代謝調(diào)節(jié)與代謝工程

代謝調(diào)節(jié)與代謝工程第1頁/共63頁23.5.1代謝工程概述細(xì)胞的生命活動(dòng)是通過活細(xì)胞和細(xì)胞群的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的，而代謝網(wǎng)絡(luò)是由一系列酶的級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)以特異性的膜轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)成。對(duì)人類的應(yīng)用而言，活細(xì)胞自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性并不是最佳的，為了積累大量的某種代謝產(chǎn)物，就必須要打破并重建細(xì)胞的代謝平衡。第2頁/共63頁3代謝工程概念演變代謝工程又稱途徑工程，最早由美國(guó)加州理工學(xué)院化學(xué)工程系教授BailyJ.E.于1991年提出的。隨后Stephanopoulos認(rèn)為，代謝工程是一種提高菌體生物量功代謝物產(chǎn)量的理性化方法。Cameron認(rèn)為代謝工程是動(dòng)用重組DNA技術(shù)有目的地改造中間代謝的方法。現(xiàn)在的定義：通過某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向改善細(xì)胞的特性或運(yùn)用重組DNA技術(shù)來創(chuàng)造新的化合物。第3頁/共63頁4第4頁/共63頁5代謝工程要解決的問題目前代謝工程要解決的主要問題是改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)在不同途徑中的流量分布。典型目標(biāo)是修飾初級(jí)次級(jí)代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的理想載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。第5頁/共63頁6主要應(yīng)用方向(1)提高細(xì)胞現(xiàn)存代謝途徑中天然產(chǎn)物的產(chǎn)量；(2)改造細(xì)胞現(xiàn)存的代謝途徑，使其合成新產(chǎn)物，這種新產(chǎn)物可以是中間代謝產(chǎn)物或修飾型的最終產(chǎn)物；(3)對(duì)不同細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行擬合，構(gòu)建全新的代謝通路，從而產(chǎn)生細(xì)胞自身不能合成的新產(chǎn)物；(4)優(yōu)化細(xì)胞的生物學(xué)特性，如：生長(zhǎng)速率、極端環(huán)境條件和耐受性等。第6頁/共63頁7代謝工程研究思路解析反應(yīng)體系，找到能反映細(xì)胞生理狀態(tài)的主要參數(shù)；如何利用這些信息組織一個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的控制設(shè)計(jì)，并確定合理靶點(diǎn)以修飾構(gòu)建特定的物種；怎樣正確評(píng)估基因或酶的真實(shí)修飾效果，以實(shí)施新一輪的代謝網(wǎng)絡(luò)修飾直到確立最佳狀態(tài)，從而取代普通的定向靶點(diǎn)篩選程序；

代謝工程關(guān)注的是代謝途徑的組合而不是單一的反應(yīng)，因此必須考察完整的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，重視代謝網(wǎng)絡(luò)和目標(biāo)產(chǎn)物的熱力學(xué)可行性，代謝流及其控制。

代謝工程最為突出的特征是強(qiáng)調(diào)生化反應(yīng)途徑與代謝流及其體內(nèi)條件的控制相關(guān)聯(lián)。第7頁/共63頁8代謝工程的首要工作就是利用在廣泛而深入的研究中獲得的技術(shù)信息進(jìn)行組合設(shè)計(jì)。將代謝流的定量分析方法與代謝流控制的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合在一起，系統(tǒng)、合理地修飾生物細(xì)胞的遺傳性狀，是代謝工程的基礎(chǔ)。第8頁/共63頁9系統(tǒng)研究代謝流及其控制機(jī)制包括以下三大基本步驟①建立一種能盡可能多的觀察代謝網(wǎng)絡(luò)并測(cè)定其流量的方法。為了做到這一點(diǎn)，通常從測(cè)定細(xì)胞外代謝產(chǎn)物的濃度入手進(jìn)行簡(jiǎn)單的物料平衡。由于一個(gè)代謝途徑的代謝流并不等于該途徑中一個(gè)或多個(gè)酶的活性，所以酶法分析并不能提供代謝網(wǎng)絡(luò)真正的代謝流信息，除非相應(yīng)的酶在體外分析條件下存在并具有活性。因此，在代謝分析中，酶法分析常會(huì)錯(cuò)誤地顯示相似數(shù)量級(jí)的代謝流，從而導(dǎo)致產(chǎn)生不正確的結(jié)論。第9頁/共63頁10②在代謝網(wǎng)絡(luò)中施加一個(gè)已知的擾動(dòng)，以確定在系統(tǒng)松散之后達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時(shí)的代謝流。常用的擾動(dòng)方式包括啟動(dòng)子的誘導(dǎo)、底物流加、特定碳源消除或物理因素變化等。雖然任何有效的擾動(dòng)對(duì)代謝流的作用都是可以接受的，但擾動(dòng)必須定位于近鄰?fù)緩焦?jié)點(diǎn)的酶分子上。一種擾動(dòng)往往能提供多個(gè)節(jié)點(diǎn)上的相關(guān)信息，這對(duì)于精確描述代謝網(wǎng)絡(luò)控制結(jié)構(gòu)所必需的最小實(shí)驗(yàn)量是至關(guān)重要的。第10頁/共63頁11③要系統(tǒng)分析代謝流擾動(dòng)的結(jié)果。如果某個(gè)代謝流的擾動(dòng)對(duì)下游代謝流并未能造成可觀察的影響，那么就可以認(rèn)為該處的節(jié)點(diǎn)對(duì)上游的擾動(dòng)是剛性的，相反則成為柔性的。一般地，在剛性節(jié)點(diǎn)處，不能通過改變上游酶活性來影響下游代謝流。第11頁/共63頁12二、代謝工程的研究?jī)?nèi)容代謝工程涉及的主要內(nèi)容包括：①生物合成相關(guān)代謝調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)理論；②代謝流的定量分析；③代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計(jì)；④中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析；⑤基因操作。第12頁/共63頁131代謝網(wǎng)絡(luò)理論代謝網(wǎng)絡(luò)理論把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體而不是孤立地考慮。細(xì)胞代謝的網(wǎng)絡(luò)由上萬種酶催化的系列反應(yīng)系統(tǒng)、膜傳遞系統(tǒng)、信號(hào)傳遞系統(tǒng)組成，并且既受精密調(diào)節(jié)，又彼此互相協(xié)調(diào)。各種代謝都不是孤立進(jìn)行的，而是相互作用、相互轉(zhuǎn)化、相互制約的一套完整、統(tǒng)一、靈敏的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。第13頁/共63頁14節(jié)點(diǎn)：網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)。柔性節(jié)點(diǎn)：是指由節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流量分割率隨代謝要求發(fā)生相應(yīng)的變化，去除產(chǎn)物的反饋抑制后，該分支的代謝流量分割率大大增加。強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)：是指由節(jié)點(diǎn)流向某一分支或某些分支的代謝流量分割率是難以改變的，這是由產(chǎn)物的反饋抑制及對(duì)另一分支酶的反式激活的相互作用所致。弱剛性節(jié)點(diǎn)：是指介于前兩者之間，由該節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流中有一個(gè)是占主導(dǎo)地位的，其酶活較高或?qū)?jié)點(diǎn)代謝的親和力較大，且無反饋抑制，通過削弱主導(dǎo)分支的酶量或酶活可增加產(chǎn)物的產(chǎn)率。柔性及弱剛性節(jié)點(diǎn)是代謝設(shè)計(jì)的主要對(duì)象第14頁/共63頁15如果代謝網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)同等重要，即對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量具有相近的影響，則這類代謝網(wǎng)絡(luò)稱為依賴型代謝網(wǎng)絡(luò)。依賴型代謝網(wǎng)絡(luò)的存在會(huì)給代謝工程的實(shí)施帶來很大的困難。如果代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，則可以通過對(duì)代謝的修飾影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，這類網(wǎng)絡(luò)為獨(dú)立型網(wǎng)絡(luò)。第15頁/共63頁162代謝分析代謝分析是代謝工程的重要組成部分。它涉及代謝流的定量和定向、研究細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析等。代謝流分析是代謝分析的一個(gè)重要手段。它假定細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)、能量處于擬穩(wěn)態(tài)，通過測(cè)定胞外物質(zhì)濃度，再根據(jù)物料平衡計(jì)算細(xì)胞內(nèi)的代謝流。第16頁/共63頁17放射性標(biāo)記、同位素示蹤等技術(shù)的應(yīng)用使代謝流分析更簡(jiǎn)單、方便。通過對(duì)細(xì)胞在不同情況(如改變培養(yǎng)環(huán)境、去除抑制、增加或減少酶活等)的代謝流分析，便可確定節(jié)點(diǎn)類型、確定最優(yōu)途徑、估算基因改造的結(jié)果、計(jì)算最大理論產(chǎn)率等。對(duì)于簡(jiǎn)單的反應(yīng)系統(tǒng)，通過對(duì)所有的代謝網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)分析及平衡計(jì)算就可以得到滿意的結(jié)果。但是，對(duì)于比較復(fù)雜的代謝系統(tǒng)，代謝流分析就顯得棘手。第17頁/共63頁18

代謝中間產(chǎn)物作為生物合成的前體及能量供應(yīng)者，轉(zhuǎn)向終產(chǎn)物的碳流的大小將最終決定終產(chǎn)物的產(chǎn)率。中間代謝產(chǎn)物的代謝流改變會(huì)受到細(xì)胞的抑制，并引起胞內(nèi)功能的嚴(yán)重改變。傳統(tǒng)的代謝工程對(duì)中間產(chǎn)物的生理作用考慮較少，從而使產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到所計(jì)算的理論最大產(chǎn)率。第18頁/共63頁19彈性系數(shù)和流量控制系數(shù)是代謝控制分析研究的兩個(gè)主要指標(biāo)。彈性系數(shù)揭示代謝物濃度變化對(duì)反應(yīng)速率的影響程度。而流量控制系數(shù)則為單位酶變化量引起的某分支穩(wěn)態(tài)代謝流量的變化，用來衡量某一步酶反應(yīng)對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的控制程度。這兩個(gè)系數(shù)相互關(guān)聯(lián)，可直接或間接測(cè)定。第19頁/共63頁20細(xì)胞對(duì)于基質(zhì)的吸收與產(chǎn)物的釋放模型及分析也是代謝工程的重要組成部分。它包括物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的生化基礎(chǔ)(如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制、轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)中的能量偶連以及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)節(jié)等)、研究方法、過程控制(如生物工藝過程中營(yíng)養(yǎng)和吸收的關(guān)系、生物工藝過程中產(chǎn)物的分泌控制、干擾代謝流的結(jié)合以及轉(zhuǎn)運(yùn)過程的建模)等。第20頁/共63頁21代謝工程基本過程第21頁/共63頁223代謝工程的基本過程(1)代謝分析與代謝設(shè)計(jì)代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑，因此必須對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中的一些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研究和分析。相對(duì)隨機(jī)突變而言，代謝工程的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是工作具有定向性，因?yàn)樗谛揎棸悬c(diǎn)選擇、試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析方面占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。第22頁/共63頁23代謝分析與代謝設(shè)計(jì)對(duì)代謝工程的成敗起著關(guān)鍵作用，任何精細(xì)的靶點(diǎn)選擇都必須經(jīng)得起細(xì)胞生理特性以及代謝網(wǎng)絡(luò)熱力學(xué)平衡的檢驗(yàn)。第23頁/共63頁24(2)基因操作利用代謝工程戰(zhàn)略修飾改造細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的核心是在分子水平對(duì)基因簇進(jìn)行遺傳操作，其中最典型的形式包括對(duì)靶基因或基因簇的克隆、表達(dá)、修飾、敲除、調(diào)控、構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及重組基因在目的細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定整合。在代謝工程的一些應(yīng)用實(shí)例中，代謝流的控制和分析也可繞過基因操作，直接通過發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)的工藝和過程參數(shù)控制提高細(xì)胞代謝流，并強(qiáng)制使代謝流流向期望的目標(biāo)產(chǎn)物。第24頁/共63頁25(3)效果分析很多研究結(jié)果表明，一次性的代謝設(shè)計(jì)和基因操作往往并不能達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)所要求的產(chǎn)量、速率或濃度，因?yàn)榇蟛糠謱?shí)驗(yàn)涉及的只是與單一代謝途徑有關(guān)的基因、操縱子或基因簇的改變。然而通過對(duì)新途徑進(jìn)行全面的效果分析，根據(jù)由初步代謝操作所構(gòu)建出來的細(xì)胞所表現(xiàn)出的限制與缺陷，可以作為新一輪實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)目標(biāo)，如此反復(fù)進(jìn)行遺傳操作即可獲得優(yōu)良物種。第25頁/共63頁264代謝工程的研究手段代謝工程綜合了基因工程、微生物學(xué)、生化工程等領(lǐng)域的最新成果。因此，在研究方法和技術(shù)方面主要有下列三大常用手段：(1)檢測(cè)技術(shù)常規(guī)的化學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)手段都可用于代謝工程的研究。這包括：體內(nèi)確定代謝流的物料平衡的同位素標(biāo)記示蹤方法；表征酶促反應(yīng)進(jìn)程和性質(zhì)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析方法;測(cè)定同位素富集和關(guān)鍵代謝物相對(duì)分子質(zhì)量分布的光譜學(xué)方法(核磁共振、質(zhì)譜、液相色譜分析和氣相色譜分析等)；生物傳感器技術(shù)。根據(jù)這些檢測(cè)信息可以判斷和描述代謝流的基本狀態(tài)，并為細(xì)胞的代謝流及其控制分析提供翔實(shí)可靠的原始數(shù)據(jù)。第26頁/共63頁27(2)分析技術(shù)在獲得大量生化反應(yīng)基本數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和化學(xué)程學(xué)的研究方法并結(jié)合先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)，可以進(jìn)一步闡明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)特征與控制機(jī)理，以確定代謝改造的思路。這些分析手段包括能準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)流的穩(wěn)態(tài)法、展示代謝流控制過程的擾動(dòng)法、簡(jiǎn)化復(fù)雜代等提出的的組合法以及代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化技術(shù)等。第27頁/共63頁28(3)基因操作技術(shù)在代謝工程中，代謝網(wǎng)絡(luò)的操作實(shí)質(zhì)上可以歸結(jié)為基因水平上的操作。這個(gè)過程涉及幾乎所有的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如基因和基因簇的克隆、表達(dá)、調(diào)控，DNA的雜交檢測(cè)與序列分析，外源DNA的轉(zhuǎn)化，基因的體內(nèi)同源重組與敲除，整合型重組DNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定維持等。代謝工程技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要前提就是外源基因在所有生物物種（包括人體）中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的可行性，而這種可行性又在很大程度上依賴于各種載體和基因表達(dá)調(diào)控元件的開發(fā)。第28頁/共63頁295代謝改造思路代謝工程研究的重點(diǎn)在于改造代謝網(wǎng)絡(luò)，以便生產(chǎn)特定目的代謝產(chǎn)物或具有過量生產(chǎn)能力的工程菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。根據(jù)微生物的不同代謝特性，常采用改變代謝流、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑三種方法。第29頁/共63頁30(1)改變代謝途徑方法加速限速反應(yīng)增加限速酶的表達(dá)量，來提高產(chǎn)物產(chǎn)率。然而限速酶反應(yīng)的改變可能會(huì)給整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)帶來負(fù)面影響。改變分支代謝途徑流向提高代謝分支點(diǎn)某一分支代謝途徑酶活力，使其在與其它的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。第30頁/共63頁31(2)擴(kuò)展代謝途徑在宿主菌中克隆和表達(dá)特定外源基因，從而延伸代謝途徑，以生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物和提高產(chǎn)率。擴(kuò)展代謝途徑還可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來不消耗的底物。(3)轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途通過轉(zhuǎn)移代謝途徑、構(gòu)建新的代謝途徑等方法來實(shí)現(xiàn)。第31頁/共63頁32三、代謝工程發(fā)展趨勢(shì)傳統(tǒng)的代謝工程是以代謝網(wǎng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，以代謝分析和代謝改造為主要手段。代謝途徑的復(fù)雜性給檢測(cè)分析帶來不少麻年代末興起的逆世紀(jì)煩，在某種程度上阻礙了它的應(yīng)用。

逆代謝工程限制活性的因素鑒別表型基因菌種改造第32頁/共63頁33代謝工程有關(guān)術(shù)語

(1)

途徑是指催化總的代謝物的轉(zhuǎn)化、信息傳遞和其他細(xì)胞功能的酶促反應(yīng)的集合。(2)代謝網(wǎng)絡(luò):分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜輸送體系的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。(3)通量:物質(zhì)或信息通過途徑被加工的速率。第33頁/共63頁34(4)代謝主流：在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)，流量相對(duì)集中的代謝流叫做該條件下的代謝主流。代謝途徑的延伸和剪接都可能改變代謝主流，從而實(shí)現(xiàn)新基質(zhì)的利用和新產(chǎn)品的開發(fā)。代謝主流的流量測(cè)定是代謝工程的重要組成部分。

(5)載流途徑：代謝主流流經(jīng)的代謝途徑為主要載流途徑，簡(jiǎn)稱載流途徑。在代謝工程領(lǐng)域，是指碳流在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過的主要途徑，即生產(chǎn)所需產(chǎn)物期間讓碳流相對(duì)集中流向產(chǎn)物合成的途徑。第34頁/共63頁35(7)代謝主流的變動(dòng)性和選擇性：微生物的代謝主流處于不斷變化之中，其方向、流量甚至代謝主流的載流途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動(dòng)性和代謝主流對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的選擇性。這種變動(dòng)和選擇的根據(jù)在于微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。第35頁/共63頁362代謝物流及相關(guān)特性(1)代謝物流與酶的關(guān)系代謝反應(yīng)的速率與細(xì)胞內(nèi)酶和代謝物的濃度有關(guān)。在代謝工程中把酶促反應(yīng)看成是代謝系統(tǒng)的基本組成，而把基因、酶的水平、代謝物濃度、抵制機(jī)制、效應(yīng)物、抑制劑、激活劑、環(huán)境條件等的影響看成是對(duì)酶促反應(yīng)的擾動(dòng)。因此，可以結(jié)合酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)描述代謝網(wǎng)絡(luò)特性。第36頁/共63頁37XACBJAJBJCSBSCSA具有一個(gè)分支點(diǎn)的簡(jiǎn)單代謝途徑第37頁/共63頁38Cx=C1時(shí)，X濃度變化對(duì)反應(yīng)B、C速率無響應(yīng)；Cx=C3時(shí)，反應(yīng)B、C速率對(duì)X濃度變化的響應(yīng)相同此上兩種現(xiàn)象即稱X處的分支點(diǎn)為剛性節(jié)點(diǎn)。CX=C2時(shí)，X濃度微小變化將對(duì)B、C反應(yīng)速率造成不同的影響，VA與VB+VC交點(diǎn)處的濃度稱為穩(wěn)態(tài)濃度。X濃度VB+VC穩(wěn)態(tài)濃度第38頁/共63頁39結(jié)論：

典型的物流與酶量之間的關(guān)系大致呈雙曲線形。第39頁/共63頁40(2)物流限制作用的克服代謝途徑存在著固有的限速步驟，它們控制著流經(jīng)代謝途徑的代謝物流，其主要特征表現(xiàn)在：①限速步驟的反應(yīng)速度很低，整個(gè)系統(tǒng)的代謝物流取決于催化該反應(yīng)步驟的酶活性；②限速步驟直接受制于該步驟酶活性和酶蛋白合成的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法：(a)等量提高所有酶的量；(b)提高限速酶的量。鑒別出具有高的流量控制系數(shù)的酶比超表達(dá)個(gè)別酶往往能獲得更好的結(jié)果。第40頁/共63頁41(3)反饋抑制與限制流在代謝改造過程中，利用色氨酸類似物——5-甲基色氨酸分離抗色氨酸突變株，有利于色氨酸的生產(chǎn)。色氨酸合成途徑反饋抑制第41頁/共63頁42反饋抑制的特征①只有代謝的終產(chǎn)物或它的結(jié)構(gòu)類似物具有反饋抑制作用；②受抑制的一般是代謝途徑的第一個(gè)酶；③反饋抑制作用是可逆的。由于這種抑制作用的可逆性，所以細(xì)胞才具有調(diào)節(jié)代謝的作用。第42頁/共63頁43消除反饋抑制作用的主要效果在于增加代謝中間體的濃度，而對(duì)物流的影響很小。

超表達(dá)單個(gè)酶不能增加代謝物流。大量研究結(jié)果表明，物流的控制分布在多個(gè)酶上，在任何情況下解除單個(gè)酶的反饋抑制作用是有限的，特別是在途徑起點(diǎn)受反饋抑制的酶是物流控制不敏感之處，盡管它對(duì)代謝物的濃度有很大的影響。想通過單個(gè)酶來提高代謝途徑的物流是行不通的，除非此酶具有很高的流量控制系數(shù)。第43頁/共63頁443代謝途徑分析第44頁/共63頁45依賴型網(wǎng)絡(luò)中，若要提高目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，則這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的流量分配必須同時(shí)改變。獨(dú)立型網(wǎng)絡(luò)，節(jié)形成的方向改變，能在某點(diǎn)①或②處的流量分配朝有利于產(chǎn)物種程度上提高其產(chǎn)率。網(wǎng)絡(luò)的剛性程度最終取決于將主要節(jié)點(diǎn)的流量分布轉(zhuǎn)變成最適于產(chǎn)物形成的流量分布的難易程度。第45頁/共63頁46主要節(jié)點(diǎn)剛性的評(píng)估若能獲得細(xì)胞生物化學(xué)代謝網(wǎng)絡(luò)圖表中全部詳細(xì)的酶促動(dòng)力學(xué)表達(dá)式，便可建立一個(gè)相關(guān)的代謝數(shù)學(xué)模型，對(duì)主要節(jié)點(diǎn)的剛性進(jìn)行分析判斷。但此以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)的判斷是有局限性的，因?yàn)樗婕暗募?xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的信息往往不很詳細(xì)。代謝撓動(dòng)首先測(cè)定網(wǎng)絡(luò)主要節(jié)點(diǎn)在穩(wěn)定狀態(tài)下的流量分配，然后對(duì)該系統(tǒng)施加一個(gè)有效的擾動(dòng)，再以相同的程序測(cè)定新穩(wěn)定態(tài)下所達(dá)到的流量分配。仔細(xì)比較兩者即可獲得節(jié)點(diǎn)剛?cè)嵝缘挠嘘P(guān)信息。只有建立在節(jié)點(diǎn)剛性評(píng)估上提出的代謝途徑改造和操作方案，才是合理有效的。第46頁/共63頁473.71.116.1代謝途徑中的代謝流量分配率胞外積累的代謝流量分配率釀酒酵母代謝通量分析15.836.9葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油酸磷酸二羥丙酮甘油+磷酸1,3-二磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙醇10095.879.1105.526.152.7105.589.752.896.3(a)典型實(shí)驗(yàn)條件下的代謝分配圖第47頁/共63頁483.30.94.6代謝途徑中的代謝流量分配率胞外積累的代謝流量分配率釀酒酵母代謝通量分析15.361.5葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油酸磷酸二羥丙酮甘油+磷酸1,3-二磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙醇10095.891.2105.611.176.8105.690.328.896.7(b)平衡條件下的代謝分配圖第48頁/共63頁490050代謝途徑中的代謝流量分配率胞外積累的代謝流量分配率釀酒酵母代謝通量分析00葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油酸磷酸二羥丙酮甘油+磷酸1,3-二磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙醇10010050100500100100100100(c)1,6-二磷酸果糖最大產(chǎn)率時(shí)的代謝分配圖第49頁/共63頁502主要柔性節(jié)點(diǎn)的判斷(1)葡萄糖-6-磷酸節(jié)點(diǎn)(非剛性)葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖10095.694.487.1(0.59)4.41.27.3葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖10094.993.577.5(1.3)8.11.116.1代謝途徑中的代謝流量分配率胞外積累的代謝流量分配率括號(hào)中的值為代謝途徑的整體量Mg2+對(duì)釀酒酵母糖酵解代謝能量的影響不添加Mg2+添加50mmol/lMg2+第50頁/共63頁51(2)1,6-二磷酸果糖節(jié)點(diǎn)(非剛性)葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖10098.998.682.5(1.04)1.10.316.1葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖10098.898.481.9(1.68)1.20.416.5添加0.05mmol/lEDTA添加30mmol/lNH4Cl葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖10095.694.487.1(0.59)4.41.27.3第51頁/共63頁521,6-二磷酸果糖的大量積累的實(shí)現(xiàn)葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油酸磷酸二羥丙酮甘油+磷酸1,3-二磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙醇10098.4981.60.441.956.144.112100.2100.297.99.72.388.2實(shí)驗(yàn)中添加K+用于激活磷酸解酮酶，添加NH4+解除ATP濃度過高對(duì)磷酸激酶產(chǎn)生的抑制作用，使1,6-二磷酸果糖在合成初期能夠快速積累，從而提高磷酸解酮酶的活性，同時(shí)，減少流向甘油的流量。磷酸解酮酶丙酮酸脫羧酶NADNADH乙醇脫氫酶NAD+NADH第52頁/共63頁534代謝設(shè)計(jì)原理一、在現(xiàn)存代謝途徑中改變目的產(chǎn)物代謝流增加目的產(chǎn)物代謝流從以下方面入手：

1增加限速酶編碼基因的拷貝數(shù)沒有改變代謝流，只是增加了酶的量，提高了中間物的濃度，從而提高限速反應(yīng)的反應(yīng)速率。

第53頁/共63頁54α-氨基己二酸頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建

中間產(chǎn)物克隆了編碼脫乙酰氧基頭孢霉素C合成酶基因cefEF青霉素N頭孢霉素C限速步驟所得轉(zhuǎn)化子頭孢霉素C產(chǎn)量提高了25％，而青霉素N的積累量減少至原來的1/16。

第54頁/共63頁554代謝設(shè)計(jì)原理2強(qiáng)化以啟動(dòng)子為主的關(guān)鍵基因的表達(dá)系統(tǒng)可以提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率Xanthomonascampestris強(qiáng)化表達(dá)黃原膠合成基因3提高目標(biāo)途徑激活因子的合成速率第55頁/共63頁激活因子是生物體內(nèi)基因表達(dá)的開關(guān),它的存在和參與往往能觸發(fā)基因的正常轉(zhuǎn)錄,因此提高激活因子的合成理論上能促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)。

在