第四五講細(xì)菌典型生理生化鑒定技術(shù)演示文稿

第四五講細(xì)菌典型生理生化鑒定技術(shù)演示文稿當(dāng)前1頁，總共142頁。優(yōu)選第四五講細(xì)菌典型生理生化鑒定技術(shù)當(dāng)前2頁，總共142頁。一、概述（一）、什么是生化試驗(yàn)?

指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細(xì)菌的類別、屬種的試驗(yàn)。當(dāng)前3頁，總共142頁。（二）檢驗(yàn)細(xì)菌的生化試驗(yàn)范圍1、糖（醇）類代謝試驗(yàn)2、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)3、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)4、呼吸酶類試驗(yàn)5、毒性酶類試驗(yàn)當(dāng)前4頁，總共142頁。（三）生化試驗(yàn)的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的pH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。根據(jù)細(xì)菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長情況。當(dāng)前5頁，總共142頁。（四）生化試驗(yàn)的注意事項(xiàng)1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~24h。2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應(yīng)的時(shí)間。觀察結(jié)果的時(shí)間，多為24或48小時(shí)。4、應(yīng)做必要的對照試驗(yàn)。5、提高陽性檢出率，至少挑取2~3待檢的疑似菌落分別進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)前6頁，總共142頁。二、糖醇類代謝試驗(yàn)（一）糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗(yàn)（三）V-P試驗(yàn)（四）甲基紅（MethylRed）試驗(yàn)MR（五）七葉苷水解試驗(yàn)（六）甘油品紅試驗(yàn)當(dāng)前7頁，總共142頁。（一）糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)

原理：不同的細(xì)菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1~2種糖醇，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌。當(dāng)前8頁，總共142頁。1、常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇當(dāng)前9頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法：

用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置36±1.0℃

培養(yǎng)1~3天，每天觀察結(jié)果。當(dāng)前10頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察和記錄記錄：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“⊕”表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示當(dāng)前11頁，總共142頁。陽性陽性陰性當(dāng)前12頁，總共142頁。（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗(yàn)

1、原理：細(xì)菌對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。

氧化型細(xì)菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細(xì)菌。當(dāng)前13頁，總共142頁。2、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37℃培養(yǎng)2~4h天，每天觀察結(jié)果。當(dāng)前14頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色）氧化型不產(chǎn)酸（綠色）產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)堿型不產(chǎn)酸（綠色）不產(chǎn)酸（綠色）當(dāng)前15頁，總共142頁。（三）V-P試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。當(dāng)前16頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法（1）奧梅拉（O’Meara）法（2）貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法

當(dāng)前17頁，總共142頁。（１）奧梅拉法：

將試驗(yàn)菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，每1mL培養(yǎng)液加奧梅拉O’Meara試劑0.1mL，搖動試管1~2min，靜置于37℃恒溫箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定結(jié)果。當(dāng)前18頁，總共142頁。（2）貝立脫法：

將試驗(yàn)菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)2天，每2mL培養(yǎng)液先加入6%a-萘酚純酒精溶液1mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.4mL，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1℃培養(yǎng)4h，如顯現(xiàn)紅色為陽性，呈黃色或有類似銅色者，可判定為陰性。當(dāng)前19頁，總共142頁。（3）快速法：

將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。當(dāng)前20頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P+（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-當(dāng)前21頁，總共142頁。（四）甲基紅試驗(yàn)（MR）1、原理細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細(xì)菌可使丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽性；有的細(xì)菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。當(dāng)前22頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3~5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結(jié)果。當(dāng)前23頁，總共142頁。MR-VP試驗(yàn)原理及照片當(dāng)前24頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。當(dāng)前25頁，總共142頁。當(dāng)前26頁，總共142頁。（五）七葉苷水解試驗(yàn)１、原理：七葉苷被細(xì)菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前27頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。當(dāng)前28頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏撸瑸殛栃?，記錄?（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄為-當(dāng)前29頁，總共142頁。（六）甘油品紅試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌可分解甘油成為丙酮酸，并進(jìn)一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前30頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。當(dāng)前31頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-當(dāng)前32頁，總共142頁。（六）甘油品紅試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌可分解甘油成為丙酮酸，并進(jìn)一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前33頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法：

取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。當(dāng)前34頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-當(dāng)前35頁，總共142頁。（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)（二）H2S試驗(yàn)（三）尿素酶試驗(yàn)（四）氨基酸脫羧酶試驗(yàn)（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)（六）明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)當(dāng)前36頁，總共142頁。（一）靛基質(zhì)試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚）。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前37頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法：所用試劑:（1）柯凡克(Kovacs)試劑;（2）歐—波試劑當(dāng)前38頁，總共142頁。

將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24~48h時(shí)后，加入柯凡克試劑數(shù)滴，輕搖試管，呈紅色者為陽性。或沿試管壁緩慢加入歐-波試劑約0.5mL覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽性反應(yīng)，無紅色者為陰性反應(yīng)。當(dāng)前39頁，總共142頁。靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片靛基質(zhì)+當(dāng)前40頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)，記+無紅色者，為陰性反應(yīng)，記-當(dāng)前41頁，總共142頁。（二）硫化氫（H2S）試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前42頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法：

挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)上，于36±1℃培養(yǎng)24~48h，觀察結(jié)果。當(dāng)前43頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-當(dāng)前44頁，總共142頁。（三）尿素酶試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細(xì)菌。

當(dāng)前45頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法：

挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。當(dāng)前46頁，總共142頁。尿素酶試驗(yàn)圖當(dāng)前47頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-當(dāng)前48頁，總共142頁。（四）氨基酸脫羧酶試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,可使賴氨酸、鳥氨酸生產(chǎn)脫羧作用,生成胺類物質(zhì)和CO2。胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前49頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內(nèi)，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。當(dāng)前50頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄試驗(yàn)管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+試驗(yàn)管、對照管都呈黃色，為陰性，記-當(dāng)前51頁，總共142頁。試驗(yàn)管陽性+對照管變黃當(dāng)前52頁，總共142頁。陽性反應(yīng)試驗(yàn)管顏色變化過程紫色→黃色→紫色原理：對照管呈黃色，說明有細(xì)菌生長。在培養(yǎng)的早期（10~12h），細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，pH又回升至堿性，指示劑顯紫色。當(dāng)前53頁，總共142頁。陽性反應(yīng)試驗(yàn)管顏色變化過程：紫色→黃色→紫色當(dāng)前54頁，總共142頁。（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前55頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在36±1℃培養(yǎng)18~24h后，加入氯化鐵溶液4~5滴，轉(zhuǎn)動試管，使試劑與菌苔表面充分接觸，立即觀察結(jié)果。當(dāng)前56頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄試驗(yàn)管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+無色為陰性，記-。當(dāng)前57頁，總共142頁。加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色+當(dāng)前58頁，總共142頁。（六）明膠液化試驗(yàn)

1、原理有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質(zhì)，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。當(dāng)前59頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置20~30min后，再觀察結(jié)果。當(dāng)前60頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。明膠凝固，為陰性，-。當(dāng)前61頁，總共142頁。四、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)丙二酸鹽利用試驗(yàn)當(dāng)前62頁，總共142頁。（一）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

1、原理：某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，為陽性。當(dāng)前63頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。當(dāng)前64頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-當(dāng)前65頁，總共142頁。檸檬酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片當(dāng)前66頁，總共142頁。（二）丙二酸鹽利用試驗(yàn)1.原理:

某些細(xì)菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源,丙二酸鹽被分解成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍(lán)色，為陽性，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前67頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。當(dāng)前68頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍(lán)色,為陽性,記+;培養(yǎng)基無顏色變化,為陰性,記-當(dāng)前69頁，總共142頁。五、呼吸酶類試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)氰化鉀試驗(yàn)當(dāng)前70頁，總共142頁。（一）氧化酶試驗(yàn)1.原理:

氧化酶使細(xì)胞色素C氧化后，氧化型細(xì)胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物,再和α-萘酚結(jié)合,生成吲哚酚藍(lán),呈藍(lán)色反應(yīng)，為陽性。當(dāng)前71頁，總共142頁。試劑1%α-萘酚-乙醇液1%鹽酸二甲基對苯二胺當(dāng)前72頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1~2滴在培養(yǎng)物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)前73頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄在30秒內(nèi)呈藍(lán)色反應(yīng),為陽性,記+不變色或?yàn)榧t色者,為陰性,記-當(dāng)前74頁，總共142頁。不變色或?yàn)榧t色為-當(dāng)前75頁，總共142頁。（二）過氧化氫酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，即為陽性反應(yīng)。當(dāng)前76頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。當(dāng)前77頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記-當(dāng)前78頁，總共142頁。（三）硝酸鹽還原試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。當(dāng)前79頁，總共142頁。試劑A、對氨基苯磺酸試劑B、α-萘胺試劑當(dāng)前80頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。當(dāng)前81頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記-當(dāng)前82頁，總共142頁。（四）氰化鉀試驗(yàn)1.原理：氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長,但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存在時(shí)仍能生長,以此鑒別細(xì)菌.當(dāng)前83頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。當(dāng)前84頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗(yàn)管有菌生長為陽性，記+。對照管有菌生長，試驗(yàn)管無菌生長為陰性。記-。當(dāng)前85頁，總共142頁。

六、毒性酶類試驗(yàn)溶血試驗(yàn)鏈激酶試驗(yàn)卵磷脂酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn)當(dāng)前86頁，總共142頁。（一）溶血試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。當(dāng)前87頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法平板法試管法當(dāng)前88頁，總共142頁。平板法

將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。當(dāng)前89頁，總共142頁。溶血試驗(yàn)的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（-丙型）溶血:菌落周圍無溶血環(huán)。當(dāng)前90頁，總共142頁。甲型（α-）溶血當(dāng)前91頁，總共142頁。試管法

將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在36±1℃培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。當(dāng)前92頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；無溶血現(xiàn)象，為陰性，記-當(dāng)前93頁，總共142頁。（二）鏈激酶試驗(yàn)1、原理：

A群鏈球菌群能產(chǎn)生鏈激酶，該酶能使血液中的纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，而后溶解纖維蛋白，使血凝塊溶解,為陽性反應(yīng)。此試驗(yàn)用于測定鏈球菌的致病性。陽性反應(yīng)具有致病性。當(dāng)前94頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

吸取草酸鉀血漿0.2mL(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液)，加入0.8mL生理鹽水，混勻后，再加入待檢菌36℃下培養(yǎng)18-24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25mL，混勻，放37℃水浴中，2min觀察一次。當(dāng)前95頁，總共142頁。

待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時(shí)間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h后觀察。同時(shí)用肉浸液肉湯做陰性對照，用已知的鏈激酶陽性的菌株做陽性對照。當(dāng)前96頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄如凝塊全部溶化,為陽性+，凝塊24h仍不溶化,為陰性-當(dāng)前97頁，總共142頁。（三）卵磷脂酶試驗(yàn)1、原理：某些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，在鈣離子存在時(shí)，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸膽堿，在卵黃瓊脂平板上菌落周圍形成不透明的乳濁環(huán)或混濁白環(huán)，或使血清、卵黃液變混濁，以此鑒別細(xì)菌。當(dāng)前98頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法（1）卵黃平板法：

A法：將待檢菌培養(yǎng)物劃線接種或點(diǎn)種于卵黃瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)3～6h，觀察結(jié)果。

當(dāng)前99頁，總共142頁。菌落當(dāng)前100頁，總共142頁。B法：先用卵黃磷脂酶抗血清將平板涂一半，置于36℃待干后，將待檢菌接種于未涂抗血清的一半卵黃瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)劃已涂過抗血清的一半，36±1℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周圍形成較大的不透明乳白色混濁區(qū)，在涂抗血清的一半平板上，菌落周圍無不透明混濁區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。當(dāng)前101頁，總共142頁。乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應(yīng)抗血清所抑制，當(dāng)前102頁，總共142頁。（2）卵黃鹽水法

將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌過濾，收集濾液。在兩支滅菌試管內(nèi)，每管加入1%卵黃鹽水0.4mL,在一管中加入濾液0.2mL，另一管加入生理鹽水0.2mL作對照。在36℃水浴中，經(jīng)2h、4h、8h、24h觀察結(jié)果。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性。當(dāng)前103頁，總共142頁。3、結(jié)果觀察與記錄菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性兩管無沉淀者，為陰性。當(dāng)前104頁，總共142頁。（四）血漿凝固酶試驗(yàn)1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。當(dāng)前105頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。當(dāng)前106頁，總共142頁。血漿凝固酶試驗(yàn)當(dāng)前107頁，總共142頁。陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固巨大塊凝固當(dāng)前108頁，總共142頁。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

當(dāng)前109頁，總共142頁。3、試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗(yàn)管血漿凝固者為陽性；均無凝固則為陰性。當(dāng)前110頁，總共142頁。三糖鐵（TSI）試驗(yàn)當(dāng)前111頁，總共142頁。1、三糖鐵試驗(yàn)的原理

如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細(xì)菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。當(dāng)前112頁，總共142頁。底面黃色，并產(chǎn)生CO2當(dāng)前113頁，總共142頁。2、試驗(yàn)方法

以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。當(dāng)前114頁，總共142頁。下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌當(dāng)前115頁，總共142頁。第二節(jié)血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，所出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。當(dāng)前116頁，總共142頁。一、抗原與抗體當(dāng)前117頁，總共142頁。（一）抗原1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。當(dāng)前118頁，總共142頁。2、抗原的特性免疫原性反應(yīng)原性當(dāng)前119頁，總共142頁。（二）抗體1、抗體：是指機(jī)體內(nèi)的淋巴系統(tǒng)細(xì)胞在抗原物質(zhì)的激發(fā)下，所合成的一種具有特異性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。

當(dāng)前120頁，總共142頁。當(dāng)前121頁，總共142頁。2、抗體的理化性質(zhì)（1）抗體是球蛋白（2）免疫球蛋白當(dāng)前122頁，總共142頁。兔血清電泳分離圖當(dāng)前123頁，總共142頁。經(jīng)對不同免疫血清的電泳分析，超速離心分析和分子量測定等方法，發(fā)現(xiàn)大部分抗體活性存在于γ球蛋白內(nèi)，但有小部分抗體活性可存在于β球蛋白內(nèi)。它們的離心常數(shù)分別為7S和平共處19S，分子量分別為16萬和90萬。因此它們分別被命名為7Sγ球蛋白分子（16萬）19Sβ2巨球蛋白分子(β2M,90萬)和β2A球蛋白分子，所以從早期對抗體性質(zhì)的研究證明抗體不是由均質(zhì)性球蛋白組成，而是由異性球蛋白組成。當(dāng)前124頁，總共142頁。（三）抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)

當(dāng)前125頁，總共142頁。第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ):

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體當(dāng)前126頁，總共142頁。靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力當(dāng)前127頁，總共142頁?？贵w結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖當(dāng)前128頁，總共142頁?？贵w分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引