁(yè)，總共88頁(yè)。1)培養(yǎng)細(xì)胞首先在2４孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞。計(jì)數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。接種時(shí)間記為0h。2)計(jì)數(shù)細(xì)胞密度從接種時(shí)間算起，每隔24

h計(jì)數(shù)３孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。為提高準(zhǔn)確率，對(duì)每孔細(xì)胞可計(jì)數(shù)2-3次。如此操作至第七天結(jié)束。

3)繪制曲線

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度

為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙

上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)

曲線。當(dāng)前34頁(yè)，總共88頁(yè)。四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm值。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。四唑鹽（MTT）比色法當(dāng)前35頁(yè)，總共88頁(yè)。操作步驟四唑鹽（MTT）比色法100L單細(xì)胞懸液接種于96孔板(5×104)。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570nm）。記錄結(jié)果。高濃度血清可影響光吸收值，在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養(yǎng)液。吸去培養(yǎng)液時(shí)動(dòng)作要慢,以免吸去形成的結(jié)晶。當(dāng)前36頁(yè)，總共88頁(yè)。1.5細(xì)胞凍存和復(fù)蘇Spallanzani(1776)最早發(fā)表了“冷”處理對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道。1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。Polge等人(1949)發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存細(xì)胞的保護(hù)作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細(xì)胞損傷的主要原因。Lovelock等人(1959)發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。當(dāng)前低溫液氮凍存貯存細(xì)胞已是細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。當(dāng)前37頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞凍存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的降溫速率降至零下某一溫度(<-70℃)，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。復(fù)蘇(thawing)：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過(guò)程。當(dāng)前38頁(yè)，總共88頁(yè)。影響冷凍效果的因素1.冷凍速率細(xì)胞冷至-5~-15℃之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)

-冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰，但脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，甚至使細(xì)胞失去活性；

-冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠的時(shí)間外滲，隨著溫度的下降會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞。當(dāng)前39頁(yè)，總共88頁(yè)。影響冷凍效果的因素2.冷凍保存溫度液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。

-70～-80

℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降。3.復(fù)溫速率

是在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度一般復(fù)溫速度越快越好1-2min內(nèi)從-196℃升溫至37℃（水浴鍋）。當(dāng)前40頁(yè)，總共88頁(yè)。4.

冷凍保護(hù)劑

可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。

滲透性：甘油、DMSO非滲透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇影響冷凍效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷。當(dāng)前41頁(yè)，總共88頁(yè)。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮(-196C)中簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1-2℃的速度，在40min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜，次晨投人液氮中。傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃1h→-20℃1h→-80℃16-18h(或隔夜)→液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存當(dāng)前42頁(yè)，總共88頁(yè)。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是二甲基亞楓（DMSO），它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，在4℃時(shí)，其毒副作用大為減弱，凍存時(shí)DMSO平衡應(yīng)在4℃下進(jìn)行。當(dāng)前43頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液

-10％DMSO＋細(xì)胞生長(zhǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1-5×106cell/ml)加1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存當(dāng)前44頁(yè)，總共88頁(yè)。注意事項(xiàng)控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量不宜將凍存的細(xì)胞放置在-20℃過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，易引起低溫?fù)p傷凍存小管宜用塑料凍存管當(dāng)前45頁(yè)，總共88頁(yè)。保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1min內(nèi)（不要超過(guò)3min）全部融化解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，24h后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中當(dāng)前46頁(yè)，總共88頁(yè)。準(zhǔn)備水浴取凍存管，入水浴快速晃動(dòng)至完全融化去除DMSO4.加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)當(dāng)前47頁(yè)，總共88頁(yè)。注意事項(xiàng)盡快使細(xì)胞恢復(fù)到常溫盡快離心棄去冷凍保護(hù)液，防止對(duì)細(xì)胞的毒害當(dāng)前48頁(yè)，總共88頁(yè)。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融冷到零度以下，細(xì)胞可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。當(dāng)前49頁(yè)，總共88頁(yè)。1.6細(xì)胞的運(yùn)輸由于培養(yǎng)細(xì)胞株(系)的商品化，細(xì)胞培養(yǎng)室之間的交流、交換和購(gòu)買已成為生命科學(xué)研究中的一個(gè)重要組成部分，培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸成為研究工作的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。如果不了解所要細(xì)胞的性狀、培養(yǎng)液特點(diǎn)及培養(yǎng)注意事項(xiàng)，運(yùn)輸時(shí)不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，或出現(xiàn)差錯(cuò)，或?qū)е屡囵B(yǎng)失敗等。裝運(yùn)細(xì)胞的主要方法如下：冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸充液法當(dāng)前50頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞的運(yùn)輸---冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運(yùn)輸方法。保存效果較好，但缺點(diǎn)是比較麻煩，不宜長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，多需空運(yùn)，代價(jià)較大。

當(dāng)前51頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞的運(yùn)輸---充液法一般選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，以生長(zhǎng)1/3～1/2瓶底壁為宜，去掉舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新的培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，并用膠帶密封，放在一運(yùn)送盒內(nèi)，用棉花等做防震防壓處理。運(yùn)輸時(shí)間需4-5d，一般放在貼身口袋即可，到達(dá)目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，只需保留維持生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)液置37℃培養(yǎng)，次日傳代。如果在市內(nèi)運(yùn)輸或僅需數(shù)小時(shí)運(yùn)輸路程，也可將細(xì)胞附著面朝上，或把培養(yǎng)液全部倒掉放在胸部口袋運(yùn)送?？扛街诩?xì)胞表面的培養(yǎng)液，可使細(xì)胞短時(shí)間不受損。

當(dāng)前52頁(yè)，總共88頁(yè)。2、細(xì)胞系的建立正常細(xì)胞系癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系細(xì)胞克隆當(dāng)前53頁(yè)，總共88頁(yè)。正常細(xì)胞系建立的程序：原代培養(yǎng)第一次傳代常規(guī)傳代凍存和復(fù)蘇當(dāng)前54頁(yè)，總共88頁(yè)。癌細(xì)胞系建立的程序：步驟類似正常細(xì)胞系建立注意：取轉(zhuǎn)移灶組織癌細(xì)胞、癌最外層組織去除癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞--膠原酶法當(dāng)前55頁(yè)，總共88頁(yè)。細(xì)胞系的維持細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來(lái)源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等；傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉污染；要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。當(dāng)前56頁(yè)，總共88頁(yè)。證明細(xì)胞系的種系：人源、鼠源或其他，染色體分析、同工酶分析、DNA指紋技術(shù)明確細(xì)胞系的組織來(lái)源：檢測(cè)細(xì)胞抗原標(biāo)記的方法細(xì)胞是否是正常細(xì)胞，有無(wú)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化：正常細(xì)胞二倍體特征，惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞為異倍體細(xì)胞有無(wú)交叉污染：同工酶方法，DNA指紋技術(shù)也可以鑒定鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容當(dāng)前57頁(yè)，總共88頁(yè)。3、細(xì)胞培養(yǎng)物的固定、染色培養(yǎng)物的常用固定方法染色方法當(dāng)前58頁(yè)，總共88頁(yè)。2.1常用固定方法固定細(xì)胞的目的：

把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來(lái)，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位，使細(xì)胞的各部分易于著色、適于觀察、長(zhǎng)期保存和分析。當(dāng)前59頁(yè)，總共88頁(yè)。2.1常用固定方法固定細(xì)胞的原則：

盡可能選用新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。

培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和固定前處理各種細(xì)胞培養(yǎng)物。雙蓋片懸滴和懸液培養(yǎng)物：離心--PBS漂洗2-3次，固定制片；蓋片單層培養(yǎng)物：蓋片從培養(yǎng)器中取出--PBS漂洗2-3次，固定當(dāng)前60頁(yè)，總共88頁(yè)。常用固定液簡(jiǎn)單固定液：甲醇、乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛、丙酮、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、鋨酸混合固定液：

Mueller固定液、Flernming固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液當(dāng)前61頁(yè)，總共88頁(yè)。常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS(1:9)大標(biāo)本、染色體、線粒體、高爾基體戊二醛蛋白質(zhì)、微管和膜性結(jié)構(gòu)丙酮純冷丙酮固定細(xì)胞內(nèi)酶甲醇/醋酸(3:1)培養(yǎng)細(xì)胞、染色體，現(xiàn)用現(xiàn)配乙醇(70-100%)血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細(xì)菌和白細(xì)胞FAA固定液蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞醋酸(0.3-5%)減少其它固定劑引起的細(xì)胞收縮Carnoy固定液?jiǎn)螌蛹?xì)胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸Bouing固定液雙蓋片培養(yǎng)細(xì)胞的糖原鋨酸(1-2%)結(jié)膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)4%多聚甲醛-PBS腎纖維蛋白、細(xì)胞骨架蛋白當(dāng)前62頁(yè)，總共88頁(yè)。FAA固定液：

90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5mlCarnoy固定液：

60ml純乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液：

75ml飽和苦味酸（100ml水中加入1.2-1.4g）過(guò)濾，加入25ml福爾馬林（40%甲醛，有沉淀時(shí)禁用），再加入5ml冰醋酸（最好用前加）4%多聚甲醛-PBS：

50ml蒸餾水中加入4g多聚甲醛，加熱至60-70oC，邊攪拌邊逐滴加入2M的NaOH至液體清澈透明；用1M的HCl調(diào)pH至7.4，冷卻后加入10mM的PBS至100ml鋨酸：在棕色試劑瓶中加入50-100ml的0.1MPBS（），再將裝有1g鋨酸的安培瓶放入，擊碎安培瓶，搖晃使鋨酸溶解當(dāng)前63頁(yè)，總共88頁(yè)。2.2染色方法染色是利用化學(xué)染料與細(xì)胞及各種細(xì)胞器發(fā)生化學(xué)作用和/或吸附作用，使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)染色而改變其折射率，從而清晰的顯現(xiàn)出來(lái)。影響因素：所用的固定液染液的pH值：組織的酸性成分用pH偏高的染液，堿性成分用偏酸染液當(dāng)前64頁(yè)，總共88頁(yè)。1）Giemsa染色簡(jiǎn)便、快速，適用于多種細(xì)胞和染色體染色染色液現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間最好不超過(guò)48h；Giemsa液對(duì)pH敏感。母液制備：

Giemsa粉0.5g，甘油22ml，在研缽內(nèi)將少量甘油和Giemsa粉混合研磨至無(wú)顆粒，加入剩余甘油，56oC保溫2h，加入33ml甲醇，棕色瓶保存。當(dāng)前65頁(yè)，總共88頁(yè)。1）Giemsa染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)或涂片法）：1）Sorensenbuf和Giemsa染液9:1體積比混合即得到染色液2）用甲醇固定細(xì)胞標(biāo)本10min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30min3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡）4）染色10-15min，用自來(lái)水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明5）光學(xué)樹(shù)脂膠封片后觀察結(jié)果：細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色當(dāng)前66頁(yè)，總共88頁(yè)。2）蘇木精-伊紅染色染液制備：

1）蘇木精染液(20×):

蘇木精0.5g，銨礬(NH4)2SO4Al2(SO4)324g，H2O50ml，NaIO30.5g，甘油30ml，冰醋酸2ml。2）1%伊紅染液：

1g伊紅溶于100ml蒸餾水。當(dāng)前67頁(yè)，總共88頁(yè)。2）蘇木精-伊紅染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)法）：1）37oC溫PBS中漂洗3次，每次20-60sec，中性福爾馬林固定30min2）蒸餾水漂洗1次，用蒸餾水稀釋的1×蘇木精染液染色10min，自來(lái)水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至藍(lán)紫色3）伊紅水溶液中染0.5-1min，蒸餾水洗后迅速通過(guò)丙酮2次，每次3-5min4）通過(guò)2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2min；純二甲苯5-10min5）用光學(xué)樹(shù)膠封片（注意勿將蓋片的細(xì)胞面放反）后觀察結(jié)果：細(xì)胞核染成紅色，胞質(zhì)染成藍(lán)紫色當(dāng)前68頁(yè)，總共88頁(yè)。3）吖啶橙染色吖啶橙(acridineroange,AO)：常用熒光染料，可用于活細(xì)胞、固定細(xì)胞染色，可與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合而發(fā)出不同顏色的熒光，DNA亮綠色，RNA橘紅色至火紅色?？焖?、簡(jiǎn)便、并有一定特異性。染液配制：用生理鹽水將AO配成1%的母液，冰箱保存，用時(shí)則0.1M的PBS（pH4.8）稀釋成0.01%工作液。當(dāng)前69頁(yè)，總共88頁(yè)。3）吖啶橙染色染色步驟（蓋片培養(yǎng)）：1）Hank’s液洗蓋玻片上的貼壁細(xì)胞3次2）用95%乙醇固定細(xì)胞標(biāo)本15-30min，濾紙吸干3）1%醋酸作用30sec，PBS清洗1min4）用0.01%的AO染液染色1-5min，PBS清洗1min5）0.1MCaCl2分色0.5-2min，PBS清洗3次，每次數(shù)秒6）1:1的甘油:PBS封片，立刻觀察(用激發(fā)波405的濾光片)當(dāng)前70頁(yè)，總共88頁(yè)。4）免疫熒光染色原理：用熒光素標(biāo)記已知抗體或抗原，檢查細(xì)胞或組織標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體。在熒光顯微鏡下，抗原抗體特異性結(jié)合部位的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）：發(fā)射熒光波長(zhǎng)為490-619nm（黃綠色熒光）

四乙基羅丹明（RB200）：發(fā)射熒光波長(zhǎng)為540-660nm（橙紅色熒光）當(dāng)前71頁(yè)，總共88頁(yè)。4）免疫熒光染色染色步驟（間接熒光染色法）：1）用95%乙醇固定單層細(xì)胞標(biāo)本10-30min，或冷丙酮固定5-10min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩2）滴加未標(biāo)記的一抗液，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩3）滴加熒光標(biāo)記二抗，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩4）去除玻片周圍及材料上的水分5）熒光顯微鏡下觀察當(dāng)前72頁(yè)，總共88頁(yè)。5）細(xì)胞活體染色—臺(tái)盼藍(lán)用Hank’s液配制0.1%臺(tái)盼藍(lán)溶液用等比的0.5%胰酶和0.2%EDTA混合液消化貼壁細(xì)胞加入適量Hank’s液制成細(xì)胞懸液，每ml懸液中加入0.1%的臺(tái)盼藍(lán)溶液10ul并混勻細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞（折光性強(qiáng)且不著色）和死細(xì)胞（染為藍(lán)色）數(shù)目當(dāng)前73頁(yè)，總共88頁(yè)。6）細(xì)胞骨架染色微絲：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細(xì)胞3次，每次0.5min2%的甲醛/PBS液固定3min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次用羅丹明（rhodamine）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）（1:10）室溫中反應(yīng)15min，PBS漂洗3次60%甘油+熒光防淬劑封片后熒光顯微鏡觀察當(dāng)前74頁(yè)，總共88頁(yè)。6）細(xì)胞骨架染色微管：PBS洗蓋片培養(yǎng)的細(xì)胞3次，每次0.5min3%的甲醛/PBS液室溫固定20min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS投入冷丙酮中（-10~20oC）7min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS當(dāng)前75頁(yè)，總共88頁(yè)。6）細(xì)胞骨架染色微管：向一干凈平皿中央滴一滴濃度為0.1-0.2mg/ml的一級(jí)抗微管蛋白抗體，令小蓋片細(xì)胞面向下扣在抗體液上，將平皿置37oC溫箱中45-60min（加水盒）向平皿中緩緩加入PBS，浮起蓋片并用鑷子夾出，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS向另一干凈平皿中央滴一滴熒光標(biāo)記的二抗（0.1-0.2mg/ml），然后同操作⑤和⑥滴甘油/PBS（1:9，pH8.5）少許于載物片上，把小蓋片的細(xì)胞面覆以大蓋片上，并熒光顯微鏡觀察當(dāng)前76頁(yè)，總共88頁(yè)。4、顯微鏡觀察當(dāng)前77頁(yè)，總共88頁(yè)。3.1光學(xué)顯微鏡成像原理：光線自反射鏡折射入聚光器F1增強(qiáng)后照射在標(biāo)本上；標(biāo)本的像經(jīng)物鏡放大成倒像F2；目鏡將此物象進(jìn)一步放大在人眼視網(wǎng)膜上成正像F3。構(gòu)造：機(jī)械部分/照明部分/光學(xué)部分當(dāng)前78頁(yè)，總共88頁(yè)。光學(xué)顯微鏡的種類反差方式機(jī)制說(shuō)明亮視野反差取決于光吸收常結(jié)合組織染色技術(shù)來(lái)提高反差相差將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹罘床钆c局部的相密度成正比，包括線粒體、染色體、溶酶體等分光干涉相差轉(zhuǎn)換通過(guò)樣品的光程相位差的變化率光經(jīng)過(guò)細(xì)胞和細(xì)胞器邊緣時(shí)光程突然變化形成強(qiáng)烈反差暗視野散射光觀察產(chǎn)生細(xì)胞和細(xì)胞器邊緣的輪廓圖像干涉反射反差取決于相互靠近的空間表面之間發(fā)生的衍射用于觀察細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞與基底間的接觸帶偏振光在低于光學(xué)分辨率的情況下檢測(cè)具有雙折射性的超分子組織結(jié)構(gòu)用于定性排列結(jié)構(gòu)的研究，如細(xì)胞骨架、有絲分裂的微管以及強(qiáng)韌纖維、膜的觀察熒光反差取決于熒光基團(tuán)的光吸收及光衍射僅限于適當(dāng)?shù)淖园l(fā)熒光和熒光標(biāo)記當(dāng)前79頁(yè)，總共88頁(yè)。光學(xué)顯微鏡觀察的一般過(guò)程普通光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡熒光