第5章色譜法引論 引論

本文格式為Word版，下載可任意編輯——第5章色譜法引論引論第五章色譜分析導(dǎo)論Chromatography,第一節(jié)概述Introduction,色譜法是一種重要的分開(kāi)分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用才能不同而達(dá)成分開(kāi)目的的。,一、歷史,Tswett研究植物色素分開(kāi)，提卓越譜法概念；

,,,,,,,,,,,,t,s,1941Martin和Synge提出液-液色譜理論；

,1952James和Martin進(jìn)展了氣相色譜；

,1956VanDeemter提出速率理論；

,1967Kirkland等研制高效液相色譜法；

,80年頭以后展現(xiàn)毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電動(dòng)色譜等一系列新的色譜分析方法。,色譜法的根本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：不動(dòng)的一相，稱(chēng)一為固定相；

另一相是攜帶樣品流過(guò)固定相的滾動(dòng)體，稱(chēng)為滾動(dòng)相。當(dāng)滾動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和布局上的差異，與固定相相互作用的類(lèi)型、強(qiáng)弱也有差異，在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。（一次）,,,色譜法分類(lèi),1．按兩相狀態(tài)分類(lèi)氣體為滾動(dòng)相－－氣相色譜（GC）：固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的液膜），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。

液體為滾動(dòng)相－－液相色譜（LC）。液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。

超臨界流體為滾動(dòng)相的稱(chēng)為超臨界流體色譜（SFC）通過(guò)化學(xué)回響將固定液鍵合到載體外觀，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱(chēng)化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）。,2．按分開(kāi)機(jī)理分類(lèi),組分在固定相上的吸附才能強(qiáng)弱不同－吸附色譜法。

組分在固定液（固定相）中溶解度不同－調(diào)配色譜法。

組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同－離子交換色譜法。

利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透－凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。

組分與固定相（固定化分子）的高專(zhuān)屬性親和力舉行分開(kāi)的技術(shù)稱(chēng)為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)分開(kāi)。,3．按固定相的形狀分類(lèi)固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱(chēng)為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱(chēng)為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。,,根據(jù)以上所述，將色譜法的分類(lèi)總結(jié)于下表,5－2色譜流出曲線(xiàn)及有關(guān)術(shù)語(yǔ)一．流出曲線(xiàn)和色譜峰,,二、基線(xiàn),是柱中僅有滾動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖18－3中O—t線(xiàn)。穩(wěn)定的基線(xiàn)理應(yīng)是一條水平直線(xiàn)。

三、峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線(xiàn)之間的垂直距離，以h表示，如圖18－3中B′A,四、留存值,1．死時(shí)間tM不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到展現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱(chēng)為死時(shí)間，O′A′。因不被固定相吸附或溶解，故其流速與滾動(dòng)相的滾動(dòng)速度相近。測(cè)定滾動(dòng)相平均線(xiàn)速ū時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算。,,,,2．留存時(shí)間tR試樣從進(jìn)樣開(kāi)頭到柱后展現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所體驗(yàn)的時(shí)間，稱(chēng)為留存時(shí)間，如圖18-3O’B。它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間。,,3．調(diào)整留存時(shí)間tR′某組份的留存時(shí)間扣除死時(shí)間后稱(chēng)為該組份的調(diào)整留存時(shí)間，即tR′=tR-tM,由于組份在色譜柱中的留存時(shí)間tR包含了組份隨滾動(dòng)相通過(guò)柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以tR′實(shí)際上是組份在固定相中停留的總時(shí)間。

留存時(shí)間是色譜法定性的根本依據(jù)，但同一組份的留存時(shí)間常受到滾動(dòng)相流速的影響，因此色譜工有時(shí)用留存體積等參數(shù)舉行定性檢定。,,4．死體積VM指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和。當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可疏忽不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與滾動(dòng)相體積流速F0（L／min）計(jì)算：

VM=tM·F0,5．留存體積VR指從進(jìn)樣開(kāi)頭到被測(cè)組份在柱后展現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的滾動(dòng)相體積。留存體積與留存時(shí)間t。的關(guān)系如下：

VR=tR·F0,6．調(diào)整留存體積VR′某組份的留存體積扣除死體積后，稱(chēng)該組份的調(diào)整留存體積，即VR′=VR-VM,五、區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：,1.標(biāo)準(zhǔn)偏差σ即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖18-3中EF距離的一半。

2.半峰寬W1/2即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖18-3中GH間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差σ的關(guān)系是：

W1/2=2.354σ,,3.基線(xiàn)寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線(xiàn)在基線(xiàn)上的截距，如圖18－3中IJ的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是：

W=4σ,,,從色譜流出曲線(xiàn)上，可以得到大量重要信息,（l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個(gè)數(shù)。

（2）根據(jù)色譜峰的留存值，可以舉行定性分析。

（3）根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以舉行定量分析。

（4）色譜峰的留存值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分開(kāi)效能的依據(jù)。

（5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和滾動(dòng)相)選擇是否適合的依據(jù)。,,相對(duì)留存值γ2.1某組份2與組份1的校正留存值之比，稱(chēng)為相對(duì)留存值：,,由于相對(duì)留存值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充處境及滾動(dòng)相流速無(wú)關(guān)。,選擇因子定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)留存值。在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分開(kāi)的物質(zhì)對(duì)，可用符號(hào)α表示：,假設(shè)進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內(nèi)，色譜峰假設(shè)對(duì)稱(chēng)，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：,式中：C—不同時(shí)間t時(shí)某物質(zhì)的濃度，C0—進(jìn)樣濃度，tr—留存時(shí)間，σ—標(biāo)準(zhǔn)偏差。,,,5-3色譜法分析的根本原理色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分開(kāi)，組分要達(dá)成完全分開(kāi)，兩峰間的距離務(wù)必足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的調(diào)配系數(shù)抉擇的，即與色譜過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有確定距離，假設(shè)每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開(kāi)。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和分散行為抉擇的，即與色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。,（5）調(diào)配系數(shù)和調(diào)配比（容量因子）,調(diào)配系數(shù)：

確定溫度與壓力下兩相達(dá)平衡后，組分在固定相和滾動(dòng)相濃度的比值,調(diào)配比（容量因子）：

確定溫度與壓力下兩相達(dá)平衡后，組分在固定相和滾動(dòng)相量的比值,固定相重量滾動(dòng)相重量,,,K與k的關(guān)系：,（6）容量因子k與留存值的關(guān)系,,組分在兩相中的質(zhì)量比等于組分在液相中的停留時(shí)間與氣相中的停留時(shí)間之比,色譜根本留存方程,四、分開(kāi)效能指標(biāo),1、選擇性（相對(duì)留存值）,相對(duì)留存值由兩組分的熱力學(xué)性質(zhì)抉擇，與色譜柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無(wú)關(guān)。,2、峰寬度,3、分開(kāi)度,分開(kāi)度考慮了留存時(shí)間和峰寬度，是一個(gè)綜合指標(biāo)：,R1.0兩峰明顯重疊R=1.0兩峰達(dá)97.7%分開(kāi)R1.5兩峰完全分開(kāi),,二、塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的調(diào)配行為，同時(shí)引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。,該理論假定：

（i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間急速達(dá)成平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱(chēng)為理論塔板高度H。

（ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)舉行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（ΔVm）。

（iii）全體組分開(kāi)頭時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向分散可疏忽。

（iv）調(diào)配系數(shù)在全體塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。,下表列出經(jīng)過(guò)各級(jí)轉(zhuǎn)移后組分在每一級(jí)塔板中的量：,,,,,,,,,當(dāng)經(jīng)過(guò)1次轉(zhuǎn)移（N=1）以后：,第0級(jí)塔板：r=0,組分的分量=,若抽象成一個(gè)規(guī)律：,由上表可以看出，經(jīng)N次轉(zhuǎn)移后，組分在各級(jí)塔板上的量符合二相式分布，即,當(dāng)N=4時(shí)，組分分布在5級(jí)塔板上：,以A組分為例，5級(jí)塔板上的分量分別是：,對(duì)于兩個(gè)組分A和B，假設(shè)k不同，那么流出曲線(xiàn)的外形不同：,由于所獲得的流出曲線(xiàn)在N很大時(shí)呈正態(tài)分布，,可知：,m為組分質(zhì)量，Vr為留存體積，n為理論塔板數(shù)。

當(dāng)V=Vr時(shí)，C值最大，即,或：,n稱(chēng)為色譜柱的理論塔板數(shù)。

由于tR是熱力學(xué)常數(shù)，當(dāng)色譜柱的長(zhǎng)度確定，理論板數(shù)目n越大，色譜峰越窄。,,從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。

通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細(xì)管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死時(shí)間tm包括在tr中，而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)調(diào)配，所計(jì)算的n值增大，H很小，但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn)。所以，提出把tm扣除，采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評(píng)價(jià)柱效能。,理論塔板高度（H）,塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的調(diào)配平衡和分開(kāi)過(guò)程，導(dǎo)出流出曲線(xiàn)的數(shù)學(xué)模型，并告成地解釋了流出曲線(xiàn)的外形及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。但由于它的某些根本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分開(kāi)過(guò)程，例如，縱向分散不能解釋造成譜帶擴(kuò)張的理由和影響板高的各種因素，也不能說(shuō)明為什么在不同流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。,,,三、速率理論,1、塔板理論的缺乏塔板理論雖然指出了理論板數(shù)n或理論板高度H對(duì)色譜柱效率的影響，但是沒(méi)有指出影響塔板高度的因素，因此無(wú)法在理論指導(dǎo)下從測(cè)驗(yàn)上提高色譜柱的效率。,2、VanDeemter方程1956年荷蘭學(xué)者范弟姆特等提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論，他們吸收了塔板理念的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合進(jìn)去，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線(xiàn)速度u的關(guān)系：

其中A渦流分散項(xiàng),B分子分散項(xiàng)，C傳質(zhì)阻力項(xiàng)。,式中u—線(xiàn)速度,說(shuō)明A與填充物dp的大小和填充的不平勻性λ有關(guān)，而與載氣性質(zhì)、線(xiàn)速度和組分無(wú)關(guān)，因此使用適當(dāng)細(xì)粒度和顆粒平勻的擔(dān)體，并填充平勻，是裁減渦流分散，提高柱效的有效途徑。,渦流分散示意圖,(2)分子分散項(xiàng)B/u由于試樣組分前后(縱向)存在著濃度差而形成濃度梯度，因此使運(yùn)動(dòng)著的分子產(chǎn)生縱向分散。

B=2rDgr是因載體而引起氣體分散路徑彎曲的因數(shù)(彎曲因子)，與填充物有關(guān)；

Dg為組分在氣相中的分散系數(shù)。與組分及載氣的性質(zhì)有關(guān)：相對(duì)分子質(zhì)量大的組分，其Dg小,所以采用相對(duì)分子質(zhì)量較大的載氣(如氮?dú)?，可使B項(xiàng)降低，Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。彎曲因子r為與填充物有關(guān)的因素。,(3)