提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析

（優(yōu)選）提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析當(dāng)前1頁(yè)，總共27頁(yè)。第二部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第三部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第一部分：前言當(dāng)前2頁(yè)，總共27頁(yè)。

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。前言當(dāng)前3頁(yè)，總共27頁(yè)。第二部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介當(dāng)前4頁(yè)，總共27頁(yè)。DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法其它

線(xiàn)粒體、葉綠體DNA的提取

差速離心結(jié)合SDS裂解法當(dāng)前5頁(yè)，總共27頁(yè)?；蚪MDNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱。當(dāng)前6頁(yè)，總共27頁(yè)。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法當(dāng)前7頁(yè)，總共27頁(yè)。

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法當(dāng)前8頁(yè)，總共27頁(yè)。

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法當(dāng)前9頁(yè)，總共27頁(yè)。

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取緩沖液當(dāng)前10頁(yè)，總共27頁(yè)。SDS法流程圖

（以動(dòng)物組織為例）

動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法當(dāng)前11頁(yè)，總共27頁(yè)?；蚪MDNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：當(dāng)前12頁(yè)，總共27頁(yè)?；蚪MDNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹(shù)脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。當(dāng)前13頁(yè)，總共27頁(yè)?；蚪MDNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物當(dāng)前14頁(yè)，總共27頁(yè)。細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線(xiàn)粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。當(dāng)前15頁(yè)，總共27頁(yè)。第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第三部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策當(dāng)前16頁(yè)，總共27頁(yè)。DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中當(dāng)前17頁(yè)，總共27頁(yè)。材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取當(dāng)前18頁(yè)，總共27頁(yè)。細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取當(dāng)前19頁(yè)，總共27頁(yè)。核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取當(dāng)前20頁(yè)，總共27頁(yè)。核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理當(dāng)前21頁(yè)，總共27頁(yè)。多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化當(dāng)前22頁(yè)，總共27頁(yè)。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類(lèi)氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類(lèi)有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類(lèi)與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌當(dāng)前23頁(yè)，總共27頁(yè)。核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

基因組DNA的提取當(dāng)前24頁(yè)，總共27頁(yè)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ弋?dāng)前25頁(yè)，總共27頁(yè)。材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題二：DNA降解。對(duì)策

原因當(dāng)前26頁(yè)，總共27頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料