PCR引物設計原理

PCR引物設計原理第1頁/共108頁PCR反應一般由三個步驟組成：①模板的熱變性；②引物復性到單鏈模板上；③熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的延伸第2頁/共108頁第3頁/共108頁變性在應用TaqDNA聚合酶進行PCR時，變性溫度在94-95℃下進行，這也是TaqDNA聚合酶進行30個或30個以上PCR循環(huán)而活力不受到過多損失時能耐受的最高溫度。有時把變性時間設計為5min，以便大分子模板DNA徹底變性的概率。對于GC含量為55%或更低的線性DNA模板，推薦PCR的變性條件是94-95℃變性45s。第4頁/共108頁復性溫度（退火溫度）至關重要?。?！退火溫度太高，引物不能與模板很好地復性，擴增效率會非常低；退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復性，從而導致非特異性DNA片段的擴增；退火溫度，通常比理論設計的引物和模板的Tm值低3-5℃下進行。最好通過對復性溫度比兩條引物的Tm值低2-10℃內(nèi)進行PCR預實驗（梯度）來對復性條件的優(yōu)化。引物和模板DNA的復性第5頁/共108頁對TaqDNA聚合酶來說，最適溫度為72-78℃，時間約為1min。引物的延伸與循環(huán)數(shù)目哺乳動物DNA為模板時，至少進行25個循環(huán)才能得到足夠量的擴增產(chǎn)物。一般為30-33個循環(huán)。第6頁/共108頁引物設計要點（1）堿基組成：GC含量應在40%-60%（45%-55%）之間，4中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，沒有二核苷酸重復序列，如GCGCGC等；（2）引物長度：引物中與模板互補的區(qū)應為18-25個核苷酸長度，上下引物長度差別不能大于3bp，如上游引物為19bp，下游引物為24bp等。第7頁/共108頁（3）重復或自身互補序列：形成發(fā)夾結構，會阻止引物和模板之間的復性。第8頁/共108頁（4）上下引物的互補性：一個引物的3'末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上，因為PCR中引物濃度較高，會形成引物二聚體。當一個PCR有多對引物時，注意檢查任何一個3'末端都不能和其他任何引物互補。第9頁/共108頁（5）解鏈溫度（Tm值）：計算出來的兩個引物的Tm值相差不能大于5℃，擴增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般為50-70℃。這些特性保證了擴增產(chǎn)物在每一個PCR循環(huán)可有效變性。第10頁/共108頁（6）3’末端3’末端的性質非常關鍵。如果可能的話，每個引物的3’末端堿基為G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推薦3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促進發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。第11頁/共108頁當末端堿基為A時，錯配時引發(fā)鏈合成的效率大大降低；當末端堿基為T時，錯配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一般PCR反應中，引物3’末端的堿基最好選T、C、G，而不選A。引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位點：第12頁/共108頁一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（positivestrand），編碼鏈（codingstrand）；無意鏈（anti-sensestrand），負義鏈（negativestrand），模板鏈（templatestrand）

第13頁/共108頁正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上游的引物。如用于測序，則從5’→3’方向讀出DNA正鏈的序列。反向引物（Reverseprimer）：處于目的DNA雙鏈下游的引物。如用于測序，則讀出DNA負鏈從下游到上游的反向序列。

第14頁/共108頁

第15頁/共108頁Primer

Premier5.0軟件設計引物是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設計、評估的軟件主要界面分為序列編輯窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和Motif第16頁/共108頁正向（Asis）、反向（reversed）、互補（complemented）及反向互補（reversecomplemented）。第17頁/共108頁正向（Asis）第18頁/共108頁反向（reversed）第19頁/共108頁互補（complemented）第20頁/共108頁Enzyme第21頁/共108頁軟件默認以表格方式顯示酶切結果。單擊Seq

或Map，分別以序列或圖示的方式顯示結果。缺點：不能以文本的形式保存結果。第22頁/共108頁Motif

第23頁/共108頁第24頁/共108頁Primer第25頁/共108頁點擊Search，進行引物搜索第26頁/共108頁Searchcriteria

窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。PrimerLength常設置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。當然有特殊要求的除外，如加個酶切位點什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。第27頁/共108頁Manual→Searchparameters→人工搜索參數(shù)設置窗口。Searchstringency應選High。GC含量一般是40－60％。其它參數(shù)默認就可以。第28頁/共108頁Searchprogress窗口中顯示SearchCompleted→OK鍵第29頁/共108頁結果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100。選其中的一對引物，在主窗口顯示結果。對于上述引物，如果其它各項指標還可以，可在引物末端去掉一個不滿意的或加上一個堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好點。搜索出來的引物，按Rating排序，逐個送Oligo軟件里評估。當然，搜索出的引物，其擴增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。引物3端≥2個A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的G或C太多，或引物3端≥2個G或C，這樣的引物應作為次選，沒得選了就選它。第30頁/共108頁該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個引物在模板上結合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度??！第四層：四種重要指標的分析第31頁/共108頁引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應中的退火溫度。長的PCR引物能給擴增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結構二聚體自身互補等二級結構。適宜引物長度為18-27nt。Tm融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿基對作用原理來計算融鏈溫度。PCR反應的合適Tm范圍為56-63℃（50-70℃）GC%含量：對于PCR反應來說GC含量在50%左右比較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性，盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，盡量避免3’末端的多義性，因為這個位置即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。

第32頁/共108頁BLAST驗證引物進入http:///BLAST/,點擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項第33頁/共108頁在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：例：引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同時輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5’

→3’。輸入上游引物后，加上≥20個字母n，再輸入下游引物。第34頁/共108頁在ChooseSearchSet欄中：Database根據(jù)預操作基因的種屬定了，可選Humangenomic+transcript或Others第35頁/共108頁在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarsequences(blastn)項，如下圖：在此界面最下面關鍵要點擊Algorithmparameters參數(shù)設置，進入?yún)?shù)設置界面。第36頁/共108頁在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框將數(shù)字改為7。第37頁/共108頁圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并與下游引物互補（Strand=Plus/Minus），理論上可以擴增出基因片斷。點擊線段，就能跳轉到該基因的結果信息概要。第38頁/共108頁Accession，數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點擊之后可以獲得該序列的信息Desscription序列的簡單描述高的就是有兩線段間有連線的代表隨機匹配的可能性。E值接近零時最有意義，也就是說序列完全匹配了。第39頁/共108頁比對到的序列長度E值越小為好！！匹配上的堿基數(shù)占總序列長度的比例缺失或插入，用“-”來表示Query1、2表示輸入的兩對引物，Sbjct表示在庫里比對的序列PrimerBLAST的詳細結果第40頁/共108頁ncbi在線primer設計第41頁/共108頁默認的參數(shù)實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。

第42頁/共108頁第43頁/共108頁第44頁/共108頁第45頁/共108頁用Oligo軟件設計/評估PCR引物啟動Oligo，選擇File→open，打開要進行引物分析的序列。第46頁/共108頁圖中顯示的三個指標：Tm值、ΔG和Frequencies。退火溫度窗口是設計引物的主窗口，其他兩個具有輔助作用。第47頁/共108頁因為分析要涉及多個指標，啟動窗口的Cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為Tile方式。第48頁/共108頁用Tile方式顯示窗口第49頁/共108頁Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；5’到3’端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應。圈出來的序列部分及黃色的bar即代表當前分析的21個堿基的Tm值可點擊窗口的左下角的Upper、Lower按鈕選擇上游引物、下游引物。第50頁/共108頁Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了第51頁/共108頁顯示了裝載的整個序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對頻率。寡核苷酸的3'端如果在一個特定的數(shù)據(jù)庫（GenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導致錯誤引發(fā)。

Frequencies，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點作為3'末端，那么就減少了在復雜的底物（比如整個基因組DNA）內(nèi)的許多位點結合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性PCR產(chǎn)物的形成。

第52頁/共108頁平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而TTGGCG德頻率很低，約300。第53頁/共108頁ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚體的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反應了序列與模板的結合強度；最好引物的ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低。第54頁/共108頁在一個雙鏈結構中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能ΔG表示。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二個核苷酸第一個（5’）核苷酸例子：雙鏈d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol第55頁/共108頁顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高。第56頁/共108頁你可以在三個窗口中自行設計引物。選擇了自己認為順眼的位置，此時，點擊Uper，上游引物即可顯示。同時在序列下游尋找下游引物，點擊Lower，即可顯示下游引物。對你設計的引物質量進一步分析。第57頁/共108頁同時在序列下游尋找下游引物，點擊Lower，即可顯示下游引物。第58頁/共108頁參數(shù)設置與搜索選擇search→forprimersandprobes，進行如右圖設置。點擊searchranges，設置引物范圍和PCR產(chǎn)物的大小點擊parameters，進行參數(shù)設置。因為設計的是一對引物，正、負鏈的復選框都要選上。同時選compatiblepairs默認下，對引物的要求：無二聚體、3’高度特異、GC%含量有限定、去除錯誤引發(fā)引物等。第59頁/共108頁引物的長度及產(chǎn)物的長度設置。PrimerLength設置在18－30bp,短了特異性不好，長了沒有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。第60頁/共108頁普通設置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個等級的設定，最后有一個用戶定制選項。當對軟件功能不了解時，應選veryhigh/High。選automaticallychangestring后，搜索引物時，如果在高等級設定中無法搜索到引物對時自動降級一個等級來搜索，直到找到為止。反向引物時用第61頁/共108頁讓引物的長度可以改變，以適應設定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引發(fā)效率）?？梢韵薅ㄋx引物對的最大數(shù)目。第62頁/共108頁實際上需要我們改動的只有引物的長度，根據(jù)實驗需求做相應改動。其他的參數(shù)就使用Oligo默認值，一般無需改動。第63頁/共108頁直接使用Oligo默認值，一般也無需改變。第64頁/共108頁參數(shù)設置完畢后，點擊確認OK，程序即進行引物搜索。第65頁/共108頁引物搜索結果如入：Oligo提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫度、GC含量等的排列方式。第66頁/共108頁Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對引物，這時程序自動彈出一個PCR分析窗口。第67頁/共108頁PCRoptimalannealingtemperature（最佳退火溫度）數(shù)值得參考。在PCR摸索條件的時候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。產(chǎn)物Tm值與引物Tm值（低的那個）的差異，一般控制在20度以內(nèi)。引物間Tm值的差異，一般控制在5-6度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對于正、負鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度第68頁/共108頁在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選擇相應的功能，分析結果。第69頁/共108頁點擊Selectedprimers，會給出兩條引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計算，會比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG過高，會在錯配位點形成雙鏈結構并引起DNA聚合反應，因此此項絕對值應該小一些，最好不要超過9。KeyInfo第70頁/共108頁Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影響PCR反應異常的重要因素→應避免，至少也要使設計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其ΔG值應該偏低→由退火溫度決定，50°的退火溫度和65°對二聚體的影響肯定不一樣。Themoststable3’-DimerDeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol?！鱃絕對值越大結構越穩(wěn)定。結合堿基對不要超過3個。themoststableDimeroverall絕對值一般應小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關。實驗表明在PCR退火溫度65°時，6.7kcal/mol沒有問題。第71頁/共108頁Hairpinformation，引物發(fā)夾結構DeltaG絕對值一般不要超過4.5kcal/mol。結合堿基對不要超過3個。特定的發(fā)夾如果沒有顯示Tm值，那么發(fā)夾結構就不容易形成。第72頁/共108頁結合堿基對已經(jīng)超過3個。第73頁/共108頁在3’形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應，減少了參加正式反應引物的數(shù)量。第74頁/共108頁CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一種是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高時錯配很少，特異性強。第75頁/共108頁Falseprimingsites，錯誤引發(fā)位點oligo會給正確引發(fā)效率和錯誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在100以下。有時候正確位點的引發(fā)效率很高的話，比如達到400～500，錯誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。Primer的primingefficiency應該是錯配地方的4倍左右，更多當然更好。第76頁/共108頁下游引物對于負鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯誤引發(fā)。第77頁/共108頁SelectedOligo第78頁/共108頁Primerpairs系統(tǒng)設計出的所有引物對。第79頁/共108頁internalstabilityInternalstability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過于穩(wěn)定。引物3端過于穩(wěn)定，很容易導致不適當擴增。第80頁/共108頁上游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到上游引物處。第81頁/共108頁對應的下游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到下游引物處。第82頁/共108頁Hybridizationtime，雜交時間該窗口顯示了不同長度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時間

第83頁/共108頁Concentration您只需點一下鼠標，就輕松地實現(xiàn)對你地引物、PCR產(chǎn)物、DNA模版鏈即時的濃度、體積、OD值、分子量的轉換。該濃度窗口是一個強大的時間保存計算器。第84頁/共108頁Oligo不僅能以圖表的方式將結果展示出來，還能以文本的形式保存。在軟件所出現(xiàn)的任何一個窗口，選擇File→dataAs，把數(shù)據(jù)存為一個文本文件。第85頁/共108頁文本保存的結果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度第86頁/共108頁Primerpremier5設計引物→Oligo引物評估

舉例說明：ncbi里查找基因LIF的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS區(qū)序列。第87頁/共108頁上游引物第88頁/共108頁下游引物第89頁/共108頁可以看出，Oligo對引物進行了非常全面的分析，為選擇最佳的引物提供了參考。Oligo不僅能對所搜索的引物進行全面分析，還能對任意的寡核苷酸進行分析。選擇File→newsequence，在出現(xiàn)的窗口中輸入要分析的寡核苷酸序列，完畢后按回車鍵或選擇Accept/Discard→Accep