匯總生物樣品微量藥物的分析技術(shù)(完整版)

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[匯總]生物樣品微量藥物的分析技術(shù)（完整版）(文檔可以直接使用，也可根據(jù)實(shí)際需要修改使用,可編輯歡迎下載）生物樣品微量藥物的分析技術(shù)體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。體內(nèi)藥物分析與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究和臨床治療藥物監(jiān)測(cè)密切相關(guān)，它直接關(guān)系到藥物的體內(nèi)作用機(jī)制探討與質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥物臨床使用的安全、有效與合理。藥物產(chǎn)生藥理作用的強(qiáng)度與其在體內(nèi)作用部位（受體組織）的濃度直接相關(guān)，而藥物在體內(nèi)主要依靠血液輸送至作用部位，因此血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的表觀指標(biāo)，即血液是體內(nèi)藥物分析的主要樣品。另外，尿液、唾液、頭發(fā)和臟器組織等也可作為體內(nèi)樣品。藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性，它們?cè)隗w內(nèi)的變化規(guī)律對(duì)母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評(píng)價(jià)極為重要；機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過(guò)程，其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。所以，體內(nèi)特定藥物代謝物和機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)也是體內(nèi)藥物分析監(jiān)測(cè)的目標(biāo)。藥物進(jìn)入體內(nèi)后，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與存在狀態(tài)均可能發(fā)生顯著變化。在體液中，藥物的存在形式多樣化，除游離型的原形藥物或其代謝物，也有原形藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等內(nèi)源性小分子經(jīng)共價(jià)結(jié)合的結(jié)合物（或稱綴合物，conjugate），還有與蛋白質(zhì)分子經(jīng)氫鍵及其他分子間力結(jié)合的結(jié)合型藥物；而且藥物及其代謝物的濃度通常很低、干擾物質(zhì)多。在測(cè)定體內(nèi)藥物及其特定代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)時(shí)，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后可直接測(cè)定外，通常在測(cè)定之前要對(duì)體內(nèi)樣品進(jìn)行分離凈化與濃集等樣品前處理，從而為體內(nèi)樣品中藥物的測(cè)定提供良好的環(huán)境與條件。常用的樣品前處理方法包括：去除蛋白質(zhì)、綴合物水解、化學(xué)衍生化、分離濃集等方法。其中，去除蛋白質(zhì)法主要有溶劑沉淀法、中性鹽析法、強(qiáng)酸沉淀法、超濾法及熱凝固法；分離濃集法通常采用液相萃取、固相萃取與膜分離技術(shù)。從藥物的研究到臨床應(yīng)用，藥物質(zhì)量的正確評(píng)價(jià)尺度是有效性和安全性，即根據(jù)藥物在體內(nèi)的表現(xiàn)作出評(píng)價(jià)。新藥進(jìn)入臨床之前，首先在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和毒代動(dòng)力學(xué)研究。所以，體內(nèi)藥物分析的對(duì)象不僅是人體，也包括試驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)體內(nèi)藥物進(jìn)行研究時(shí)，要求分析方法的靈敏度、專屬性和可靠性的程度均較高，建立有效的分析方法是體內(nèi)藥物分析的首要任務(wù)。其次，在新藥研究過(guò)程中，按照國(guó)家新藥注冊(cè)審批有關(guān)規(guī)定，要提供藥物在動(dòng)物和人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù)，這些研究工作要靠體內(nèi)藥物分析來(lái)完成。再者，為保證臨床用藥安全有效，體內(nèi)藥物分析也應(yīng)為治療藥物監(jiān)測(cè)（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）提供準(zhǔn)確的血藥濃度測(cè)定值，并對(duì)血藥濃度進(jìn)行具體分析和合理解釋，提供藥學(xué)情報(bào)和信息，參與指導(dǎo)臨床合理用藥、確定最佳劑量、制訂治療方案。另外，監(jiān)測(cè)和研究體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的濃度變化，對(duì)于某些疾病的診斷及治療具有重要意義；對(duì)于麻醉藥品和精神藥品濫用的檢測(cè)和運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)違禁藥物的監(jiān)測(cè)，也必須依據(jù)體內(nèi)藥物分析手段和技術(shù)才能完成。體內(nèi)樣品大都具有以下性質(zhì)特點(diǎn)：①采樣量少。體內(nèi)樣本采樣量一般為數(shù)毫升至數(shù)十微升，且多數(shù)在特定條件下采集，不易重新獲得。②待測(cè)物濃度低。體內(nèi)樣本中待測(cè)藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)濃度通常在10-9~10-6g/ml級(jí)，甚至低至10-12g/ml。③干擾物質(zhì)多。生物樣本，尤其是血樣中含有蛋白質(zhì)、脂肪、尿素等有機(jī)物和Na+、K+等大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)通常對(duì)測(cè)定構(gòu)成干擾；且體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)可與藥物結(jié)合，也能干擾測(cè)定；即使是藥物的代謝產(chǎn)物也往往干擾原形藥物的分析。因此，體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)是：①體內(nèi)樣品需經(jīng)分離與濃集，或經(jīng)化學(xué)衍生化處理后才能進(jìn)行分析；②對(duì)分析方法的靈敏度及專屬性要求較高；③分析工作量大，測(cè)定數(shù)據(jù)的處理和結(jié)果的闡明較為繁雜?；谶@些特點(diǎn)，體內(nèi)藥物分析中常用的測(cè)定方法主要有色譜分析法、免疫分析法和生物學(xué)方法。其中，色譜分析法主要包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS）等，可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究（PK）與臨床治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）的體內(nèi)樣品中大多數(shù)小分子藥物及其特定代謝產(chǎn)物的測(cè)定，而液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-TOF-MS）可用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子類藥物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的測(cè)定與分析；免疫分析法主要有放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、熒光免疫分析法（FIA）等，適用于體內(nèi)樣品中生物大分子類藥物的測(cè)定；生物學(xué)或微生物學(xué)方法適用于體內(nèi)樣品中抗生素類藥物的測(cè)定。建立可靠的和可重復(fù)的定量分析方法是進(jìn)行體內(nèi)樣品分析的基礎(chǔ)。為了保證分析方法的可行性與可靠性，體內(nèi)樣品分析方法在用于實(shí)際樣品的分析之前，必須對(duì)方法進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。體內(nèi)樣品分析方法的驗(yàn)證分為全面驗(yàn)證和部分驗(yàn)證兩種情況。對(duì)于首次建立的體內(nèi)樣品分析方法、新的藥物或新增代謝物定量分析，應(yīng)進(jìn)行全面的方法驗(yàn)證。分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容包括分析方法的效能指標(biāo)（即：特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度）與樣品（包括：體內(nèi)樣品、制備樣品及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液）穩(wěn)定性及提取回收率的驗(yàn)證。第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、體內(nèi)樣品的種類體內(nèi)藥物分析采用的體內(nèi)樣品包括血液、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等樣品。但其中最常用的是血漿或血清，因?yàn)樗鼈兛梢暂^好地體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。當(dāng)藥物在體內(nèi)被迅速代謝，且其代謝物大量排泄至尿中時(shí)，也采用尿液樣品，使在血樣中不易檢出的藥物，以代謝物形式在尿液中被檢測(cè)。尿液可用于生物利用度、尿藥排泄量等的測(cè)定。某些藥物，如苯妥英等的唾液濃度被認(rèn)為可以代表血漿中游離藥物的濃度，所以唾液也可用于某些藥物的臨床治療監(jiān)測(cè)；如果懷疑藥物可損傷血腦屏障，腦脊液的藥物濃度偶爾也進(jìn)行測(cè)定；頭發(fā)作為體內(nèi)樣品可用于藥物濫用的監(jiān)測(cè)或微量元素的測(cè)定。在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)研究藥物體內(nèi)吸收、分布狀態(tài)以及藥物過(guò)量中毒死亡患者的解剖檢驗(yàn)，常采用胃、腸、肝、腎、肺、腦、肌肉、組織等作為體內(nèi)樣品。在特殊情況下亦有采用乳汁、精液、淚液等生物體液。二、體內(nèi)樣品的采集與制備（一）血樣血藥濃度通常是指血漿（plasma）或血清（serum）中的藥物濃度，而不是指全血藥物濃度。因?yàn)楫?dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度時(shí)，血漿中藥物濃度被認(rèn)為與藥物在作用部位（靶器官）的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度可以反映藥物在體內(nèi)作用部位的狀況。所以，血漿和血清是體內(nèi)藥物分析最常用的樣本，其中選用最多的是血漿。1．血樣的采集供測(cè)定的血樣應(yīng)代表整個(gè)血藥濃度，所以應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。通常從靜脈采集血樣，并根據(jù)血中藥物濃度和分析方法靈敏度的要求，一般每次采血1~5ml；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采血量不宜超過(guò)動(dòng)物總血量的十分之一。血樣通常從肘靜脈采集，有時(shí)從毛細(xì)血管采血（成人多從手指或耳垂取血，小兒多從腳趾取血）用于臨床化驗(yàn)。2．血漿的制備將采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以約1000g離心力，離心5~10分鐘，使與血細(xì)胞分離，所得淡黃色上清液即為血漿。最常用的抗凝劑是肝素（heparin）。肝素是體內(nèi)正常生理成分，因此不致改變血樣的化學(xué)組成或引起藥物的變化，一般不會(huì)干擾藥物的測(cè)定。其他抗凝劑是一些能與血液中的Ca2+結(jié)合的試劑，如：EDTA、枸櫞酸鹽、氟化鈉、草酸等。目前，采血常用的負(fù)壓式采血管通常預(yù)加有抗凝劑。3．血清的制備將采集的靜脈血液置離心試管中，放置30分鐘~1小時(shí)。然后以約1000g離心力，離心5~10分鐘，上層澄清的淡黃色液體即為血清。因藥物與纖維蛋白幾乎不結(jié)合，所以血漿與血清中的藥物濃度通常是相同的。作為血藥濃度測(cè)定的樣品，血漿和血清可任意選用。但無(wú)論是采用血漿還是血清，現(xiàn)有的文獻(xiàn)、資料所列的血藥濃度，均系指血漿或血清中藥物的總濃度（游離的和與血漿蛋白結(jié)合的總濃度）。血漿比血清分離得快，而且制取的量約為全血的50％~60％（血清只為全血的20％~40％），多數(shù)研究者使用血漿樣品。若血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品。4．全血的制備將采集的血液置含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞處于均相，則稱為全血（wholeblood）。全血樣品放置或自貯存處取出恢復(fù)室溫之后，可明顯分為上、下兩層，上層為血漿、下層為血細(xì)胞，但輕微搖動(dòng)即可混勻。若需專門測(cè)定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度，則應(yīng)使用全血樣品；某些情況下由于血漿內(nèi)藥物濃度波動(dòng)太大，且又難以控制，或因血漿藥物濃度很低而影響測(cè)定，也應(yīng)考慮使用全血樣品。如：氯噻酮可與紅細(xì)胞結(jié)合，在血細(xì)胞中的藥物濃度比血漿中藥物濃度大50~100倍，且其動(dòng)力學(xué)行為亦與在血漿中不同，因此宜用全血樣品測(cè)定。再如：三環(huán)降壓藥物，對(duì)個(gè)別病人來(lái)說(shuō)，在血漿和紅細(xì)胞的分配比不是一個(gè)常數(shù)，故宜采用全血樣品進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)的研究。血樣主要用于藥物動(dòng)力學(xué)、生物利用度、臨床治療藥物監(jiān)測(cè)等研究與實(shí)際工作中，其測(cè)定方法大都采用測(cè)定原形藥物總量的方法。（二）尿樣采用尿樣測(cè)定藥物濃度的目的與血液、唾液樣品不同。尿藥測(cè)定主要用于藥物的劑量回收、尿清除率研究。同時(shí)，當(dāng)藥物在血中濃度過(guò)低難以準(zhǔn)確測(cè)定時(shí)，尿藥測(cè)定亦用于藥物制劑的生物利用度研究，以及根據(jù)藥物劑量回收研究可以預(yù)測(cè)藥物的代謝過(guò)程及測(cè)定藥物的代謝類型（代謝速率，metabolicrate，MR）等。1．尿樣的特點(diǎn)體內(nèi)藥物的清除主要是通過(guò)尿液排出體外，藥物可以原形（母體藥物）或代謝物及其綴合物等形式排出。尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大（成人一日排尿量為1~5L）。但由于易受食物種類、飲水多少、排汗情況等影響，常使尿藥濃度變化較大，一般以某一時(shí)間段或單位時(shí)間內(nèi)尿中藥物的總量（排泄量或排泄率）表示。2．尿樣的采集采集的尿是自然排尿。尿包括隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿幾種。因尿液濃度變化較大，所以應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中的藥物總量。即應(yīng)測(cè)定在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)采集的尿液（時(shí)間尿）體積和尿藥濃度。采集一定時(shí)間段（如服藥后-1~0.25、0.25~1、1~2、2~3、3~4、4~6、6~8、8~10、10~12、12~16、16~24、24~36、36~48小時(shí)）尿液時(shí)，用量筒準(zhǔn)確測(cè)量每一時(shí)間段內(nèi)尿液的總體積后，留取適量（如10ml）置于試管中，以供分析用，其余棄去，并做好記錄。3．尿樣的貯藏健康人排出的尿液是淡黃色或黃褐色的，pH在4.8~8.0之間。放置后會(huì)析出鹽類，并有細(xì)菌繁殖、固體成分的崩解，因而使尿液變混濁。因此，尿液必須加入適當(dāng)防腐劑后保存。第二節(jié)體內(nèi)樣品分析的前處理在測(cè)定體內(nèi)藥物及其代謝物時(shí)，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后直接測(cè)定外，一般在最后一步測(cè)定之前要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，即實(shí)施分離、濃集或改性等，為藥物的測(cè)定創(chuàng)造良好條件。樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)，也是分析中最困難，最繁復(fù)的工作。由于藥物自身的理化特性和在體內(nèi)的存在形式以及生物介質(zhì)的差異，對(duì)于體內(nèi)樣品的預(yù)處理很難規(guī)定統(tǒng)一方法和固定的程序，而必須結(jié)合后續(xù)的測(cè)定方法對(duì)分析樣品的要求，采取恰當(dāng)?shù)姆蛛x、凈化、濃集或化學(xué)衍生化等樣品處理步驟。圖5-1大致反映了測(cè)定方法與樣品前處理要求的相互關(guān)系。一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的（一）使待測(cè)藥物游離藥物進(jìn)入體內(nèi)后，即與血漿蛋白結(jié)合，同時(shí)部分經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生成代謝物及綴合物。即體內(nèi)樣品中的藥物通常以多種形式存在，須先進(jìn)行預(yù)處理，使待測(cè)藥物或代謝物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物或代謝物的總濃度。（二）滿足測(cè)定方法的要求體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復(fù)雜、干擾多，而待測(cè)藥物組分濃度低，須先經(jīng)預(yù)處理，使其分離及濃集。如，血清中既含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素等有機(jī)物，也含有Na+、K+、Cl-等無(wú)機(jī)物，而其藥物含量低（一般為μg/ml或ng/ml水平）。因此，需將樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，使組分得到凈化和富集，以滿足測(cè)定方法對(duì)分析樣品的要求。（三）改善分析環(huán)境為了防止分析儀器的污染、劣化，提高測(cè)定靈敏度和選擇性等。體內(nèi)樣品的預(yù)處理法由于各種分析儀器的耐受程度不同而不同。如高效液相色譜儀，為防止蛋白質(zhì)在色譜柱上的沉積、堵塞，至少需要進(jìn)行除去血漿蛋白質(zhì)的預(yù)處理工作?？梢哉f(shuō)，體內(nèi)樣品的預(yù)處理是色譜分析中必不可少的操作步驟。體內(nèi)樣品的預(yù)處理不僅可以延長(zhǎng)色譜柱的壽命；也可以改善方法的選擇性（排除生物介質(zhì)的干擾）和組分的可測(cè)性或組分的色譜行為（待測(cè)組分的化學(xué)衍生化）。二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法不管分析目的是什么，其選擇性分離是相當(dāng)重要的。這是因?yàn)閮?nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物或其他共存藥物的干擾能影響分析結(jié)果。對(duì)于大多數(shù)藥物而言，體內(nèi)樣品的分析通常由兩步組成：樣品的前處理和對(duì)最終提取物的測(cè)定。前處理是為了除去生物介質(zhì)中含有的大量?jī)?nèi)源性及外源性干擾物質(zhì)；提取出低濃度的待測(cè)藥物或代謝產(chǎn)物，或同時(shí)加以濃集；或進(jìn)行化學(xué)衍生化處理，使其在所用分析技術(shù)的檢測(cè)范圍之內(nèi)。分析方法的專屬性部分取決于分析方法的特點(diǎn)，但主要取決于分析樣品的前處理與制備技術(shù)。常用體內(nèi)樣品的預(yù)處理方法大致分為去除蛋白質(zhì)法、分離與濃集法、綴合物的水解、化學(xué)衍生化法及微波萃取和微透析技術(shù)等。（一）去除蛋白質(zhì)法在測(cè)定血樣時(shí)，首先應(yīng)去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物的總濃度。去除蛋白法有以下幾種方法。1、溶劑沉淀法加入與水相混溶的有機(jī)溶劑（親水性有機(jī)溶劑），溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增加而聚集；同時(shí)親水性有機(jī)溶劑的水合作用使蛋白質(zhì)水化膜脫水而析出沉降，并使與蛋白質(zhì)以氫鍵及其他分子間力結(jié)合的藥物釋放出來(lái)。常用的水溶性有機(jī)溶劑有乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等。含藥物的血漿或血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1∶(2~3)時(shí)，可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去。上清液偏堿性，pH為8.5~9.5。操作時(shí)，將水溶性有機(jī)溶劑與血漿或血清混合后離心分離，取上清液作為供試溶液。通常用于分離血漿或血清的離心力（～1000g）不能將蛋白質(zhì)沉淀完全，而采用高速離心（離心力～15000g）~5分鐘便可將析出的蛋白質(zhì)沉淀完全。高速離心最好采用控溫離心機(jī)，否則由于摩擦溫度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，并可能導(dǎo)致藥物分解。2、中性鹽析法加入中性鹽，溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)因分子間電排斥作用減弱而凝聚；同時(shí)中性鹽的親水性使蛋白質(zhì)水化膜脫水而析出沉降。常用的中性鹽有：飽和硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。操作時(shí)，如按血清與飽和硫酸銨溶液的比例為1∶2混合，高速離心~2分鐘，即可除去90%以上的蛋白質(zhì)。所得上清液近中性，pH為7.0~7.7。3、強(qiáng)酸沉淀法當(dāng)溶液pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，可與酸根陰離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強(qiáng)酸有：10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為1∶0.6混合，高速離心~2分鐘，就可以除去90%以上的蛋白質(zhì)。因加入了強(qiáng)酸，上清液呈強(qiáng)酸性（pH0~4），在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。4、熱凝固法當(dāng)待測(cè)物熱穩(wěn)定性好時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白質(zhì)沉淀。加熱溫度視待測(cè)組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜嶂?0℃：蛋白沉淀后可用離心或過(guò)濾法除去，這種方法最簡(jiǎn)單，但只能除去熱變性蛋白。（二）分離與濃集液-液萃取法是傳統(tǒng)的分離、濃集方法。樣品在提取過(guò)程中，雖然待測(cè)組分得到了凈化，但因微量的組分分布在較大體積（數(shù)毫升）的提取溶劑中，提取液往往還不能直接供分析用。一些分析方法，如GC和HPLC等都受進(jìn)樣量的限制，若將提取液直接注入儀器，待測(cè)組分的量可能達(dá)不到檢測(cè)靈敏度要求。因此，常需要使待測(cè)組分濃集后再進(jìn)行測(cè)定。方法是揮去提取溶劑，殘?jiān)鼜?fù)溶于小體積的溶劑。揮去提取溶劑的常用方法是直接通入氮?dú)饬鞔蹈?；?duì)于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。溶劑蒸發(fā)所用的試管，底部應(yīng)為尖錐形，這樣可使最后數(shù)微升溶劑集中在管尖，便于待測(cè)組分的復(fù)溶與分取。隨著藥物分析技術(shù)的不斷提高，體內(nèi)樣品的前處理技術(shù)得到迅速發(fā)展，在液相萃取的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了許多分離與濃集的新方法和新技術(shù)。如：液相微萃取、固相萃取、自動(dòng)化固相萃取、固相微萃取、超濾及微透析技術(shù)等?，F(xiàn)分別就其基本原理、特點(diǎn)、適用性等敘述如下：1．液相萃取法液相萃取法，也稱液-液提取法（liquid-liquidextraction，LLE），是利用待測(cè)藥物與內(nèi)源性干擾物的分配系數(shù)不同而進(jìn)行的液相分離技術(shù)。多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相的溶解度，而血樣或尿樣中含有的大多數(shù)內(nèi)源性干擾物質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)，因而可用有機(jī)溶劑提取法除去大部分內(nèi)源性干擾物質(zhì)。應(yīng)用本法時(shí)要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積及水相的pH等。（1）溶劑的選擇原則：選擇合適的溶劑是使提取獲得成功的主要條件，它一方面涉及提取效率和選擇性，另一方面也涉及操作是否方便。溶劑的選擇應(yīng)根據(jù)相似相溶的原則進(jìn)行，選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①對(duì)藥物分子的未電離形式可溶，而對(duì)電離形式不溶；②沸點(diǎn)低、易揮發(fā)；③與水不相混溶；④無(wú)毒、不易燃燒；⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性；⑥不影響紫外檢測(cè)。某些溶劑，如乙醚萃取能力強(qiáng)，又易于揮散、濃集，為常用萃取溶劑。但乙醚萃取后可混入約1.2%的水分，在提取前于樣品（水相）中加入適量固體氯化鈉（中性鹽，提高溶液離子強(qiáng)度），可減少乙醚中水的溶解度，以減少混入的水溶性干擾物質(zhì)。（2）溶劑的用量：提取時(shí)所用的有機(jī)溶劑量要適當(dāng)。一般有機(jī)相與水相（體內(nèi)樣品）體積比為1∶1～5∶1。根據(jù)待測(cè)藥物的提取回收率及前處理過(guò)程確定提取溶劑的最佳用量。（3）水相的pH：采用LLE時(shí)，體內(nèi)樣品溶液（水相）pH的選擇主要由待測(cè)藥物的pKa確定。當(dāng)pH與pKa相等時(shí)，50％的藥物以非電離形式存在。對(duì)于堿性藥物最佳pH為高于pKa1~2個(gè)pH單位；對(duì)于酸性待測(cè)藥物，則要低于pKa1~2單位。這樣，就可使得90%的藥物以非電離形式存在，而更易溶于有機(jī)溶劑中。作為一般規(guī)則，堿性藥物在堿性pH、酸性藥物在酸性pH介質(zhì)中提??；但一般多在堿性下提取，以減少內(nèi)源性物質(zhì)（多是酸性的）的干擾。一些堿性藥物在堿性pH不穩(wěn)定時(shí)，則可在近中性pH用三氯甲烷和異丙醇提取。（4）提取操作：一般只提取一次。若提取回收率較低（如低于50%）時(shí)，可提取2~3次；若干擾物質(zhì)為脂溶性，不易除去，則可將提取分離出的含藥有機(jī)相再用一定pH的小體積水溶液反提取（backextraction）后測(cè)定，或?qū)⒎刺崛∫涸儆糜袡C(jī)溶劑提取，如此反復(fù)提取可將藥物與干擾物質(zhì)有效分離。液-液提取法的優(yōu)點(diǎn)在于它的選擇性和低廉的運(yùn)行成本，以及可對(duì)樣品進(jìn)行凈化和濃集的特點(diǎn)。所以本法在體內(nèi)藥物分析中，尤其是采用LC-MS測(cè)定時(shí)被廣泛應(yīng)用。2．固相萃取法由于高效液相色譜，尤其是反相高效液相色譜的成功應(yīng)用，使人們利用色譜理論，采用裝有不同填料的小柱進(jìn)行體內(nèi)樣品處理的固相萃?。╯olid-phaseextraction，SPE）技術(shù)日益受到重視。SPE技術(shù)亦稱液-固萃取技術(shù)，它的應(yīng)用大大縮短了樣品處理時(shí)間，同時(shí)可避免乳化現(xiàn)象，而且便于自動(dòng)化操作。（1）固相萃取法的原理：將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的體內(nèi)樣品溶液通過(guò)小柱時(shí)，由于受到“吸附”、“分配”、“離子交換”或其他親和力作用，藥物及內(nèi)源性干擾物質(zhì)同時(shí)被保留在固定相（填料）上，用適當(dāng)溶劑洗除干擾物質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。其保留或洗脫的機(jī)制取決于藥物與固定相表面的活性基團(tuán)，以及藥物與溶劑之間的分子間作用力。藥物的洗脫方式有兩種：①一種是藥物比干擾物質(zhì)與固定相之間的親和力更強(qiáng)，因而在用沖洗溶劑洗去干擾物質(zhì)時(shí)藥物被保留，然后用一種對(duì)藥物親和力更強(qiáng)的溶劑洗脫藥物；②另一種是干擾物質(zhì)較藥物與固定相之間的親和力更強(qiáng)，則藥物被直接洗脫，干擾物質(zhì)被保留在萃取柱上。通常使用更多的是前一種洗脫模式的SPE。從市場(chǎng)上可得到含有不同填料的商品化的微型柱，如由美國(guó)AnalytichemInternational公司生產(chǎn)的BondElut和由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的Sep-pak微型柱等，目前應(yīng)用最廣泛。取體內(nèi)樣品（液體），加載到微型柱上端，在下端通過(guò)負(fù)壓使溶劑通過(guò)微型柱。也可以通過(guò)在微型柱的上端利用注射器達(dá)到正壓的方法使溶劑通過(guò)，洗脫出的分析樣品在每一微型柱的正下方用試管收集。SPE的填料種類繁多，可分成親脂型（大孔吸附樹(shù)脂、親脂性鍵合硅膠）、親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）和離子交換型三類，其中親脂型用得最多。烷基、苯基、氰基鍵合硅膠都可用作固相萃取吸附劑，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18）最常用。親脂性鍵合硅膠容易吸附水中的非極性物質(zhì)，易用有機(jī)溶劑洗脫，適用于萃取、凈化水基質(zhì)體液中疏水性藥物。常見(jiàn)的商品SPE柱有Sep-PakC18、Bond-ElutC18、CN（氰基）、C2（乙基）、Ph（苯基）Baker10C18等。（2）固相萃取法的操作步驟：使用親脂性鍵合相硅膠SPE柱的一般操作步驟如下。第一步：用甲醇潤(rùn)濕小柱，活化填料，以使固相表面易于和待測(cè)組分發(fā)生分子間相互作用，同時(shí)可以除去填料中可能存在的干擾物質(zhì)。第二步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除過(guò)多的甲醇，但沖洗不宜過(guò)分。否則會(huì)使甲醇含量過(guò)低（低于5%），導(dǎo)致C18鏈彎曲折疊，對(duì)待測(cè)物的吸附能力下降，造成萃取回收率降低。第三步：加樣，使體內(nèi)樣品通過(guò)小柱，并棄去濾過(guò)廢液。第四步：用水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱，去除吸附于固定相上的內(nèi)源性物質(zhì)或其他相關(guān)干擾物質(zhì)。第五步：選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摯郎y(cè)物，收集洗脫液，揮干溶劑備用或直接進(jìn)行在線分析。（3）注意事項(xiàng)：使用親脂性鍵合硅膠SPE柱時(shí)，需注意如下幾點(diǎn)。①體液樣品（如血漿等）通過(guò)萃取柱的流速控制在1~2ml/min。②沖洗液和洗脫劑的強(qiáng)度、用量要適當(dāng)，否則會(huì)導(dǎo)致藥物的損失或洗脫選擇性下降。通常選用可與水混溶的洗脫劑。③萃取堿性藥物時(shí)，洗脫劑中常需加酸、有機(jī)胺或氨水、醋酸銨或離子對(duì)試劑。（4）固相萃取法的特點(diǎn)與應(yīng)用：用親脂性鍵合硅膠SPE方便、省時(shí)，通?？梢杂眯◇w積的甲醇、乙腈等洗脫劑（200~300μl）完全洗脫藥物、凈化并濃集樣品，不需蒸干即可直接進(jìn)樣。對(duì)于給定藥物體內(nèi)樣品的處理方法的選用可概括如下：①較親脂的藥物，可用溶劑萃取，或用親脂性鍵合硅膠為填料的SPE處理。但對(duì)于堿性藥物，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)保留作用，故宜用大孔吸附樹(shù)脂為填料的SPE。②較親水且具有酸堿性、可解離的藥物，可采用離子交換型填料SPE法處理。③較親水但又不能解離的藥物則不太容易萃取，可用沉淀蛋白后直接進(jìn)樣法。（三）綴合物的水解藥物或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物稱為綴合物（conjugate）。內(nèi)源性物質(zhì)有葡萄糖醛酸（glucuronicacid）、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特別是前兩種為最重要的內(nèi)源性物質(zhì)。一些含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物；還有一些含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。由于綴合物較原形藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取。為了測(cè)定尿液中藥物總量，需對(duì)綴合物進(jìn)行水解，將綴合物中的藥物釋出。常用的方法如下：1．酸水解法酸水解時(shí)，可加入適量的鹽酸溶液。至于酸的用量和濃度、反應(yīng)時(shí)間及溫度等條件，隨藥物的不同而異。這些條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。該法比較簡(jiǎn)便、快速，但有些藥物在水解過(guò)程中會(huì)發(fā)生分解；與酶水解法相比，其專一性較差。2．酶水解法對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可以采用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶（glucuronidase）或硫酸酯酶（sulfatase）。前者可專一地水解藥物的葡萄糖醛酸苷綴合物，后者水解藥物的硫酸酯綴合物。而實(shí)際應(yīng)用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶。一般控制pH為4.5~5.5，37℃培育數(shù)小時(shí)進(jìn)行水解。酶水解比酸水解溫和，一般不會(huì)引起待測(cè)物分解，且酶水解專屬性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是酶水解時(shí)間稍長(zhǎng)及酶制劑可能帶入的黏蛋白導(dǎo)致乳化或色譜柱阻塞。盡管如此，酶水解仍被優(yōu)先選用。在尿液中采用酶水解，應(yīng)事先除去尿中能抑制酶活性的陽(yáng)離子。3．溶劑解法綴合物（主要是硫酸酯）往往可通過(guò)加入的溶劑在萃取過(guò)程中被分解，稱作溶劑解（solvolysis）。例如尿中的甾體硫酸酯在pH1時(shí)加醋酸乙酯提取，產(chǎn)生溶劑解，這時(shí)的條件也比較溫和。值得注意的是，目前對(duì)綴合物的分析逐漸趨向于直接測(cè)定綴合物的含量（如采用HPLC和RIA法），以獲得在體內(nèi)以綴合物形式存在的量，以及當(dāng)排出體外時(shí)，綴合物占所有排出藥物總量的比率，從而為了解藥物代謝情況提供更多的信息。第三節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證建立可靠的體內(nèi)樣品中微量藥物及其代謝物的分析方法是體內(nèi)藥物分析工作的首要任務(wù)，本節(jié)將就體內(nèi)樣品分析方法建立的一般程序和分析方法驗(yàn)證的基本內(nèi)容與要求進(jìn)行論述。分析方法初步擬定后，需進(jìn)行一系列的試驗(yàn)工作，以選擇最佳的分析條件，并對(duì)分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以確認(rèn)是否適用于實(shí)際體內(nèi)樣品的分析。分析方法的建立和驗(yàn)證過(guò)程系同步進(jìn)行的，是不能截然劃分的。為便于討論，在此將以色譜分析法為例分別敘述。首先分步討論分析方法的建立過(guò)程。1．色譜條件的篩選取待測(cè)藥物或其特定的活性代謝產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（必要時(shí)）的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品，或符合標(biāo)準(zhǔn)的原料藥，或已知純度化合物），照擬定的分析方法（不包括體內(nèi)樣品的預(yù)處理步驟）進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)調(diào)整色譜柱的型號(hào)或牌號(hào)（填料的性狀、粒徑、柱長(zhǎng)度等）、流動(dòng)相（組分及其配比）及其流速、柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等條件，使待測(cè)藥物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具有良好的色譜參數(shù)（n、R、T）及峰面積比值，并具有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間（tR）以避開(kāi)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器，以獲得足夠的方法靈敏度（LOQ）。2．色譜條件的優(yōu)化（1）試劑與溶劑試驗(yàn)：取待測(cè)藥物的非生物介質(zhì)溶液（通常為水溶液），按照擬定的分析方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)、萃取分離等樣品預(yù)處理后，進(jìn)樣分析以考察反應(yīng)試劑對(duì)測(cè)定的干擾（方法特異性）。通過(guò)改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），使空白試劑色譜峰不干擾藥物的測(cè)定（分離度應(yīng)＞1.5）。本步驟主要考察需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程，若預(yù)處理過(guò)程僅為體內(nèi)樣品的提取分離，則可不進(jìn)行該步驟，直接進(jìn)行空白生物介質(zhì)試驗(yàn)。（2）生物介質(zhì)試驗(yàn)：取空白生物介質(zhì)，如空白血漿，按照擬定的體內(nèi)樣品預(yù)處理與樣品分析方法操作?？疾焐锝橘|(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)（endogenoussubstances）對(duì)測(cè)定的干擾（方法特異性），在待測(cè)藥物、特定的活性代謝產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等的“信號(hào)窗”（色譜峰附近的有限范圍）內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào)。（3）質(zhì)控樣品試驗(yàn)：取空白生物介質(zhì)，按照實(shí)際體內(nèi)樣品中藥物的預(yù)期濃度范圍，加入待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控（qualitycontrol，QC）樣品，照“生物介質(zhì)試驗(yàn)”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，建立分析方法的定量范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行方法的精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度、提取回收率，以及樣品與溶液的穩(wěn)定性等各項(xiàng)參數(shù)的驗(yàn)證和介質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估；同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證待測(cè)藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與內(nèi)源性物質(zhì)或其他藥物的分離效能。例如，色譜峰的tR、n和T是否與水溶液的一致，色譜峰是否為單一成分，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點(diǎn)等，均可說(shuō)明內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾。3．實(shí)際樣品的測(cè)試通過(guò)空白生物介質(zhì)和質(zhì)控樣品試驗(yàn)，所建立的分析方法及其條件尚不能完全確定是否適合于實(shí)際樣品（incurredsamples）的測(cè)定。因?yàn)樗幬镌隗w內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合（如與血漿蛋白結(jié)合），或經(jīng)歷各相代謝生成數(shù)個(gè)代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物或綴合物。使得從體內(nèi)獲得的實(shí)際體內(nèi)樣品變得更為復(fù)雜。所以，在分析方法建立后，尚需進(jìn)行實(shí)際體內(nèi)樣品的測(cè)試，考察代謝產(chǎn)物對(duì)藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況，以進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性。二、分析方法的驗(yàn)證為了保證所建立的分析方法的可行性與可靠性，分析方法在用于實(shí)際樣品的分析之前，必須對(duì)方法進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證（validation）。體內(nèi)樣品分析方法的驗(yàn)證分為全面驗(yàn)證（fullvalidation）和部分驗(yàn)證（partialvalidation），在此著重介紹全面驗(yàn)證過(guò)程。對(duì)于首次建立的體內(nèi)樣品分析方法、新的藥物或新增代謝物定量分析，應(yīng)進(jìn)行全面的方法驗(yàn)證。以下將以色譜分析法為主討論體內(nèi)樣品分析方法的全面驗(yàn)證過(guò)程。分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容包含分析方法的效能指標(biāo)（即特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度）與樣品（包括：體內(nèi)樣品、制備樣品及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液）穩(wěn)定性及提取回收率的驗(yàn)證。方法驗(yàn)證通常采用QC樣品和用藥后的實(shí)際體內(nèi)樣品進(jìn)行，具體的驗(yàn)證參數(shù)及其基本要求如下：（一）特異性方法的特異性（specificity），又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?，通常與選擇性（selectivity）互用。方法的特異性系用以證明使用該方法所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的待測(cè)物（原形藥物或特定的活性代謝物），體內(nèi)樣品所含內(nèi)源性物質(zhì)和相應(yīng)代謝物、降解產(chǎn)物及其他共同使用的藥物不得干擾對(duì)樣品的測(cè)定。所以，驗(yàn)證一個(gè)分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)：1．內(nèi)源性物質(zhì)的干擾通過(guò)比較待測(cè)藥物或其特定的活性代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及至少6個(gè)不同個(gè)體的空白生物介質(zhì)和QC樣品（注明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度）的檢測(cè)信號(hào)，如HPLC色譜圖中各待測(cè)藥物或其特定的活性代謝產(chǎn)物色譜峰的保留時(shí)間（tR）、理論板數(shù)（n）和拖尾因子（T）是否一致，以及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的分離度（R），確證內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法無(wú)干擾。對(duì)于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法（LC-MS或LC-MS/MS）應(yīng)注意考察分析過(guò)程中的介質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。2．未知代謝產(chǎn)物的干擾通過(guò)比較QC樣品和至少6個(gè)不同個(gè)體用藥后的實(shí)際體內(nèi)樣品的檢測(cè)信號(hào)，如HPLC色譜圖中各被測(cè)藥物色譜峰的tR、n和T是否一致，以及與其他未知代謝產(chǎn)物（在實(shí)際樣品的色譜中通常隨用藥后的時(shí)間延長(zhǎng)而增加）色譜峰的R，確證其他代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法無(wú)干擾。必要時(shí)可通過(guò)HPLC-DAD和LC-MS（或LC-MS/MS）確證被測(cè)定色譜峰的單純性和同一性。3．伍用藥物的干擾在臨床治療藥物監(jiān)測(cè)時(shí)，還要考慮患者可能同時(shí)服用其他藥物（通常為數(shù)有限）的干擾。可通過(guò)比較待測(cè)藥物、同時(shí)服用藥物、待測(cè)藥物的QC樣品和添加有同時(shí)服用藥物的干擾樣品的檢測(cè)信號(hào)，如HPLC色譜圖中各待測(cè)藥物色譜峰與同時(shí)服用藥物色譜峰的tR及其R，確證同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法無(wú)干擾。4．與參比方法的相關(guān)性除上述方法外，有時(shí)還可使用參比方法對(duì)照法。參比方法一般選用特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法。如在治療藥物監(jiān)測(cè)中使用UV（或FIA）法時(shí)，可與HPLC（或GC）法比較。即同時(shí)用兩種方法測(cè)定不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，以參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)（x），以擬定方法測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)（y），用最小二乘法計(jì)算回歸方程y=a+bx（要求坐標(biāo)標(biāo)度相等）?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性；截距a表示擬定方法受到的恒定干擾的程度，如UV中具有紫外吸收的試劑或內(nèi)源性物質(zhì)可引起恒定干擾（a＞0）；斜率b表示擬定方法受到比例干擾的程度，如FIA中標(biāo)記抗原不純可引起比例干擾（b≠1）。與參比方法的相關(guān)性比較，除顯示分析方法的特異性外，還反映分析方法的準(zhǔn)確度。斜率b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性，當(dāng)截距a≈0時(shí)，若參比方法準(zhǔn)確度良好，則擬定方法的準(zhǔn)確度（回收率）等于100b（%）。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve），亦稱校正曲線（calibrationcurve）或工作曲線（workingcurve），反映了體內(nèi)樣品中所測(cè)定藥物的濃度與儀器響應(yīng)值（如HPLC峰面積）的關(guān)系，一般用回歸分析法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)。除少數(shù)方法（如IA）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式。最常用的回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權(quán)最小二乘法（weightedleastsquares）。回歸方程的自變量（x）為體內(nèi)樣品中待測(cè)藥物的濃度，因變量（y）為響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍為定量范圍（quantificationrange），在定量范圍內(nèi)QC樣品濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度。1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)樣品建立，標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制應(yīng)使用與待測(cè)體內(nèi)樣品相同的生物介質(zhì)。測(cè)定不同體內(nèi)樣品時(shí)應(yīng)建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)濃度個(gè)數(shù)取決于待測(cè)物的預(yù)期濃度范圍和待測(cè)物/響應(yīng)值關(guān)系的性質(zhì)。定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)的體內(nèi)樣品濃度范圍，不得用定量范圍外推的方法求算未知體內(nèi)樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行測(cè)定空白體內(nèi)樣品（生物介質(zhì)），但計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)，僅用于評(píng)價(jià)干擾。當(dāng)線性范圍較寬的時(shí)候，推薦采用加權(quán)的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，以使低濃度點(diǎn)計(jì)算得比較準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的一般步驟如下：系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇或其他適宜溶劑溶解并定量稀釋制成一定濃度（較高濃度）的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，冰箱保存?zhèn)溆?；精密量取?biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用水或其他適宜溶劑定量稀釋制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。依據(jù)待測(cè)物的預(yù)期濃度范圍和待測(cè)物與響應(yīng)值的關(guān)系性質(zhì)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度個(gè)數(shù)，線性模式的標(biāo)準(zhǔn)曲線至少應(yīng)包含6個(gè)濃度點(diǎn)（不包括零點(diǎn)，即空白樣品），非線性模式的濃度點(diǎn)應(yīng)適當(dāng)增加。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度系列一般為等比梯度模式，通常比例常數(shù)約為2，這樣可以有限的濃度點(diǎn)覆蓋較寬泛的濃度范圍。如：1、2、5、10、20、50、100。在此系列中，若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5，考慮到個(gè)體差異，設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1，可覆蓋全部待測(cè)體內(nèi)樣品中的藥物濃度。內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)適量，用甲醇及其他適宜溶劑溶解并定量稀釋制成一定濃度的內(nèi)標(biāo)貯備液，冰箱保存?zhèn)溆茫痪芰咳?nèi)標(biāo)貯備液適量，用水及其他適宜溶劑定量稀釋制成內(nèi)標(biāo)溶液。內(nèi)標(biāo)溶液的濃度一般選擇與系列“標(biāo)準(zhǔn)溶液”的幾何平均濃度，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間濃度（如系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1、2、5、10、20、50和100時(shí)，中間濃度為10）相當(dāng)。即按擬定方法加入中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液時(shí)，樣品的檢測(cè)信號(hào)（如HPLC的峰面積）的比值約為1。系列標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：取空白生物介質(zhì)數(shù)份，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，渦旋混勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品（standardsamples），其濃度范圍可覆蓋全部待測(cè)體內(nèi)樣品預(yù)期濃度。同時(shí)制備空白樣品（待測(cè)藥物濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)樣品）。因?yàn)榧尤氲臉?biāo)準(zhǔn)溶液體積較小，為防止在其加入及渦旋混合時(shí)造成損失，也可在適宜的容器（如離心玻璃試管或EP管）內(nèi)先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后，再加入空白生物介質(zhì)并渦旋混勻。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有高濃度的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈等）、且加入體積較大時(shí)，為防止因標(biāo)準(zhǔn)溶液的加入而造成部分生物介質(zhì)（如血漿蛋白）變性，使標(biāo)準(zhǔn)樣品與用藥后的實(shí)際體內(nèi)樣品不一致，進(jìn)而造成分析結(jié)果的偏差。也可先將標(biāo)準(zhǔn)溶液加至適宜的容器內(nèi)，揮干溶劑后，再加入空白生物介質(zhì)并渦旋溶解、混勻。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，按擬定方法預(yù)處理后分析，以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)（如色譜峰面積）或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)法）的響應(yīng)的比值（因變量，y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的藥物濃度（自變量，x），用最小二乘法或加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程（y=a+bx）及其相關(guān)系數(shù)（γ），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)樣品中的待測(cè)藥物濃度，以單位體積（液態(tài)介質(zhì)，如血漿）或質(zhì)量（臟器組織，如肝臟）的生物介質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量表示，如μg/ml或μg/g等。例如，取空白血漿0.5ml，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml）10μl。即在0.5ml的生物介質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1μg，則標(biāo)準(zhǔn)樣品中的待測(cè)藥物濃度為2μg/ml。若生物介質(zhì)為臟器勻漿溶液，則以所取勻漿體積所相當(dāng)?shù)呐K器的重量中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量計(jì)算。2．限度要求用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)濃度個(gè)數(shù)取決于待測(cè)物的預(yù)期濃度范圍和待測(cè)物/響應(yīng)值關(guān)系的性質(zhì)。在藥代動(dòng)力學(xué)或生物利用度研究中，必須至少用6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)于非線性相關(guān)（如IA）可能需要更多濃度點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)的體內(nèi)樣品濃度范圍，定量上限（upperlimitofquantification，ULOQ，標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)）應(yīng)高于用藥后生物介質(zhì)中藥物的峰濃度（Cmax）；定量下限（lowerlimitofquantification，LLOQ，最低濃度）應(yīng)低于Cmax的10%~5%（1/10~1/20）。標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的計(jì)算值（依據(jù)回歸方程推算的濃度）與標(biāo)示值之間的偏差〔bias=[(計(jì)算值－標(biāo)示值)/標(biāo)示值]×100%〕在可接受的范圍之內(nèi)時(shí)，可判定標(biāo)準(zhǔn)曲線合格?？山邮芊秶话阋?guī)定為最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)，其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)。只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對(duì)體內(nèi)樣品進(jìn)行定量計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距應(yīng)接近于零，若顯著偏離零點(diǎn)，應(yīng)確證其對(duì)方法的準(zhǔn)確度無(wú)影響；斜率應(yīng)接近或大于1（與坐標(biāo)的標(biāo)度選擇有關(guān)），使具有較高的靈敏度；相關(guān)系數(shù)應(yīng)接近于1，即具有良好的相關(guān)性，如色譜法γ≥0.99。（三）定量下限定量下限（LLOQ）是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示方法的靈敏度，即測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。1．測(cè)定法取同一生物介質(zhì)，制備至少5個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其濃度應(yīng)使信噪比（S/N）大于5，依法進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證。2．限度要求其準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的80%～120%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)小于20%。在藥代動(dòng)力學(xué)與生物利用度研究中，LLOQ應(yīng)能滿足3~5個(gè)消除半衰期時(shí)體內(nèi)樣品中的藥物濃度或Cmax的1/20～1/10的藥物濃度的測(cè)定。（四）精密度與準(zhǔn)確度精密度（precision）是指在確定的分析條件下相同生物介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測(cè)量值的分散程度，通常用QC樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示。在體內(nèi)藥物分析過(guò)程中，無(wú)論是藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的獲得或是治療藥物的監(jiān)測(cè)，通常在1個(gè)分析批（analyticalrun）內(nèi)難以完成全部體內(nèi)樣品的分析。而在不同的分析批之間的實(shí)驗(yàn)條件（如儀器性能、參數(shù)、試劑來(lái)源、實(shí)驗(yàn)溫度、濕度等）有可能發(fā)生小的改變，進(jìn)而對(duì)分析結(jié)果可能產(chǎn)生影響。所以在體內(nèi)藥物分析中，方法精密度除要評(píng)價(jià)批內(nèi)（within-run或intra-batch）RSD外，同時(shí)還應(yīng)評(píng)價(jià)批間（between-run或inter-batch）RSD。準(zhǔn)確度（accuracy）是指在確定的分析條件下測(cè)得的體內(nèi)樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度，通常用QC樣品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的相對(duì)回收率（relativerecovery,RR）或相對(duì)偏差（relativeerror,RE）表示。準(zhǔn)確度可通過(guò)重復(fù)測(cè)定已知濃度的待測(cè)物樣品獲得。1．測(cè)定法使用QC樣品進(jìn)行考察，一般選擇高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度通常選擇在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近于ULOQ；中間濃度選擇平均濃度（通常為幾何平均濃度，即以幾何級(jí)數(shù)排列的標(biāo)準(zhǔn)曲線的中部）附近。與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作，每個(gè)樣品測(cè)定1次。在測(cè)定批內(nèi)RSD時(shí)，每一濃度至少制備并測(cè)定5個(gè)樣品。為獲得批間RSD，應(yīng)在不同天（每天1個(gè)分析批）連續(xù)制備并測(cè)定，至少有連續(xù)3個(gè)分析批（analyticalrun），不少于45個(gè)樣品的分析結(jié)果。2．結(jié)果計(jì)算與限度要求每批的測(cè)定數(shù)據(jù)（待測(cè)藥物的色譜峰面積或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值）用該批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算QC樣品濃度X。準(zhǔn)確度以多次測(cè)定結(jié)果的平均值與標(biāo)準(zhǔn)值（制備時(shí)的加入量）S比較計(jì)算，一般準(zhǔn)確度RR應(yīng)在85%~115%范圍內(nèi)（RE不超過(guò)±15%），在LLOQ附近應(yīng)在80%~120%范圍內(nèi)（RE不超過(guò)±20%）。RR或RE的計(jì)算式分別如下： 精密度一般要求RSD不超過(guò)15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)不超過(guò)20%。批內(nèi)和批間RSD計(jì)算式分別如下：式中，SSe批內(nèi)方差；SSA批間方差；SStot總方差；Xij第i批的第j次測(cè)定值；Xi.為第i批n次測(cè)定的平均值；為N次測(cè)定的總平均值；I為測(cè)定批數(shù)（通常I=3）；n為每批測(cè)定次數(shù)（每批樣品數(shù)，通常n≥5)；N為總測(cè)定次數(shù)(總樣品數(shù)，通常N≥15)。（五）樣品穩(wěn)定性在體內(nèi)藥物分析中，含藥體內(nèi)樣品由臨床實(shí)驗(yàn)室（或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室）采集后轉(zhuǎn)移至分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析測(cè)試，通常不能及時(shí)完成分析；另一方面，體內(nèi)樣品的數(shù)量一般較大，在1個(gè)工作日內(nèi)難以完成全部體內(nèi)樣品的分析，通常需在多個(gè)工作日內(nèi)完成；其次，隨自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)的應(yīng)用，多個(gè)制備樣品（processedsamples）同時(shí)于進(jìn)樣架中等待分析；再者，每個(gè)未知體內(nèi)樣品一般測(cè)定1次，但有時(shí)亦需進(jìn)行復(fù)測(cè)。為確保分析結(jié)果的可靠與可重復(fù)，分析過(guò)程中樣品的穩(wěn)定性顯得尤為重要。樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證內(nèi)容包括在1個(gè)分析批內(nèi)含藥體內(nèi)樣品和制備樣品的短期穩(wěn)定性和在整個(gè)樣品分析期間含藥體內(nèi)樣品及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。1．短期穩(wěn)定性在1個(gè)分析批內(nèi)的操作過(guò)程中，含藥體內(nèi)樣品在室溫等待處理、體內(nèi)樣品的處理過(guò)程（如提取、凈化及濃縮）中，以及制備樣品（處理后的樣品溶液）在室溫或特定溫度下（如HPLC自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)設(shè)定進(jìn)樣室溫度）等待進(jìn)樣測(cè)試期間，樣品中待測(cè)物的穩(wěn)定性應(yīng)予以考察，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。2．長(zhǎng)期穩(wěn)定性在整個(gè)樣品分析期間，含藥體內(nèi)樣品的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏、凍融，以及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性也將影響著分析結(jié)果準(zhǔn)確和重現(xiàn)。所以，需對(duì)含藥體內(nèi)樣品在冰凍（?20℃或?80℃）和凍融條件下、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在特定溫度（如4℃或?20℃）下以及不同存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以確定體內(nèi)樣品和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定的存放條件和時(shí)間，應(yīng)在確保樣品穩(wěn)定的條件下進(jìn)行測(cè)定。3．測(cè)定方法測(cè)定法與要求：取高、低2個(gè)濃度的QC樣品（或溶液），于適當(dāng)?shù)娜萜鳎úＡЩ蚓郾┤萜鳎﹥?nèi)，在不同條件下、存放不同時(shí)間（測(cè)定時(shí)可能需要的時(shí)間）后，每個(gè)樣品（或溶液）重復(fù)測(cè)定3次以上，其平均值的偏差應(yīng)在零時(shí)測(cè)定值的±5%以內(nèi)（若樣品經(jīng)衍生化處理則限度為±15%）。若考察時(shí)間在1個(gè)工作日以上，則應(yīng)與新制QC樣品在相同條件下的測(cè)定值比較。穩(wěn)定性期限要求：在不同的存放條件下，存放時(shí)間要求不同。如在室溫下一般僅需考察1個(gè)工作日（如1、2、4、8或24小時(shí)）或3個(gè)工作日內(nèi)（1個(gè)分析批不應(yīng)超過(guò)3個(gè)工作日）的穩(wěn)定性即可；在冰箱中（4℃或?20℃或?80℃）則應(yīng)考察數(shù)個(gè)工作日（或數(shù)星期、甚至數(shù)月）內(nèi)的穩(wěn)定性。例如，體內(nèi)樣品室溫放置待處理，應(yīng)不超過(guò)1個(gè)工作日；制備樣品室穩(wěn)定或特定溫度下待測(cè)定，應(yīng)不超過(guò)3個(gè)工作日；血漿樣品應(yīng)于冰箱內(nèi)冷凍（?20℃或?80℃）儲(chǔ)藏至整個(gè)分析完成（可能需數(shù)星期甚至數(shù)月）；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備亦應(yīng)于冰箱內(nèi)（4℃或?20℃）儲(chǔ)存至整個(gè)分析完成。若在此期間不夠穩(wěn)定，則應(yīng)考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末的穩(wěn)定性；血漿凍-融至少經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)（即至少兩次融溶復(fù)測(cè)），每次冷凍時(shí)間應(yīng)在24小時(shí)以上。（六）提取回收率提取回收率（extractionrecovery）系指從生物樣本介質(zhì)中回收得到待測(cè)物的響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)值的比值，通常以%表示。待測(cè)物的提取回收率用于評(píng)價(jià)樣品處理方法將體內(nèi)樣品中待測(cè)物從生物介質(zhì)中提取出來(lái)的能力。在體內(nèi)藥物分析中，因?yàn)轶w內(nèi)樣品的量較少、待測(cè)藥物的濃度通常較低，不宜進(jìn)行多步驟操作；且體內(nèi)樣品數(shù)量大，要求樣品處理方法盡量簡(jiǎn)便、快速。所以，對(duì)于樣品處理方法的評(píng)價(jià)重點(diǎn)在于結(jié)果的精密與