CASE基因治療課稿

CASE基因治療課稿第1頁/共49頁肝癌的自殺基因（suicidegene）療法，即藥物敏感基因（drugsensitivity)療法，分子化療、病毒導(dǎo)向的酶解藥物前體療法（VDEPT）、基因?qū)虻拿附馑幬锴绑w療法（GDEPT），是將病毒、細(xì)菌中特有的前藥物轉(zhuǎn)換酶基因——自殺基因?qū)氲侥[瘤細(xì)胞，自殺基因編碼的特異性酶類將無毒的藥物前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成毒性產(chǎn)物達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。自殺基因治療第2頁/共49頁自殺基因類型單純皰疹病毒—胸苷激酶基因（HSV—TK）水痘帶狀皰疹病毒—胸苷激酶基因（VZV—TK)大腸桿菌胞嘧啶脫氧酶基因（EC—CD）第3頁/共49頁單純皰疹病毒—胸苷激酶基因（HSV—TK）單純皰疹病毒（herpessimplexvirus）胸苷激酶（thymidinekinase）基因能特異性地將核苷類似物無環(huán)鳥苷（ACV）或丙氧鳥苷（GCV）單磷酸化，進而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成三磷酸GCV。這種高毒性的GCV是細(xì)胞DNA聚合酶的抑制子和DNA合成的終結(jié)子，使分裂的腫瘤細(xì)胞被殺傷。第4頁/共49頁HSV-TKACVOPO3磷酸化后的ACV第5頁/共49頁水痘帶狀皰疹病毒—胸苷激酶基因（VZV—TK)

水痘帶狀皰疹病毒（varicellazostervirus）胸苷激酶，可將無毒的甲基嘌呤阿拉伯核苷（araMP）代謝成DNA酶的抑制物腺阿拉伯三磷酸（araATP），從而殺傷腫瘤細(xì)胞。第6頁/共49頁大腸桿菌胞嘧啶脫氧酶基因（EC—CD）可將抗真菌藥物5-氟胞嘧啶（5-Fc）轉(zhuǎn)化為高細(xì)胞毒性的化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）此外，還有大腸桿菌脫氧胞苷激酶（deoxycitidinekinase）基因，大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（gunainephosphoribosyltransferase)基因等。escherishiacolicytosinedeaminase第7頁/共49頁第8頁/共49頁現(xiàn)狀

其中研究最深入，應(yīng)用最廣泛的仍是HSV-TK/GCV系統(tǒng)，VZV-TK/araM系統(tǒng)，F(xiàn)C-CD/5-Fc系統(tǒng)。其中HSV-TK/GCV系統(tǒng)的抗腫瘤效能已在多種腫瘤的體外實驗中得到確證。第9頁/共49頁第10頁/共49頁

自殺基因殺死腫瘤細(xì)胞的作用機制1.直接殺傷作用

2.旁觀者效應(yīng)

3.誘導(dǎo)機體免疫第11頁/共49頁自殺基因的旁觀者效應(yīng)現(xiàn)象：體外實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HSV-TK（TK+)基因和未轉(zhuǎn)染HSV-TK（TK-）基因混合培養(yǎng)時，GCV不僅殺死TK+細(xì)胞，而且殺死TK-細(xì)胞。而且腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中只要有10%的TK+基因細(xì)胞就可使其他未轉(zhuǎn)染HSV-TK（TK-）基因細(xì)胞同時被殺傷。意義：只要少數(shù)的腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)染自殺基因，就會對臨近的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的殺傷作用（這樣也可以減低對轉(zhuǎn)染方法效率的要求，有很大的臨床應(yīng)用價值）第12頁/共49頁旁觀者效應(yīng)的途徑①轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的腫瘤細(xì)胞前體藥物代謝產(chǎn)物可直接傳遞到鄰近的細(xì)胞，使鄰近的細(xì)胞死亡②轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的腫瘤細(xì)胞的死亡是一種凋亡，細(xì)胞凋亡后凋亡小體能夠轉(zhuǎn)移一些毒性產(chǎn)物和自殺基因表達(dá)酶本身進入鄰近的細(xì)胞，引起繼發(fā)性的凋亡。第13頁/共49頁免疫介導(dǎo)作用1.自殺基因誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,凋亡,壞死以及細(xì)胞核降解所釋放出的大量細(xì)胞碎片,增強了機體對腫瘤抗原的遞呈和T細(xì)胞的識別2.遞呈抗原活化的CD8+通過直接殺傷和指導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子來發(fā)揮最大的細(xì)胞毒作用3.CD4+細(xì)胞的抗腫瘤記憶作用,共刺激分子B7,MHCⅠ類分子,NK細(xì)胞以及其他非特異性殺傷細(xì)胞也參與了自殺基因介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)第14頁/共49頁自殺基因的載體

將自殺基因載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至腫瘤靶細(xì)胞所用載體是自殺基因療法付諸于臨床的一項關(guān)鍵技術(shù)。肝癌自殺基因療法采用⑴重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體⑵腺病毒載體

第15頁/共49頁重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能攜帶外源基因整合到靶細(xì)胞基因組，實現(xiàn)目的基因持久穩(wěn)定表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只在分裂細(xì)胞中整合，因此對肝癌細(xì)胞相對帶有靶向性，但它的轉(zhuǎn)染滴度較低并有插入突變和激活癌基因的危險，所以不適合直接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。第16頁/共49頁腺病毒載體

腺病毒載體能產(chǎn)生更高的病毒滴度及在體內(nèi)外對肝癌細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率。不整合人宿主染色體基因組，安全性穩(wěn)定。但是腺病毒載體在轉(zhuǎn)染后會產(chǎn)生免疫反應(yīng)進而降低轉(zhuǎn)染效率進而限制重復(fù)使用。第17頁/共49頁基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與表達(dá)的靶向性

可以將自殺基因置于特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列之下，達(dá)到使自殺基因在肝特異性表達(dá)癌組織第18頁/共49頁抑癌基因P53基因P27基因P21基因P16基因（MTS1）甲狀腺素蛋白（TTR）PTENKLF6第19頁/共49頁P53p53基因位于染色體17p13.1，是一種腫瘤抑制基因，近半數(shù)的原發(fā)腫瘤與p53突變有關(guān)，包括30%～60%的肝癌。p53突變通常發(fā)生在體積大、低分化的肝癌，并且提示預(yù)后不良。p53基因突變本身并不直接引發(fā)肝癌，但會促進肝癌的發(fā)展。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)第20頁/共49頁p53的等位基因缺失和準(zhǔn)時突變集中于外顯子4和外顯子9之間包含有DNA結(jié)合域的編碼區(qū)。第21頁/共49頁當(dāng)DNA受到損傷時,P53蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累,DNA復(fù)制停止,細(xì)胞周期停滯在G1期,為DNA的修復(fù)留有充足的時間.如果修復(fù)失敗,P53蛋白則引導(dǎo)細(xì)胞進入程序性死亡.當(dāng)p53發(fā)生突變時,不僅喪失此功能,而且還轉(zhuǎn)為癌基因。第22頁/共49頁由于不能產(chǎn)生這個蛋白來與p53基因產(chǎn)物作用,一旦進入細(xì)胞后,該病毒不能有效的繁殖。而在p53基因突變的腫瘤細(xì)胞中,由于p53基因蛋白功能的缺失,缺失E1B-55KD基因的腺病毒可以不受抑制,在細(xì)胞中有效繁殖,故而殺死宿主腫瘤細(xì)胞。第23頁/共49頁P53突變不僅喪失阻止細(xì)胞周期和DNA損傷時誘導(dǎo)凋亡作用,而且突變體有獲得性功能,如激活PCNA、VEGF、EGFR、IGF1受體,激活CMYC、MDR基因等,P53突變導(dǎo)致化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用顯著下降,用P53反義核酸治療,可以抑制腫瘤的增殖,誘導(dǎo)凋亡,提高藥物的敏感性。第24頁/共49頁PTEN抑癌基因PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosome10,PTEN),又稱為MMAC1(mutatedinmultipleadvancedcancers,MMAC1),是1997年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,定位于人染色體10q23。它是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一一種能使脂類去磷酸化的抑癌基因,而且,其抑癌作用依賴于這種特性。PTEN是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中最常突變的抑癌基。第25頁/共49頁PTEN的結(jié)構(gòu)可大體分為三個功能區(qū)，包括N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域和一個與脂質(zhì)結(jié)合的C2區(qū)。第26頁/共49頁PTEN具有兩種磷酸酶活性：1.脂質(zhì)磷酸酶活性2.蛋白磷酸酶活性PTEN能夠使粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)和接頭蛋白Shc去磷酸化，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移及浸潤，同時抑制MAPK(促細(xì)胞分裂素激活的蛋白激酶)信號傳導(dǎo)通路來抑制細(xì)胞分化。第27頁/共49頁PTEN的作用機制三種：1.三磷脂酰肌醇途徑（PIP3途徑）2.FAK途徑3.絲裂原激活的蛋白激酶途徑（MAPK途徑）

第28頁/共49頁三磷脂酰肌醇途徑（PIP3途徑）脂質(zhì)PIP3是一種全新的磷酸酶作用的靶分子，位于細(xì)胞膜上，是細(xì)胞生長因子的信號轉(zhuǎn)遞分子。PTEN編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶的活性，可使PIP3去磷酸化，阻止PI3K調(diào)控的生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低PIP3水平而使細(xì)胞停止于G1期，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

IsabelleOpitz等研究PTEN的表達(dá)缺失與間皮瘤的關(guān)系時，證明其與PI3K-AKT/PKB通路有關(guān)。merH.Yilmaz,SeanJ.Morrison研究表明，抑制PTEN可以在PI3K/AKT通路對白血病腫瘤細(xì)胞和正常造血干細(xì)胞產(chǎn)生相反的影響。第29頁/共49頁FAK途徑局灶黏附激酶(focaladhesionkinase,FAK)幾乎位于所有細(xì)胞的細(xì)胞膜，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附。整合素通過與細(xì)胞外基質(zhì)作用而被活化，導(dǎo)致FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加其磷酸激酶的活性，F(xiàn)AK再作用于絲氨酸、蘇氨酸激酶(MAPK)和磷酸酶，最終導(dǎo)致某些關(guān)鍵因子磷酸化水平的改變及相關(guān)基因的表達(dá)。第30頁/共49頁絲裂原激活的蛋白激酶途徑（MAPK途徑）絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)可激活促細(xì)胞分裂素，介導(dǎo)有絲分裂信號向胞核傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞生長。PTEN能抑制MAPK途徑上游中的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)、RAS的活化以及Shc的磷酸化，從而對ERK/MAPK信號途徑起負(fù)調(diào)節(jié)作用，而且PTEN基因還能抑制MAPK激酶的磷酸化，阻滯細(xì)胞生長周期于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞生長。SukmiKang-Park等研究表明，在HCC形成過程中，PTEN通過阻斷PKC，MAPK以及MAPK激酶，最終降低IGF-II的表達(dá)。第31頁/共49頁p16p16，又稱MTS1(mulitipletumorsuppressergenel)，在細(xì)胞周期調(diào)控中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，防止細(xì)胞過度增殖，是一種與凋亡相關(guān)的腫瘤抑癌基因。HCC組織中存在p16基因的異常及p16蛋白的表達(dá)缺失，p16在HCC的致病機制中發(fā)揮重要作用。p16基因的異常包括基因突變、雜合性缺失和純合性缺失、基因的高甲基化。第32頁/共49頁p16基因突變與HCCp16基因缺失與HCCp16甲基化與HCC第33頁/共49頁轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）在人原發(fā)性肝癌中,轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）基因轉(zhuǎn)錄嚴(yán)重受阻遏。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白又稱為前白蛋白（prealbumin,PA）,維生素A轉(zhuǎn)運蛋白，分子量大約為54kD，由4個相同的亞單位組成。TTR主要由肝細(xì)胞合成。在肝實質(zhì)受損傷的機型肝炎、慢遷肝炎等病人血清中TTR含量明顯降低，肝損傷越嚴(yán)重，降低越明顯。在肝實質(zhì)損傷不明顯的原發(fā)性肝癌病人血清中TTR含量也明顯下降。第34頁/共49頁TTR的突變與中暑圣經(jīng)系統(tǒng)的廣泛淀粉樣病變相關(guān)，TTR的突變與原發(fā)性肝癌相關(guān)，發(fā)現(xiàn)了在原發(fā)性肝癌中TTR低表達(dá)，但在正常肝中高表達(dá)。第35頁/共49頁免疫基因第36頁/共49頁免疫基因治療腫瘤是應(yīng)用分子生物學(xué)的方法,將與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞,使其在機體表達(dá)分泌細(xì)胞因子或利用其基因增強腫瘤細(xì)胞的免疫原性和(或)免疫系統(tǒng)的功能。腫瘤的免疫基因治療,可獲得細(xì)胞因子腫瘤局部的高表達(dá)。第37頁/共49頁細(xì)胞因子基因?qū)胄?yīng)細(xì)胞細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞共刺激分子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞主要組織相容復(fù)合體(MHC)基因?qū)肽[瘤細(xì)胞第38頁/共49頁細(xì)胞因子基因?qū)胄?yīng)細(xì)胞第39頁/共49頁細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞是通過細(xì)胞因子受體基因轉(zhuǎn)染的方法,使腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的細(xì)胞因子受體表達(dá)增多,使對腫瘤細(xì)胞有直接生長抑制或殺傷作用的細(xì)胞因子表達(dá)增多,從而大大增強細(xì)胞因子的抗腫瘤效果。第40頁/共49頁共刺激分子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞細(xì)胞的激活需要雙信號,一類是特異的抗原提呈信號,另一類是非特異性的,非主要組織相容復(fù)合物(MHC)限制的共刺激信號,包括B淋巴細(xì)胞激活抗原分子(B7)、細(xì)胞間黏附分子(ICAMs)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(LFA23)、血管內(nèi)皮黏附分子(VCAM21)、熱穩(wěn)定抗原(HAS)等,在這些共刺激分子中,最重要的、研究最多的是B7分子。Schen2del等將B7-1共刺激分子基因?qū)肴税┘?xì)胞株制備成瘤苗,這些經(jīng)過共刺激分子基因修飾的腫瘤細(xì)胞不僅能誘導(dǎo)CTL增殖,并能有效地引起腫瘤細(xì)胞的溶解。第41頁/共49頁主要