分子標記技術

關于分子標記技術第一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日DNA指紋分析研究是一種重要的分子標記技術，它包括RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）、RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）、AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）、SSR（simplesequencerepeat）和ISSR（inter-simplesequencerepeat）等這些在PCR基礎上發(fā)展起來的檢測DNA多態(tài)性的分子標記技術。第二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

分子標記的優(yōu)越性表現(xiàn)為：（1）分子信息是可遺傳的，而只有在遺傳上可傳遞的屬性才能提供評估系統(tǒng)發(fā)育的信息；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）分子標記能提供共同的尺度；（4）分子數(shù)據(jù)能將從共同祖先遺傳下來的同源性和由于趨同進化從不同祖先演變而來的相似性區(qū)分開來表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；（5）任何生物有機質包括動物、植物和微生物有許多共同的分子屬性，因此分子數(shù)據(jù)可提供共同尺度來直接比較任何有機體任何分類層次之間相對水平的遺傳變異；（6）分子標記技術可應用于各個生物門類，并都可用于比較和綜合分析。第三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日分子標記的選擇理想的分子標記應該符合的標準是：多態(tài)性高；共顯性遺傳，在二倍體生物中能區(qū)分純合與雜合狀態(tài)；在基因組中頻繁出現(xiàn)，甚至貫穿分布于整個基因組；選擇中性；容易獲得；容易操作，自動化程度高；重復性好；所獲得的數(shù)據(jù)能進行交流和比較。第四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日二、蛋白質標記在蛋白質多態(tài)性研究基礎上發(fā)展起來的分子標記技術稱為蛋白質標記，最常用的技術是蛋白質電泳及與其配套的專一性染色，如曾經(jīng)廣為采用的等位酶分析，是通過同一基因位點上不同等位基因編碼的同種酶的不同分子形式，使得酶譜分析具有相關的遺傳學意義，酶譜的變化反應了等位基因和位點的變化。等位酶技術為植物的種群遺傳學和進化研究作出了重要的貢獻。但由于等位酶缺乏足夠的變異，在技術上存在一定的局限性，如今已逐漸被DNA標記所取代。第五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日三、DNA分子標記的種類

分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術，包括：★限制性片段長度多態(tài)性標記（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,簡稱RFLP標記）；★DNA指紋技術（DNAFingerprinting）；★原位雜交（insituhybridization）等；第六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

第二類是以聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction,簡稱PCR反應）為核心的分子標記技術，包括：

★隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RandomamplificationpolymorphismDNA,簡稱RAPD標記）；★簡單序列重復標記（Simplesequencerepeat,簡稱SSR標記）或簡單序列長度多態(tài)性（Simplesequencelengthpolymorphism,簡稱SSLP標記）；★擴展片段長度多態(tài)性標記（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,簡稱AFLP標記）；★序列標簽位點（Sequencetaggedsites,簡稱STS標記）；★序列特征化擴增區(qū)域（Sequencecharacteredamplifiedregion,簡稱SCAR標記）等；第七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

第三類是一些新型的分子標記，如：★單核苷酸多態(tài)性（Singlenuleotidepolymorphism,簡稱SNP標記）；★表達序列標簽（Expressedsequencestags,簡稱EST標記）等。第八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日四、分子標記的特點（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；（5）許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。第九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

一）限制性片段長度多態(tài)性標記（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

該技術由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。

由于DNA分子中限制性內切酶酶切識別序列中出現(xiàn)堿基的插入、缺失、置換、倒位而導致酶切位點的增減所引起的基因型限制性片段長度的差異。

五、常用的分子標記第一類分子標記以分子雜交為核心的分子標記技術第十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA用已知的限制性內切酶消化后，產生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉移到硝酸纖維膜上，用放射性標記的探針與膜上變性的酶切DNA進行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間的RFLP。

基本原理第十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日基本步驟：DNA提取→用DNA限制性內切酶消化

→凝膠電泳分離限制性片段

→將這些片段按原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上

→用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱Southern雜交）

→放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。

第十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日動植物生物體由不同的器官和組織構成。應選用生物體中生長旺盛的器官、組織和細胞提取DNA，如植物幼苗或新長出的葉片、動物的血等。DNA提取的效果由DNA的質量和得率來評價。選用適當?shù)纳锲鞴俸徒M織是獲得高質量和高得率DNA的保證。取樣后應盡快在低溫中保存，長時間保存應在超低溫中保存。生物體樣品的選取第十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日作為DNA提取的開始，多細胞的生物體樣品首先需要經(jīng)過研磨，使樣品破碎。然后樣品粉末再通過裂解液把細胞裂解。裂解液通常是由TrisTris（hydroxymethyl）aminomethane，即三羥基甲基氨基甲烷緩沖液加裂解劑組成，如SDS（Sodiumdodecylsulfate）即十二烷基磺酸鈉、CTAB（Hexadecyltrimethylammoniumbromide）即十六烷基三甲基溴化銨等。細胞的裂解第十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

通常使用能使蛋白質變性的試劑，如醋酸鉀、醋酸鈉、氯仿等。

通常使用RNA酶。蛋白質的沉淀RNA的消化第十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日通常使用冰凍的異丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。

通常使用TE緩沖液（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0，滅菌）。EDTA（didodiumethylenediaminetetra-acetate）即乙二胺四乙酸。

DNA沉淀DNA溶解第十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日電泳用的凝膠由瓊脂糖（agarose）制備，瓊脂糖的濃度通常為0.9-1.0%。酶切后的DNA樣品通過電泳，使DNA片段分離,并按分子量的大小排列。電泳第十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日DNA從凝膠轉移到特制的雜交膜上，常用HybondN+（Amersham）的尼龍膜。

凝膠的處理：脫嘌呤處理：0.25MHCl變性處理：0.4MNaOH

DNA轉移：轉移液：0.4MNaOH。洗膜：洗膜液：2xSSC緩沖液

雜交膜的制備第十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日用于RFLP分析的探針（probe）是DNA片段，長度約0.5-2.5kb。探針的來源有：基因組的隨機片段、cDNA等。探針以克隆的方式保存，以質粒（plasmid）為載體，如pUC19等，通過大腸桿菌繁殖。第十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日用作載體的質粒必須具備三個特性：

一個復制起始點（Ori）；

一個顯性的選擇標記，如氨芐青霉素（ampicillin）抗性基因（Ampr）；

單一的限制性酶切位點。載體第二十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日第二十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日利用放射性同位素（32P-dCTP）等對探針進行標記，以跟蹤探針。同位素標記：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA復制的過程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。探針的標記(labeling)第二十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日雜交液+鮭精DNA(shearedsalmonspermDNA,SSSDNA)雜交液: 20XSSPE 250ml 100XDenhardt’s 50ml 10%(w/v)SDS 50ml Makeupto 1000ml

65C保溫，2小時以上。預雜交第二十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日 A.2XSSC,0.1%SDS,65C,20min; B.1XSSC,0.1%SDS,65C,20min; C.0.5XSSC,0.1%SDS,65C,20min把已標記的探針加入到雜交液中，加入經(jīng)預雜交的雜交膜。65C保溫，過夜。雜交洗膜第二十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日用塑料薄膜把已雜交的雜交膜包起來。放入暗盒中。

放入X光片，緊壓。-80C冷柜中曝光2-4天。

在暗房中取出X光片，顯影、定影、沖冼。包膜照射顯影第二十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

A無表型效應，RFLP標記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。BRFLP標記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應，因而互不干擾。DRFLP標記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制。EDNA需要量大，檢測技術繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中。在植物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉換成以PCR為基礎的標記。RFLP優(yōu)點

第二十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

但RFLP分析需要比較完善的包括多種酶切、標記、分子雜交等技術的實驗室，加上工作量大、成本高以及放射性的問題，使其應用受到了一定的限制。第二十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日ABAB限制性內切酶位點與放射性探針結合部位①限制性內切酶酶切后；②電泳分離DNA片段；③轉移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針雜交，⑤分析陽性條帶第二十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

一）隨機擴增多態(tài)性

（randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）

RAPD是1990年由美國杜邦公司的科學家Williams和加利福尼亞生物研究所Welsh幾乎同時發(fā)展起來的建立在PCR基礎上的一種新型的DNA分子標記技術。第二類分子標記以聚合酶鏈式反應（PCR反應）為核心的分子標記技術第二十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日基本原理采用隨機合成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反應的引物，對所研究生物基因組DNA進行PCR擴增，經(jīng)過30－40個循環(huán)，即可得到大量的DNA片段，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、紫外下顯示RAPD帶紋。第三十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日由于整個基因組存在眾多反向重復序列，因此須對每一隨機引物單獨進行PCR。單一引物與反向重復序列結合。使重復序列之間的區(qū)域得以擴增。引物結合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導致擴增片段數(shù)目和長度的差異，導致PCR產物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產物增加或缺少，則產生RAPD標記。

第三十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日技術路線DNA的提取

PCR反應

凝膠電泳

選擇隨機引物

圖譜分析

第三十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日與RFLP的比較相同之處：都從瓊脂糖凝膠上DAN條帶的多態(tài)性來反映基因結構上的多態(tài)性；不同之處：RFLP用限制性內切酶消化DNA，通過分析限制性酶切片端的多態(tài)性，來顯示DNA的結構的多態(tài)性；而RAPD是利用PCR技術從擴增的DNA片段上分析多態(tài)性。由于片段被引物選擇地擴增，并不是所有序列都擴增，擴增了的片斷能在凝膠上清晰地顯現(xiàn)出來，這樣就可以通過同種引物擴增條帶的多態(tài)性，反映出模板的多態(tài)性。第三十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日與常規(guī)PCR的比較常規(guī)PCR需要兩個引物，每個引物分子15－30個核苷酸，引物順序根據(jù)擴增的基因兩端的順序設計，因而要進行PCR時，必需知道待擴增基因的順序；RAPD分析時，只需一個引物，長度10個核苷酸左右，引物順序是隨機的，因而可在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析。第三十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日（1）不需DNA探針，設計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實驗重復性較差，結果可靠性較低。RAPD標記的主要特點第三十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日RAPD的缺點

RAPD圖譜中某些弱帶重復性較差，而且目前該法在引物長度和序列及應用的引物數(shù)目、擴增反應條件等實驗技術方面未標準化，影響了不同條件下結果的可比性；每個標記含有的信息量??；有假陽性或假陰性結果；顯性標記，無法區(qū)分從一個位點擴增的DNA片段是純合的還是雜合的，無法進行等位基因分析。用在種以上類群間的比較時無法得到可靠的遺傳距離。第三十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日二）擴增片段長度多態(tài)性（Amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism,AFLP）AFLP是1993年由荷蘭科學家Zabeau等人將PCR與RFLP結合起來，創(chuàng)造了AFLP分析技術。AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多態(tài)性，其實質也是顯示限制性內切酶酶切片段的長度多態(tài)性，只不過這種多態(tài)性是以擴增片段的長度不同被檢測出來。

第三十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日基本原理首先用限制性內切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligonuleotideadapter）；然后根據(jù)接頭序列設計引物，由于限制性片段太多，全部擴增則產物難以在膠上分開，為此在引物的3’端加入1-3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴增產物分離開來。

第三十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日第三十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日技術路線（1）首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個堿基識別位點的限制性內切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。（2）酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。（3）DNA片段的預擴增。（4）在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。（5）PCR產物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。（6）多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。

第四十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日AFLP結合了RFLP與PCR技術的特點，兼具RFLP和RAPD兩種方法的特長，既繼承了RFLP的穩(wěn)定性，又具有了PCR反應快速、靈敏的特點，同時克服了RFLP和RAPD的缺點。采用少數(shù)幾對引物的多種組合即可獲得大量遺傳信息，避免了RAPD分子標記重復性差、假陽性反應過高等不利因素的影響，同時又無需任何目的基因組DNA的背景資料即可完成模板DNA多態(tài)性檢測，擺脫了RFLP的轉膜、克隆、探針制備、分子雜交等一系列繁重且又有一定難度的工作。第四十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日用AFLP分析的多態(tài)性是典型的孟德爾式遺傳和選擇中性。它可以用于遺傳分析的各個方面：如用于擬南芥屬連鎖圖的構建用于馬鈴薯的栽培種的鑒定等。AFLP也適于鑒定遺傳多樣性的物種親緣關系的研究。第四十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術所產生的標記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應產物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結果可靠；（5）目前該技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。AFLP特點第四十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日專利技術，試劑盒價格貴需要同位素或非同位素標記引物，須具特殊防護措施、配套儀器設備基因組的不完全酶切會影響實驗結果，所以實驗對DNA純度和內切酶的質量要求較高。缺點第四十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日應用

AFLP具有可靠性好，重復性強，可信度高等優(yōu)點，近年來廣泛應用于遺傳育種研究，在動物遺傳育種、動物基因組研究中有著廣泛的應用前景。構建遺傳連鎖圖譜利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標記AFLP輔助的輪回選擇育種利用AFLP技術研究基因表達與調控分類和進化研究甲基化研究第四十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日在AFLP技術的基礎上又發(fā)展了一種新的分子標記———TE2AFLP(三內切酶擴增的限制片段長度多態(tài)性,threeendonucleaseamplifiedfragmentlengthpolymorphism).該技術是由荷蘭科學家VanderWurff等在2000年末發(fā)表的.TE2AFLP也是首先擴增限制性內切酶片段,然后在高分辨率凝膠(通常為序列分析膠)上電泳分離這些擴增的片段,再根據(jù)這些片段的長度來檢測DNA多態(tài)性。與AFLP不同的是要用2種低頻率切點內切酶和1種高頻率切點內切酶混合酶切基因組DNA.TE2AFLP保留和發(fā)展了AFLP的優(yōu)點,克服了AFLP常見的缺點,具有可靠、快速和方便的特點.因此,它將廣泛地被應用。第四十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日三）簡單序列重復標記

（simplesequencerepeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)標記；屬高度重復序列，重復單元2~6bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復，重復區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG第四十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

由Moore等于1991年創(chuàng)立。SSR即微衛(wèi)星DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復。不同遺傳材料重復次數(shù)的可變性，導致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產生的基礎。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標記。

原理第四十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

微衛(wèi)星DNA一般位于內含子中，因此它在進化過程中受到選擇壓力較小，與其他分子標記相比，微衛(wèi)星在多態(tài)性，群體平均雜合度，以及群體間遺傳距離等方面，微衛(wèi)星位點值均高于蛋白質位點，用微衛(wèi)星作為遺傳標記更適合于這些方面的分析，同樣也更適于檢測個體間的差異，微衛(wèi)星DNA為共顯性遺傳，利用PCR及電泳檢測相對容易，也更便于實現(xiàn)自動化，可通過計算雜合度，較好的進行個體鑒定。第五十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

建立DNA文庫，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測定這些克隆的側翼序列，設計特異性引物來擴增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對遷移距離，便可知不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。技術路線第五十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

（1）數(shù)量幾乎無限，檢測出多態(tài)性的頻率極高；（2）SSR技術一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；（3）SSR標記為共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）結果重復性高，穩(wěn)定可靠。為了提高分辨力，通常使用可檢測出單拷貝差異的聚丙烯酰胺凝膠電泳；（5）兼具PCR反應的優(yōu)點，即所需DNA樣品量少，對DNA質量要求亦不苛刻。優(yōu)點必須事先知道微衛(wèi)星兩翼序列信息才能設計引物，對于許多物種需要構建文庫。這將給微衛(wèi)星標記的開發(fā)帶來一定的困難。缺點第五十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日應用SSR標記在數(shù)據(jù)上比前述分子標記能顯示出更多的多態(tài)性，已在遺傳疾病的診斷、構建遺傳圖譜、種質資源鑒定、基因定位及分子標記輔助育種、植物生態(tài)學和系統(tǒng)與進化研究等領域得到了廣泛的應用。微衛(wèi)星DNAPCR擴增結果（示例）500bp400bp300bp240bp

該結果顯示在所檢查的人群中，該位點多態(tài)性有四種。第五十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日四）微衛(wèi)星間隔（Intersimplesequencerepeat，ISSR）

Zietkiewiczetal.(1994)對SSR技術進行了發(fā)展，他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物，對基因組節(jié)段而不是重復序列本身進行擴增。在SSR的5端或3端加上2－4個隨機選擇的核苷酸，這可引起特點位點退火。這樣就能導致位于反向排列的間隔不太大的重復序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR(inter-simplesequencerepeat)。第五十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日基本原理用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4個隨機核昔酸，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的interSSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴增譜帶多為顯性表現(xiàn)。

第五十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日ISSR引物的開發(fā)不像SSR引物那樣需測序獲得SSR兩側的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標記。第五十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日目前，ISSR標記已廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態(tài)學研究中。但是由于不知道目的基因組DNA的背景資料，有一些ISSR引物可能在特定基因組DNA中沒有配對區(qū)域而無擴增產物。而且ISSR也是一種顯性標記，模板濃度需要較一致，最適反應條件需要一定時間摸索。第五十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日ISSR與RAPD技術很相似，引物和鎂離子濃度以及退火溫度明顯地影響擴增帶的式樣，Taq聚合酶的活性也會影響PCR擴增結果。一般來講所研究的基因組DNA越復雜，重復序列的密度越高，對引物的專一性要求就越高，運行PCR的條件也越嚴格。ISSR引物對Mg2+濃度的敏感度大于RAPD，由于引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈與退火溫度受二價陽離子的影響；游離的Mg2+用來增強DNA聚合酶的活性，它也可與dNTP中磷酸基結合，而Mg2+和dNTP在PCR擴增過程中相互作用，只有Mg2+和dNTP的濃度在合適范圍內，才能得到好的PCR擴增結果。第五十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日在PCR擴增反應中，退火溫度的影響最大。一般在運行ISSR－PCR時，采用48－52℃退火溫度都能得到好的擴增帶。Virketal的研究中退火溫度控制在39－59℃之間也能擴增出好的帶譜。但不同的引物在不同的物種中所需的退火溫度是不同的，對ISSR引物來說，可適當提高其退火溫度得到穩(wěn)定清晰的帶譜。第五十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

a.引物

PCR結果的特異性取決于引物的特異性，擴增產物的大小也是由特異引物限定的。因此，PCR所用引物質量要高，且需純化。PCR反應中引物的量也影響PCR擴增效果，當PCR引物量太低，則產物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導非特異產物合成，還會增加引物二聚體的形成。

PCR反應條件PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

第六十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

b.酶該酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應的總強度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應中，每100μl反應液中含1-2.5uTaqDNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產物產量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴增。TaqDNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。第六十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

c.dNTP四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應中dNTP含量太低，PCR擴增產量太少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導致聚合將其錯誤摻入，因此應當避免。第六十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

d.模板PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉錄成cDNA后才能進行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴增，處理不當或處理過程中DNA掉失都會導致PCR擴增失敗。采集標本方法不當，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導致擴增失敗。第六十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

e.Mg2+Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是TaqDNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度，產物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導致非特異性擴增產物的累積。第六十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日1.分子遺傳圖譜的構建

目前幾乎所有重要農作物，如擬南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構成，隨著多種標記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。遺傳圖譜對于基因定位至關重要，圖譜上包括的標記數(shù)越多，分布越均勻，則基因定位就越精細。高密度分子遺傳圖譜的繪制使一些植物的遺傳學研究取得了重大進展，并對分子標記輔助育種選擇技術和基因圖位克隆技術的發(fā)展產生了巨大的推動作用。

第一、二類分子標記的應用第六十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日2.遺傳多樣性與種質鑒定分子標記廣泛存在于基因組DNA的各個區(qū)域，數(shù)量巨大，通過對隨機分布于整個基因組的分子標記的多態(tài)性進行比較，就能夠全面評估研究對象的多樣性，并揭示其遺傳本質。利用遺傳多樣性的結果可以對種質進行聚類分析，進而了解其系統(tǒng)發(fā)育與親緣關系。而以分子標記為基礎的比較基因組研究則有利于探明近緣物種間的遺傳同源性以及物種起源等生命科學領域中的重要問題。第六十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日微衛(wèi)星標記等具有很高的多態(tài)性，可以用于鑒別同一物種的不同基因型，如Olufowote等選擇4個SSR標記即可有效地評估栽培稻內不同品種間的異質性；Guifford等用3個SSR標記就能區(qū)分21個蘋果品種。分子標記的這一特點還可用于鑒別品種的混雜情況和真假雜種的判斷等。第六十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日3.重要農藝性狀相關基因的定位

基因定位就是確定基因在染色體上的位置及與之相連鎖的分子標記，高密度分子遺傳圖譜的構建使基因定位工作變得相對容易。

目前已完成了重要作物大量控制農藝性狀表現(xiàn)如抗病性、抗蟲性、育性等的主基因的定位工作，為開展這些基因的分子育種奠定了基礎。第六十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日尤為重要的是分子標記技術為呈數(shù)量遺傳、易受環(huán)境條件影響的重要農藝性狀的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL圖譜繪制及大量復雜的數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析、運算工作已有多個配套的計算機軟件被開發(fā)出來。QTL的定位使得控制數(shù)量性狀的多基因被轉變成一個個獨立的“主基因”，便于進行遺傳操作，這無疑有利于對產量、生育期等性狀的定向改良。第六十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日4.分子標記輔助選擇

選擇是育種的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)育種對目標性狀多采用直接選擇的方法，但作物的許多農藝性狀不容易觀測或易受環(huán)境影響、表現(xiàn)不穩(wěn)定，直接選擇比較困難。而在完成基因的分子標記定位后，就可以通過連鎖標記對這些性狀進行間接選擇，從而提高它們的選擇效率。

第七十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日與傳統(tǒng)選擇相比，分子標記輔助選擇有許多顯著的優(yōu)點，主要體現(xiàn)在：（1）可以清除同一座位不同等位基因間或不同座位間互作的干擾，消除環(huán)境的影響；（2）在幼苗階段就可以對在成熟期表達的性狀進行鑒定，如果實性狀、雄性不育等；（3）可有效地對表型鑒定十分困難的性狀進行鑒定，如抗病性、根部性狀等；（4）共顯性標記可區(qū)分純合體和雜合體，不需下代再鑒定；（5）可同時對多個性狀進行選擇，開展聚合育種，快速完成對多個目標性狀的同時改良；（6）加速回交育種進程，克服不良性狀連鎖，有利于導入遠緣優(yōu)良基因。

第七十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日將分子標記輔助選擇應用于作物改良的實踐中，已取得一些實質性進展。如國際水稻所利用與Xa-4，xa-5，xa-13和Xa-21四個抗白葉枯病基因連鎖的STS標記輔助選擇，成功地將這四個基因以不同組合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白葉枯病水稻新品種。第七十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日5.重要農藝性狀的圖位克隆

圖位克?。∕ap-basedcloning）是近幾年隨著植物分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發(fā)展起來的一種新的基因克隆技術。利用分子標記輔助的圖位克隆無須事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表達產物是什么就可以直接克隆基因。第七十三頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日一）單核苷酸多態(tài)性

(singlenucleotidepolymorphism，SNP)1.定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標記（singlenucleotidpolymorphismSNP）。是第三代遺傳標記。第三類分子標記技術

以DNA序列分析為核心第七十四頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達1700萬個甚至更多。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內的SNP(codingsNP,cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。第七十五頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日SNP與RFLP和STR標記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。第七十六頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日第七十七頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日SNP的優(yōu)點(1)SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復的微衛(wèi)星位點相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。(5)易于進行自動化分析，縮短了研究時間。第七十八頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日日本研究人員最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。

第七十九頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

EST是cDNA的部分序列，平均長度為300~500bp，由大規(guī)模cDNA克隆一次測序得到，因此稱作表達序列標簽。通常是從已有的cDNA文庫中隨機取出幾百到幾千個克隆一次測

序產生。一般使用載體多克隆位點互補序列作為通用引物。一個EST代表生物體某種組織某一時期的一個表達基因。EST目前主要被用于尋找新基因和了解基因表達概況。二）表達序列標簽（expressedsequencetag，EST）第八十頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

一般步驟如下：建立組織或細胞的cDNA文庫→從文庫中隨機取出足夠量的cDNA克隆進行自動測序→生物信息學分析（即將所得的EST數(shù)據(jù)與dbEST等數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)比較，確定哪些代表已知基因、哪些代表未知基因）

→進一步分析未知基因或歸類分析全部EST以獲得組織或細胞的基因表達概況。第八十一頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

SRAP是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-basedamplifiedpolymorphism，SBAP）。三）相關序列擴增多態(tài)性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)第八十二頁，共九十頁，編輯于2023年，星期日

引物設計是SRAP分析的核心。SRAP標記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結合可譯框（ORFs）區(qū)域中的外顯子。運用CCGG序列就可特異擴增出包含這些組分的序列。

由于外顯子序列在不同個體中通常是保守的，這種低水平多態(tài)性限制了將它們做為標記的來源。由于內含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，富含AT的區(qū)域序列通常見