基因工程學時

基因工程學時第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日1基因工程概念：應用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（DNA）分離出來，在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組的DNA導入某種宿主細胞或個體，從而改變它們的遺傳品性；或者使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物（多肽或蛋白質(zhì)）。第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日2①②③④⑤⑥基因工程技術(shù)的一般步驟第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日3第一節(jié)基因工程理論的研究基礎第二節(jié)基因工程基本技術(shù)路線第三節(jié)常用的工具酶和載體第四節(jié)目的基因片段的獲取第五節(jié)目的基因?qū)胧荏w細胞第六節(jié)克隆子的篩選和鑒定第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日4第一節(jié)基因工程理論的研究基礎染色體是遺傳物質(zhì)的載體?！盎颉币辉~的創(chuàng)立：1909年，丹麥遺傳學家約翰遜提出了“基因”（gene）一詞?！盎蛐汀迸c“表現(xiàn)型”術(shù)語，初步闡明基因與性狀的關(guān)系。不過此時的基因仍是一個未經(jīng)證實，僅靠邏輯推理得出的概念。第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日5基因結(jié)構(gòu)示意圖＋鏈5’－鏈3’上游

3’5’第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日6基因工程研究的理論依據(jù)：不同基因具有相同的物質(zhì)基礎基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日7第二節(jié)基因工程的一般步驟生物材料RNADNAmRNAcDNA文庫基因組文庫人工合成目的基因克隆載體重組DNA受體細胞克隆子轉(zhuǎn)基因生物第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日8第三節(jié)常用的工具酶和載體

3.1工具酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶：

(二）DNA連接酶：（三）DNA片段末端修飾酶：

(四)DNA聚合酶第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日9(一)限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）（1）限制性核酸內(nèi)切酶定義一類以環(huán)形或線形雙鏈DNA為底物，能識別DNA中特定核苷酸序列，并在合適反應條件下使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’－OH和5’－P基團DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶。第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日10（2）限制性核酸內(nèi)切酶種類I型酶：它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈II型酶：在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶III型酶：它們在識別位點之外切開DNA鏈，并且要求識別位點是反向重復序列；它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實用價值，也沒有人將其商業(yè)化。

第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日11根據(jù)分離此酶微生物的學名，一般取3個字母。第一個字母大寫該微生物屬名前的第一個字母第二、三個字母小寫該微生物種名前的2個字母第四個字母大寫有變種或品系的第一個字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列

如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。（3）限制性核酸內(nèi)切酶的命名第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日12HindIIIHaemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株發(fā)現(xiàn)的第三種限制性內(nèi)切酶第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日13

（4）限制性內(nèi)切酶作用模式圖：（a)產(chǎn)生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********

G*********5′3′3′5′P

OH—第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日14

(b）產(chǎn)生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日15

(c）產(chǎn)生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日16常用的限制性內(nèi)切酶RsaI GTAC CATG BamHI GGATCC CCTAGGNotI GCGGCCGC CGCCGGCGEcoRV GATATC CTATAG 5‘3‘第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日17(6)常用的酶切方法：單酶切雙酶切部分酶切：底物濃度低，識別序列的甲基化，酶用量不足，反應時間不夠以及反應緩沖液(5)酶切反應體系第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日18（二）DNA連接酶

DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶。催化兩個dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接作用。第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日19(1)DNA片段之間的連接（a）具有互補粘性末端片段之間的連接：

T4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶

（b）具有平末端DNA片段之間的連接：

T4DNA連接酶；

第二十頁，共二十六頁，2022年，8月28日20（c）DNA片段末端修飾后進行連接：核酸外切酶：切成平末端末端轉(zhuǎn)移酶：修飾成互補黏性末端堿性磷酸酶：將5’-P修飾成5’-OH（d）DNA片段加連桿后連接人工合成連桿或銜接頭第二十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日21

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********

G*********5′3′3′5′

—P

OH—DNA連接酶（2）作用模式圖：a）連接粘性末端第二十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日22

b）連接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************T4DNA連接酶第二十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日23（三）DNA片段末端修飾酶*

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：

使DNA片段平末端的3‘-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly(A、T、G、C)的粘性末端，通過DNA連接酶的作用而完成DNA片段和載體間的連接*核酸外切酶：

切去DNA片段的凸出末端，使成為平末端*堿性磷酸酶：

為防止DNA片段末端之間的連接，常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5’－P成為5’-OH.第二十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日24（四）DNA聚合酶（1）要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA;（2）必須有模版；（3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA鏈；（4