細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第一頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第二頁(yè)，共55頁(yè)。

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來(lái)，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。什么是細(xì)胞培養(yǎng)？第三頁(yè)，共55頁(yè)。主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)備試劑及耗材清洗及滅菌細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，細(xì)胞來(lái)源，細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存，細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力測(cè)定，細(xì)胞污染）第四頁(yè)，共55頁(yè)。一實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱第五頁(yè)，共55頁(yè)。

超凈臺(tái)生物安全柜酒精燈（√），離開(kāi)要熄滅！酒精燈（×）第六頁(yè)，共55頁(yè)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。倒置顯微鏡第七頁(yè)，共55頁(yè)。離心機(jī)電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平第八頁(yè)，共55頁(yè)。純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！第九頁(yè)，共55頁(yè)。小結(jié)一實(shí)驗(yàn)設(shè)備及功能超凈工作臺(tái)，生物安全柜------操作平臺(tái)CO2培養(yǎng)箱-------------------------細(xì)胞生長(zhǎng)的空間倒置顯微鏡-------------------------觀察細(xì)胞離心機(jī)-------------------------------離心收集細(xì)胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細(xì)胞純水儀-------------------------------制備一級(jí)水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全）第十頁(yè)，共55頁(yè)。二試劑及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清其他耗材第十一頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)基

供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來(lái)源無(wú)機(jī)鹽：幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用第十二頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)基分類(lèi)

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細(xì)胞（293），一些實(shí)體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細(xì)胞，單抗細(xì)胞融合

RPMI1640：血液細(xì)胞（HL60）、一些實(shí)體瘤細(xì)胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過(guò)酸、紫色過(guò)堿）；酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，建議選用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。ATCC美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)第十三頁(yè)，共55頁(yè)。緩沖液（洗滌細(xì)胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實(shí)驗(yàn)皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學(xué)方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動(dòng)植物細(xì)胞的水平，可作為動(dòng)植物細(xì)胞短期培養(yǎng)(幾個(gè)小時(shí))。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時(shí)）。第十四頁(yè)，共55頁(yè)。消化液胰蛋白酶溶液

使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞離散。使用濃度0.25%。配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來(lái)保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細(xì)胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無(wú)鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。第十五頁(yè)，共55頁(yè)。提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。（分裝）如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時(shí)，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清第十六頁(yè)，共55頁(yè)。青霉素-鏈霉素溶液

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成及細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成，達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，防止污染，對(duì)真菌和支原體無(wú)效。其他實(shí)驗(yàn)所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測(cè)試劑（如MTT）、細(xì)胞因子（如SCF）等第十七頁(yè)，共55頁(yè)。試劑標(biāo)注規(guī)范試劑名稱(chēng)NaCl配制濃度0.5mM配制人張三配制日期第十八頁(yè)，共55頁(yè)。耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他第十九頁(yè)，共55頁(yè)。小結(jié)二試劑及耗材的分類(lèi)及用途培養(yǎng)基（成分、分類(lèi)）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類(lèi)及應(yīng)用）血清（作用、存儲(chǔ)及解凍方法）試劑標(biāo)簽要規(guī)范耗材（分類(lèi)、用途）第二十頁(yè)，共55頁(yè)。在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個(gè)步驟）三清洗及滅菌第二十一頁(yè)，共55頁(yè)。消毒滅菌方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線(xiàn)）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線(xiàn)（200-300nm）：30min，阻止細(xì)菌、病毒核酸合成。（細(xì)胞室：用于空氣，操作臺(tái)表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時(shí)，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過(guò)濾：0.22μm濾膜過(guò)濾除菌（少量試劑）第二十二頁(yè)，共55頁(yè)。消毒滅菌方法化學(xué)消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機(jī)玻璃）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽(yáng)離子表面活性劑，能破壞細(xì)胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）第二十三頁(yè)，共55頁(yè)。需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線(xiàn)（超凈臺(tái)、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準(zhǔn)備好放在準(zhǔn)備室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火）小結(jié)三清洗及滅菌第二十四頁(yè)，共55頁(yè)。四細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)類(lèi)型細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞傳代細(xì)胞凍存細(xì)胞計(jì)數(shù)活力測(cè)定污染種類(lèi)第二十五頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞的生長(zhǎng)類(lèi)型

粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。（絕大多數(shù)正常細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞）

懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。（主要是白血病細(xì)胞等）小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞第二十六頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞貼壁過(guò)程第二十七頁(yè)，共55頁(yè)。每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體圓球形）貼壁期（細(xì)胞平均在10分鐘－4小時(shí)貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等）潛伏期（有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂，一般為6～24小時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳。

最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究）停止期（平臺(tái)期）（細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性）（懸浮細(xì)胞沒(méi)有貼壁過(guò)程）第二十八頁(yè)，共55頁(yè)。國(guó)內(nèi)可以買(mǎi)到細(xì)胞株的地方有哪些？ATCC（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)）國(guó)內(nèi)代理ECACC（歐洲細(xì)胞株、微生物保藏中心）國(guó)內(nèi)代理、sigma中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部武漢大學(xué)冷藏中心等細(xì)胞來(lái)源第二十九頁(yè)，共55頁(yè)。

確定細(xì)胞株的培養(yǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無(wú)菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準(zhǔn)備準(zhǔn)備工作第三十頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞復(fù)蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。（4）隔天換液，但貼壁細(xì)胞若未貼壁則勿需處理。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細(xì)胞。第三十一頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞傳代

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。第三十二頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶底時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。

2半貼壁細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板第三十三頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞傳代3貼壁細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開(kāi)放式操作，小心謹(jǐn)慎、謹(jǐn)防污染！第三十四頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞凍存（慢凍）1細(xì)胞凍存液（1ml/管）基礎(chǔ)培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。）2細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。第三十五頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過(guò)夜）→液氮長(zhǎng)期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實(shí)現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過(guò)程中可以輔助實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。第三十六頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞凍存第三十七頁(yè)，共55頁(yè)。小結(jié)四細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞生長(zhǎng)類(lèi)型及傳代方法細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程注意無(wú)菌操作（全程）準(zhǔn)備工作復(fù)蘇（快）傳代（無(wú)菌）凍存（慢）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞信息、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序第三十八頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞第三十九頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×

104第四十頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿(mǎn)懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。第四十一頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定

細(xì)胞活力測(cè)定是體外實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。第四十二頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定

1細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬陕视脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力。克隆形成率＝（克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠，適于貼壁細(xì)胞第四十三頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定

2臺(tái)盼藍(lán)法（0.4%）細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活性。第四十四頁(yè)，共55頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定

3四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。第四十五頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)的污染類(lèi)型細(xì)菌污染真菌污染支原體污染病毒污染非同種細(xì)胞污染化學(xué)污染第四十六頁(yè)，共55頁(yè)。細(xì)菌污染小鼠胃癌細(xì)胞的球菌感染第四十七頁(yè)，共55頁(yè)。念珠菌污染真菌污染絲狀菌污染第四十八頁(yè)，共55頁(yè)。真菌污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團(tuán)塊或白點(diǎn)，鏡下呈絲狀。400倍圖片第四十九頁(yè)，共55頁(yè)。支原體污染支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀

第五十頁(yè)，共55頁(yè)。

細(xì)菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后。原代操作尤其注意！因此，細(xì)胞培養(yǎng)切記：“無(wú)菌”理念貫穿始終，包括：器皿、器械、耗材、培養(yǎng)基、試劑、操作習(xí)慣。（一旦污染、立即棄用！）

如何避免污染？細(xì)節(jié)決定成??！第五十一頁(yè)，共55頁(yè)。小結(jié)五實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法細(xì)胞活力測(cè)定的方法分類(lèi)、原理及應(yīng)用注意防止細(xì)胞污染第五十二頁(yè)，共55頁(yè)?？偨Y(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備的類(lèi)型及功能試劑及