抗豬γ干擾素單克隆抗體的制備及定量抗原捕獲ELISA檢測方法的初步建立

報告內(nèi)容研究背景研究思路與策略試驗方法及結(jié)果討論小結(jié)與展望研究成果當前1頁，總共32頁。研究背景-干擾素（IFN-）是機體內(nèi)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的重要細胞因子。它主要由激活的T細胞、激活的NK細胞和巨噬細胞產(chǎn)生。豬IFN-全基因編碼166個氨基酸殘基，包括20aa的信號肽(Dijkmans,1990)。信號肽切除后，產(chǎn)生146aa的IFN-單體，分子量為17.3kD，天然活性狀態(tài)的IFN-是由兩個IFN-單體經(jīng)非共價交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白(Boehm,1997)。

-干擾素概述當前2頁，總共32頁。IFN-γ的細胞分泌機制

MHCII+抗原遞呈細胞將抗原肽遞呈給CD4+T細胞,使幼稚CD4+T細胞轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分泌功能和增殖能力的效應Th細胞。MHCI+抗原遞呈細胞將抗原肽遞呈給CD8+T細胞，使后者轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分泌功能和增殖能力、靶細胞殺傷功能的效應CTL細胞。NK細胞和巨噬細胞被病原體所攜帶的LPS激活后，亦能分泌IFN-γ。

TCR抗原肽MHCT細胞抗原遞呈細胞T細胞當前3頁，總共32頁。IFN-檢測的免疫學意義機體的細胞免疫狀態(tài)監(jiān)測藥物的療效評估細胞免疫功能分析病原體T細胞表位鑒定當前4頁，總共32頁。IFN-γ的免疫學檢測方法

抗原捕獲ELISA酶聯(lián)免疫斑點試驗免疫聚合酶鏈式反應細胞內(nèi)細胞因子流式細胞術(shù)實時熒光定量RT-PCR當前5頁，總共32頁。ELISPOT原理

YYYYYYYYYYYYYY抗IFN-γ單抗IFN-γPBMC抗原特異性T細胞酶標鏈霉親和素生物素標記檢測抗體當前6頁，總共32頁。卵黃抗體的免疫學特性對細菌及哺乳動物蛋白抗原具有很高的親和力不與細菌或哺乳動物Fc受體結(jié)合，因而不能激活補體系統(tǒng)不與哺乳動物血清中的類風濕因子反應，與哺乳動物IgG和IgM沒有交差反應疏水性比IgG強，因而更容易包被于ELISA板和乳膠微球表面穩(wěn)定性好當前7頁，總共32頁。生物素-親和素系統(tǒng)

生物素-親和素系統(tǒng)是70年代末期發(fā)展起來的一種新型生物放大系統(tǒng)，其具有以下幾個顯著特點：

高靈敏度：由于每個親和素分子可結(jié)合4個生物素分子，其結(jié)合常數(shù)高達1015mol/L，遠遠大于抗原抗體的結(jié)合常數(shù)（105-11mol/L），因而該系統(tǒng)具有放大作用，能顯著提高檢測的靈敏度。

高特異性：親和素和生物素的結(jié)合反應很強，并具有高度專一性。加上系統(tǒng)的高靈敏性，因而使試劑經(jīng)得起高倍稀釋，從而大大減少了通常免疫反應中出現(xiàn)的非特異性作用。

高穩(wěn)定性：親和素與生物素一旦結(jié)合就很難解離，酸、堿、有機試劑、蛋白酶等均不影響二者的結(jié)合作用。

當前8頁，總共32頁。本試驗研究目的和意義本研究旨在應用生物素-親和素放大系統(tǒng)，以單克隆抗體和卵黃抗體為基礎(chǔ),建立一套檢測豬IFN-的定量抗原捕獲ELISA方法，為進一步建立豬IFN-的ELISPOT檢測方法奠定基礎(chǔ)。

當前9頁，總共32頁。研究思路與策略YY雜交瘤腹水高免卵黃抗體免疫親和層析生物素標記卵黃抗體親和純化單克隆抗體sandwichELISA原核表達IFN-γ

親和層析柱當前10頁，總共32頁。研究報告將在大腸埃希氏菌中表達的重組豬-干擾素（rpIFN-）免疫8周齡BALB/c鼠3次后，取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按標準程序融合后，用表達的重組豬-干擾素和豬-干擾素標準品進行交叉篩選，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗豬IFN-單克隆抗體的雜交瘤細胞株

。利用Western-blot分析和間接免疫熒光分析對該株單克隆抗體進行特異性鑒定?？关i-干擾素單克隆抗體的制備當前11頁，總共32頁。單抗的Western-blot鑒定1.預染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準(Fermentas);2.重組豬IFN-γ3.豬IFN-γ標準品（R&Dsystems);4.BSA二聚體?融合標簽?CF-IFN-γ本單克隆抗體能夠被豬IFN-γ標準品所識別當前12頁，總共32頁。單抗的間接免疫熒光（IFA）分析ABA：PMA刺激PBMC；B：未刺激PBMC本單克隆抗體能夠被天然IFN-所識別分離豬PBMCPMA誘導單抗孵育熒光二抗當前13頁，總共32頁。卵黃抗體效價測定高滴度抗體出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間長當前14頁，總共32頁?？乖禺愋訧gY的純化

HCLCSDS薄層掃描分析1.預染蛋白分子量標準2.(NH4)2SO4粗提IgY3.免疫親和純化的IgY卵黃分離氯仿脫脂硫酸氨粗提親和純化抗原特異性IgY的產(chǎn)率為0.26mg/mL卵黃液

當前15頁，總共32頁。生物素標記的卵黃抗體的制備生物素標記的卵黃抗體的洗脫曲線抗體透析生物素標記抗體脫鹽HABA分析平均每個IgY分子標記4.37個生物素分子

當前16頁，總共32頁。生物素標記卵黃抗體的效價注：a.抗體起始濃度為500ng/ml；b.陰性對照為相同濃度的非標記卵黃抗體；c.OD490nm>4.0

生物素標記的卵黃抗體具有良好的生物活性和較高的抗體滴度

當前17頁，總共32頁。抗豬IFN-單克隆抗體的純化

HCLC薄層掃描分析1.蛋白Marker；2.小鼠腹水；3.免疫親和純化的單克隆抗體

SDS親和層析法純化的單克隆抗體純度為95.1%,與A/G蛋白層析純化的抗體純度相當

當前18頁，總共32頁。單克隆抗體包被濃度的選擇

通過單抗抗包被濃度-被檢物濃度方陣試驗，確定單克隆抗體的最佳包被濃度為8ug/mL

當前19頁，總共32頁。生物素標記卵黃抗體工作濃度的選擇

固定包被抗體的濃度(8ug/mL),通過生物素標記卵黃抗體濃度--被檢物濃度方陣試驗，確定生物素標記卵黃抗體的最佳稀釋倍數(shù)為2000,即工作濃度為0.25ug/mL

當前20頁，總共32頁。封閉劑的選擇

采用捕獲抗體及檢測抗體的最佳工作濃度，比較不同封閉劑的封閉效果，采用1%Casein-PBS作封閉劑，其背景最低，信噪比最高。

當前21頁，總共32頁。rpIFN-檢測標準曲線

以本實驗優(yōu)化好的ELISA反應條件，繪制OD450值--rpIFN-抗原濃度標準曲線。被檢抗原濃度在7.8-1000ng/mL范圍內(nèi)能形成一條近似線性曲線。

當前22頁，總共32頁。靈敏度的確定用稀釋液作為空白對照，共設(shè)24個重復。則檢測靈敏度為（OD450平均值+2SD）在標準曲線上所對應的rpIFN-濃度。24個空白對照的OD450平均值為0.058，標準偏差為0.0041，則（OD450平均值+2SD）值為0.066，其對應標準曲線上rpIFN-的濃度為7.8ng/mL

當前23頁，總共32頁。特異性試驗（一）目前只對商品化人IFN-γ樣品進行了特異性試驗。應用本系統(tǒng)檢測106IU/mL的該樣品的OD450平均值為0.086，而陰性對照的平均值為0.059，因而可判定為無交叉反應。當前24頁，總共32頁。特異性試驗（二）

應用本試實驗所建立的檢測系統(tǒng)和商品化的檢測小鼠IFN-的ELISPOT試劑盒檢測經(jīng)系列稀釋的ConA樣品。

ConA對基于辣根過氧化酶的ELISA檢測系統(tǒng)具有交叉反應當前25頁，總共32頁。臨床檢測應用本ELISA方法對四頭接種rPRV-HA豬連續(xù)四周的免疫血清進行-干擾素檢測。

在接種重組病毒后一周，血清中-干擾素水平迅速升高，隨后總體呈下降趨勢

當前26頁，總共32頁。討論本實驗以帶有融合標簽和信號肽的rpIFN-為抗原，以rpIFN-和不含任何庸余序列的豬IFN-標準品交叉對單克隆抗體進行篩選和鑒定，既節(jié)省了昂貴的標準抗原，又減少了單克隆抗體篩選過程中不必要的時間浪費本實驗采用免疫親和層析的方法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，從而保證了所得抗體的特異性用雞作宿主,高滴度抗體出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間長，因而可實現(xiàn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn)ConA能結(jié)合含α-D-呋喃甘露糖和α-D-呋喃葡萄糖糖基的糖蛋白或多糖，而抗體分子，辣根過氧化酶（HRP）富含甘露糖殘基，這可能就是本實驗建立的ELISA方法對ConA產(chǎn)生交叉反應的直接原因當前27頁，總共32頁。結(jié)論成功制備了一株抗豬-干擾素的單抗，該單抗能夠被商品化豬IFN-和體外誘導的IFN-所識別利用免疫親和層析純化得到豬-干擾素特異性的卵黃抗體，平均每個抗體分子可標記4.37個生物素分子以親和純化的抗豬-干擾素單抗作為捕獲抗體，生物素標記的卵黃抗體作為檢測抗體，初步建立了豬-干擾素定量抗原捕獲ELISA檢測方法，其最小檢出濃度可達7.8ng/mLConA對基于辣根過氧化酶的ELISA檢測系統(tǒng)具有交叉反應當前28頁，總共32頁。致謝

本實驗是在哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室生物二室完成的。感謝導師童光志研究員和陳煥春教授三年來對我辛勤的培育和無私的幫助！

當前29頁，總共32頁。發(fā)表論文1.余斌，張強，閆麗萍，陳煥春，童光志.抗豬γ-干擾素單克