皮膚光變態(tài)反應試驗方法

——皮膚光變態(tài)反應試驗方法SkinPhotoallergyTest范圍本方法規(guī)定了動物皮膚光變態(tài)反應試驗的基本原則和試驗要求。本方法適用于化妝品原料和產品的皮膚光變態(tài)反應檢測。試驗目的本試驗用于評估與預測人體重復接觸化妝品原料及其產品，并在日光照射下引起皮膚光變態(tài)反應的可能性。定義3.1皮膚光變態(tài)反應（皮膚光過敏反應，SkinPhotoallergy）皮膚接觸受試物并經過紫外線照射，通過作用于機體免疫系統(tǒng)，誘導機體產生光致敏狀態(tài)，經過一定間歇期后，皮膚再次接觸同一受試物并在紫外線照射下，引起特定的皮膚反應，其反應形式包括：紅斑，水腫等。原理廣義的光敏性（Photosensitivity）包括光毒性（Phototoxicity，又稱為光刺激性，photoirritation）與光變態(tài)（Photoallergy）。皮膚光變態(tài)反應是一種細胞介導的由光激活的皮膚免疫性反應，是IV型過敏反應的特殊類型，系光感物質經皮吸收或通過循環(huán)到達皮膚后與吸收的光線在皮膚細胞層發(fā)生的不良反應。目前較為公認的原理為：光感物質吸收光能后成激活狀態(tài)，并以半抗原形式與皮膚中的蛋白結合成蛋白結合物，經表皮的郎罕氏細胞傳遞給免疫活性細胞，引起淋巴細胞致敏等免疫反應。致敏的淋巴細胞再次接觸同一抗原時釋放出淋巴因子，導致一系列有害反應。試驗的基本原則5.1實驗動物頸部去毛，通過多次皮膚涂抹誘導劑量的化妝品原料或產品后（可提前給予佐劑、皮膚損傷處理以增強敏感性）且多次暴露于一定劑量的紫外線下，誘導特定免疫系統(tǒng)（誘導階段），經過一定間歇期后，在動物背部去毛皮膚給予激發(fā)劑量的受試物后暴露于一定劑量的紫外線下，觀察實驗動物并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試物的皮膚反應強度。5.2實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境選用符合國家標準要求的成年雄性或雌性白色豚鼠，體重350g—500g，雌性動物應選用未孕或未曾產仔的。動物及實驗環(huán)境、飼料和飲水應符合國家相應標準。注意以合適的方式補充適量Vc。5.3動物試驗前準備試驗前動物要在實驗環(huán)境中適應3—5d。將動物隨機分為受試物組、陰性（溶劑）對照組、陽性對照組，誘導接觸開始24h前在動物頸部給動物備皮（去毛），避免損傷皮膚。試驗開始和結束時應記錄動物體重。5.4無論在誘導階段或激發(fā)階段均應對動物進行全面觀察包括全身反應和局部反應，并作完整記錄。試驗方法本試驗選用佐劑和角質剝離（AdjuvantandStrip）法。進行本試驗前，需通過預實驗排除受試物引起皮膚原發(fā)性刺激反應及光毒性的可能。6.1動物與分組動物分為受試物組，陽性對照組，陰性對照組；每組至少5只動物。如果試驗目的包含獲取受試物致敏強度值，并對受試物進行光致敏強度的分級，則每組至少需要10只動物。陰性對照組誘導階段在頸部備皮中央?yún)^(qū)域涂敷溶劑，30min后進行紫外線照射；陰性對照組激發(fā)階段在背部備皮區(qū)域3，4涂敷溶劑，涂敷30min后進行紫外線照射。激發(fā)階段豚鼠背部區(qū)域1為不涂敷不照射區(qū)，區(qū)域2為不涂敷僅照射區(qū)，區(qū)域3為涂敷不照射區(qū)，區(qū)域4為涂敷照射區(qū)（見圖2A）。6.2劑量水平誘導接觸階段的受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度，激發(fā)接觸階段的受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（2—3只）的預試驗獲得。受試物、陽性物、陰性對照的誘導與激發(fā)濃度選擇：通過預試驗，排除原發(fā)皮膚刺激性與光毒性后的合適的濃度。通常選取的陽性物在所選取的濃度下其致敏率應為輕度或中度。6.3陽性物陽性物選擇6-甲基香豆素或四氯代水楊酰苯胺（tetracholosalicylanilide，TCSA）。常用陽性物的溶劑為丙酮、乙醇或二者按一定比例的混合物。每次試驗均需設陽性對照物組。6.4增敏劑的配制本試驗以1:1（v/v）完全弗氏佐劑（FCA）與生理鹽水的混合乳劑作為誘導階段的增敏劑。6.5UV光源6.5.1光源選擇誘導階段與激發(fā)階段均選擇波長為320nm—400nm的UVA，如含有UVB，其劑量不得超過0.1J/cm2。光源可選用黑光燈管、超高壓汞燈加濾光片或其它符合以上條件的UVA光源。6.5.2照射劑量誘導階段與激發(fā)階段照射劑量均設為10.2J/cm2。6.5.3強度的測定用前需用輻射計量儀在實驗動物肩部（誘導階段）、背部（激發(fā)階段）照射區(qū)設數(shù)個點測定光強度（mW/cm2），以平均值計。6.5.4照射時間的計算：以照射劑量為10.2J/cm2為例，按下式計算照射時間。照射時間（min）=照射劑量（10200mJ/cm2）光強度[mJ/（cm2·s）]×60注：1mW/cm2=1mJ/cm2/sec6.6試驗步驟備皮正式試驗前l(fā)8h—24h將動物頸部皮膚去毛，去毛面積約為2cm×4cm，試驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。6.6.2光誘導階段的處理在動物頸部去毛區(qū)的四角分別皮內注射0.1mlFCA與生理鹽水的1:1（v/v）混合乳劑（只注射一次），然后在敷用區(qū)域以透明膠帶粘附并揭開，反復數(shù)次以剝去部分表皮角質層，再將受試物（陽性對照組、陰性對照組則涂抹陽性物或陰性（溶劑）對照物）約0.1ml（g）均勻開放涂抹在去毛區(qū)，30min后用UVA進行照射（照射劑量為10.2J/cm2，UVB劑量不得超過0.1J/cm2［試驗前用紫外輻照計在實驗動物頸背部照射區(qū)域測定光強度（mW/cm2），計算照射時間］，詳見圖1。去角質、開放涂布受試物、紫外照射的過程每天進行一次，共計進行5次。圖1光誘導階段的佐劑注射、受試物涂敷及紫外線照射示意圖6.6.3光激發(fā)階段的處理光誘導處理完成后兩周，提前18h—24h將豚鼠背部脊柱兩側皮膚區(qū)域去毛，去毛區(qū)每塊面積約為2cm×2cm，實際涂抹面積為1.5cm×1.5cm，共4塊去毛區(qū)（見圖2A）。將動物固定，在動物去毛區(qū)3和4涂敷0.02ml（g）受試物（陽性對照組、陰性對照組則涂抹陽性物或陰性（溶劑）對照物）（涂抹區(qū)域見圖2A）。如果受試物為化妝品產品，激發(fā)階段的最大涂敷量不超過0.2ml（g）。30min后，頸部去毛區(qū)和左側去毛區(qū)（1和3）用鋁箔覆蓋，無刺激性膠帶固定，右側去毛區(qū)（2和4）用UVA光源進行照射。受試物涂敷劑量濃度為經過預試驗得到的、允許進行恰當評價的濃度。光源為UV-A，照射劑量為10.2J/cm2。6.6.4觀察與評分光激發(fā)階段紫外照射后的24h與48h，肉眼觀察涂抹部位的皮膚局部反應，并評分。記錄光誘導階段紫外照射后的24h，肉眼觀察涂抹照射部位的皮膚局部反應，并評分。同時觀察動物的一般狀態(tài)、行為、體征等。必要時可對受試物涂抹部位皮膚進行組織病理學檢查。根據(jù)表1對每只動物皮膚反應評分。6.6.5結果評價（1）當受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應積分≥2時，判為該動物出現(xiàn)皮膚光變態(tài)反應陽性。（2）光致敏率的計算方法為受試組動物皮膚光變態(tài)反應陽性的動物數(shù)/總動物數(shù)×100%。根據(jù)光致敏率對受試物的光變態(tài)反應進行強度分級（表2）。（3）光變態(tài)反應試驗成立的判定：每組動物數(shù)設定為5只條件下，陽性組動物中皮膚光變態(tài)反應陽性動物數(shù)≥1只，且陰性（溶劑）對照組全部動物中無皮膚光變態(tài)反應陽性動物，判定該光變態(tài)反應試驗系統(tǒng)成立；每組動物數(shù)10只條件下，陽性組致敏率≥20%，且陰性對照組致敏率<10%時，判定該光變態(tài)反應試驗系統(tǒng)成立。（4）受試物光變態(tài)反應性的判定：每組動物數(shù)設定為5只條件下，受試物組動物中皮膚光變態(tài)反應陽性動物≥1只時，或每組動物數(shù)≥10只條件下，受試物組動物致敏率≥20%時，判定該受試物在該濃度下具有光變態(tài)反應性。（5）皮膚光變態(tài)反應試驗應根據(jù)比較對照組和受試物組的反應進行評價。陽性結果時應追加試驗，如：與已知陽性物質的比較試驗及用其他方法（不加佐劑）進行試驗，其中非損傷性試驗方法有利于進一步對光變態(tài)反應性進行評價。圖2光激發(fā)階段受試物涂抹與紫外照射示意圖表1光變態(tài)反應試驗皮膚反應評分標準皮膚反應評分紅斑和焦痂形成無反應0輕微的紅斑（勉強可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中毒-重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1中度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2嚴重水腫（皮膚隆起約1cm或以上）3最高積分7表2皮膚光變態(tài)反應試驗致敏強度分級*，#致敏率（%）等級致敏強度0—10=1\*ROMANI弱11—30=2\*ROMANII輕31—60=3\*ROMANIII中61—80=4\*ROMANIV強81—100=5\*ROMANV極強*：進行致敏強度分級時，每組動物數(shù)需增加到至少10只。#：致敏率是反