第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗(yàn)證演示文稿

第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗(yàn)證演示文稿1當(dāng)前1頁(yè)，總共95頁(yè)。2優(yōu)選第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗(yàn)證當(dāng)前2頁(yè)，總共95頁(yè)。血藥濃度94-20085122篇當(dāng)前3頁(yè)，總共95頁(yè)。當(dāng)前4頁(yè)，總共95頁(yè)。當(dāng)前5頁(yè)，總共95頁(yè)。1992年創(chuàng)刊的《中國(guó)臨床藥學(xué)雜志》

2001年第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院主辦的《藥學(xué)服務(wù)與研究》兩刊于2004年同時(shí)成為中國(guó)科技核心期刊

臨床藥學(xué)專(zhuān)業(yè)性的學(xué)術(shù)期刊有：當(dāng)前6頁(yè)，總共95頁(yè)。不想當(dāng)將軍的士兵不是好士兵

容量大的U盤(pán)：《中國(guó)臨床藥學(xué)雜志》、《藥學(xué)服務(wù)與研究》中大量的相關(guān)文獻(xiàn)拷貝下來(lái)

另外以“臨床藥學(xué)”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學(xué)監(jiān)護(hù)”、“血藥濃度”等為關(guān)鍵詞，查找相關(guān)的文獻(xiàn)，copy!看文獻(xiàn)寫(xiě)論文提職稱當(dāng)前7頁(yè)，總共95頁(yè)。這門(mén)課有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，要求大家以論文的形式寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告！！實(shí)驗(yàn)一改進(jìn)的柱前衍生-HPLC法測(cè)定丙戊酸鈉的血藥濃度由老師提供文獻(xiàn)?？赐晡墨I(xiàn)后，考慮一個(gè)問(wèn)題：該如何設(shè)計(jì)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件？實(shí)驗(yàn)二姜黃素-PVP固體分散體在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定大家到圖書(shū)館電子閱覽室查閱文獻(xiàn)?。?！

關(guān)鍵詞：姜黃素，血藥濃度或：姜黃素，（藥代）動(dòng)力學(xué)

要看PDF文檔，電腦要安裝ADOBEREADER軟件當(dāng)前8頁(yè)，總共95頁(yè)。一、待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況

準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過(guò)一定的生物樣品預(yù)處理使待測(cè)物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來(lái)。故此，應(yīng)首先考慮樣品預(yù)處理方法 待測(cè)藥物的理化性質(zhì) 藥物在生物體內(nèi)的存在狀況 藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù)有：當(dāng)前9頁(yè)，總共95頁(yè)。(一)待測(cè)藥物的理化性質(zhì)

藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等—決定預(yù)處理方法及萃取方法 具有親脂性—在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取 具有強(qiáng)極性或親水性—沉淀蛋白、固相萃取、離子對(duì)萃取或衍生化后萃取等 具有揮發(fā)性—GC測(cè)定法 具有光譜或電化學(xué)特性—分析檢測(cè)方法 藥物的穩(wěn)定性—萃取濃縮技術(shù) 對(duì)酸堿不穩(wěn)定—避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑 對(duì)熱不穩(wěn)定—避免高溫蒸發(fā)溶劑---一個(gè)例子當(dāng)前10頁(yè)，總共95頁(yè)。另一個(gè)“兩彈一星”：拯救5億人的“中國(guó)神藥”

---青蒿素

瘧疾是危害人類(lèi)最大的疾病之一。全球每年瘧疾病人超過(guò)5億，死亡100萬(wàn)人以上。屠呦呦：古醫(yī)書(shū)中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機(jī)溶劑提取物對(duì)瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫(yī)書(shū)：“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之?！焙椭兴幊Ｓ玫募灏痉ú煌?？原來(lái)里面用的是青蒿鮮汁！改用沸點(diǎn)較低的乙醚提取，抑制率達(dá)100%

溫度?。。?！當(dāng)前11頁(yè)，總共95頁(yè)。(二)待測(cè)藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)與血漿蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱及結(jié)合率的高低

—決定分離萃取方法指標(biāo)：提取回收率

蛋白結(jié)合較強(qiáng)（非極性強(qiáng)）—不宜直接采用溶劑萃??？有機(jī)溶劑沒(méi)選對(duì)？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內(nèi)濃度高低、代謝過(guò)程及其代謝產(chǎn)物

—決定分析檢測(cè)技術(shù)

濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存）

—代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時(shí)測(cè)定

—采用HPLC或LC-MS等分析檢測(cè)技術(shù)當(dāng)前12頁(yè)，總共95頁(yè)。二、分析測(cè)定的目的與要求

體內(nèi)藥物分析的目的—影響分析方法的應(yīng)用

藥代動(dòng)力學(xué)—研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程—血漿濃度隨時(shí)間的變化過(guò)程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物

要求—同時(shí)測(cè)定原形藥物和代謝產(chǎn)物

檢測(cè)—寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專(zhuān)屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)

方法—不必強(qiáng)調(diào)方法的簡(jiǎn)便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù)有：當(dāng)前13頁(yè)，總共95頁(yè)。二、分析測(cè)定的目的與要求

臨床治療藥物監(jiān)測(cè)

藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近

方法—盡量簡(jiǎn)便、易行；適用于長(zhǎng)期、批量樣品的測(cè)定，大多采用UV、RIA或EIA等。？

中毒患者的臨床搶救

藥物濃度極高

方法—不必強(qiáng)調(diào)方法的靈敏度，強(qiáng)調(diào)方法的特異性和分析速度

—大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA或EIA？當(dāng)前14頁(yè)，總共95頁(yè)。三、生物樣品的類(lèi)型與預(yù)處理方法

生物樣品的類(lèi)型與預(yù)處理方法—決定分析方法的應(yīng)用

以血漿或血清為分析樣品

采用蛋白沉淀、溶劑萃取預(yù)處理技術(shù)

—分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測(cè)

用RIA分析？FPIA法

—樣品的預(yù)處理方法可較為粗放

—經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測(cè)定當(dāng)前15頁(yè)，總共95頁(yè)。四、實(shí)驗(yàn)室條件

在設(shè)計(jì)體內(nèi)藥物分析方法時(shí)，還應(yīng)充分考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的或有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。此外，還應(yīng)從方法的可行性、每個(gè)樣品測(cè)定耗時(shí)多少（10min）、操作的難易及技術(shù)要求及儀器、設(shè)備要求、費(fèi)用多少等等方面加以考慮。當(dāng)前16頁(yè)，總共95頁(yè)。

在阿齊霉素制劑生物等效性研究過(guò)程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5ng/ml～1μg/ml

，其檢測(cè)方法可采用HPLC法、LC-MS法和微生物法等數(shù)種方法。若用HPLC法來(lái)檢測(cè)該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對(duì)樣品進(jìn)行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-MS法來(lái)檢測(cè)該樣品，則由于LC-MS儀器的靈敏度足以檢測(cè)濃度為1ng/ml以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來(lái)檢測(cè)該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。

例子1當(dāng)前17頁(yè)，總共95頁(yè)。

當(dāng)然，用LC-MS法來(lái)檢測(cè)阿齊霉素時(shí)，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來(lái)處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時(shí)間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血樣處理最好采用蛋白沉淀法。當(dāng)前18頁(yè)，總共95頁(yè)。

蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩(wěn)定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優(yōu)于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。當(dāng)前19頁(yè)，總共95頁(yè)。

如果測(cè)定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，對(duì)酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。----具體問(wèn)題具體分析

----信息，查文獻(xiàn)例子2當(dāng)前20頁(yè)，總共95頁(yè)。第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇二、分析方法的建立

(一)

檢測(cè)條件的篩選

(二)分離條件的篩選當(dāng)前21頁(yè)，總共95頁(yè)。一、分析方法的選擇

體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計(jì)受多種因素影響 生物樣品中的藥物濃度—決定分析方法的首要要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少

—難以通過(guò)增加取樣量提高方法靈敏度

—通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求。常用分析方法的檢測(cè)限度及分離能力見(jiàn)表4-1當(dāng)前22頁(yè)，總共95頁(yè)。摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則二○○五年三月SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數(shù)藥物的檢測(cè)；（2）免疫學(xué)方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質(zhì)多肽類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)；（3）微生物學(xué)方法，可用于抗生素藥物的測(cè)定。從目前發(fā)展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LC－MS、GC－MS法，這類(lèi)方法靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性一般都能適應(yīng)臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室也具備條件，因此應(yīng)用最廣，大約90%的藥物濃度測(cè)定可以用色譜法來(lái)完成。具體選用何種分析方法應(yīng)根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、儀器條件以及借鑒文獻(xiàn)方法多方面因素來(lái)考慮確定。當(dāng)前23頁(yè)，總共95頁(yè)。二、分析方法的建立初步擬定分析方法后 進(jìn)行一系列試驗(yàn)工作，以選擇最佳分析條件

同時(shí)驗(yàn)證分析方法的可行性，以確認(rèn)是否適用于實(shí)際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測(cè)條件的篩選第二步：分離條件的篩選當(dāng)前24頁(yè)，總共95頁(yè)。(一)檢測(cè)條件的篩選

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)—

照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測(cè)定

—

確定最佳分析檢測(cè)條件(如色譜條件)和檢測(cè)靈敏度

HPLC

—調(diào)整檢測(cè)器(類(lèi)型、條件)、色譜柱(型號(hào)、牌號(hào)、填料性狀與粒經(jīng)、柱長(zhǎng)度)、流動(dòng)相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等

—使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ)

良好的色譜參數(shù)(n、R、T)

適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間(tR)當(dāng)前25頁(yè)，總共95頁(yè)。(二)分離條件的篩選

在進(jìn)行分離條件篩選時(shí)，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對(duì)分離與檢測(cè)的干擾，步驟如下：

1．空白溶劑試驗(yàn)

—溶劑(方法特異性) 2．空白生物基質(zhì)試驗(yàn)

—(方法特異性) 3．模擬生物樣品試驗(yàn)

—方法效能指標(biāo)

4．實(shí)際生物樣品測(cè)試—代謝產(chǎn)物(方法特異性)當(dāng)前26頁(yè)，總共95頁(yè)。1．空白溶劑試驗(yàn)

待測(cè)藥物的非生物基質(zhì)溶液（通常為水溶液）

—采用擬定的分析方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)、萃取分離等 樣品預(yù)處理（反應(yīng)試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等）

—測(cè)定響應(yīng)信號(hào)（如HPLC峰面積或峰高） 考察目標(biāo)

—方法的特異性

—空白值應(yīng)盡可能小，并能有效校正當(dāng)前27頁(yè)，總共95頁(yè)。對(duì)色譜分析法而言

—可通過(guò)改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測(cè)器類(lèi)型

—空白試劑信號(hào)應(yīng)不干擾藥物的測(cè)定（如R＞1.5）

本步驟主要考察

—需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程，若預(yù)處理過(guò)程僅為生物樣品的提取分離，則可不進(jìn)行該步驟，直接進(jìn)行空白生物基質(zhì)試驗(yàn)當(dāng)前28頁(yè)，總共95頁(yè)。2.空白生物基質(zhì)試驗(yàn)

空白生物基質(zhì)(blankbiologicalmatrix)

—如空白血漿

—按“空白溶劑試驗(yàn)”項(xiàng)下方法操作 考察目標(biāo)

—生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾（方法特異性）

—在待測(cè)藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等)的“信號(hào)窗”內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào)當(dāng)前29頁(yè)，總共95頁(yè)。celecoxib塞來(lái)考昔<抗關(guān)節(jié)炎藥，COX-2抑制劑>當(dāng)前30頁(yè)，總共95頁(yè)。3.模擬生物樣品試驗(yàn)

模擬生物樣品—空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物，照“空白溶劑試驗(yàn)”項(xiàng)下方法操作

考察目標(biāo)：

—方法的線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度、 藥物的萃取回收率等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)

—同時(shí)進(jìn)一步檢驗(yàn)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對(duì)測(cè)定的干擾程度，即方法特異性當(dāng)前31頁(yè)，總共95頁(yè)。對(duì)色譜分析法而言

—進(jìn)一步考察待測(cè)藥物、內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)源性物質(zhì)(或其它藥物)的分離情況

—如色譜峰的tR、n和T是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點(diǎn)等 均可說(shuō)明內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾當(dāng)前32頁(yè)，總共95頁(yè)。4.實(shí)際生物樣品的測(cè)試

空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗(yàn)—確定的分析方法及其條件

—不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測(cè)定

—藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)或代謝生成數(shù)個(gè)代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物(或綴合物)

實(shí)際生物樣品—確立分析方法后，尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)試 考察目標(biāo)：—代謝產(chǎn)物對(duì)藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況—進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性？當(dāng)前33頁(yè)，總共95頁(yè)?？瞻籽獫{空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液志愿者實(shí)際樣品空白溶劑試驗(yàn)多余？當(dāng)前34頁(yè)，總共95頁(yè)。第三節(jié)分析方法

驗(yàn)證的內(nèi)容與要求

基于以下原因需要對(duì)建立的分析方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證：1、生物樣品量少2、藥物或活性代謝產(chǎn)物濃度低3、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾4、生物的個(gè)體差異較大當(dāng)前35頁(yè)，總共95頁(yè)。（二）方法學(xué)確證建立可靠的和可重復(fù)的定量分析方法是進(jìn)行臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的關(guān)鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須對(duì)方法進(jìn)行充分確證，一般應(yīng)進(jìn)行以下幾方面的考察：1、特異性(Specificity)2、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve）3、定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）4、精密度與準(zhǔn)確度（PrecisionandAccuracy）5、樣品穩(wěn)定性(Stability)6、提取回收率7、微生物學(xué)和免疫學(xué)方法確證8、方法學(xué)質(zhì)控摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

當(dāng)前36頁(yè)，總共95頁(yè)。

用于實(shí)際生物樣品分析之前： 需要驗(yàn)證(validation)分析方法的可行性與可靠性 方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮影響分析方法的所有可變因素：

取樣、樣品制備、色譜分離、檢測(cè)與數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)使用的樣品

—通常采用模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣

驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)

—效能指標(biāo)

當(dāng)前37頁(yè)，總共95頁(yè)。驗(yàn)證步驟

首先為分析方法的驗(yàn)證

—特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、定量限與檢測(cè)限、穩(wěn)定性等

其次為生物基質(zhì)中待測(cè)藥物穩(wěn)定性的驗(yàn)證

—室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)

Freeze-and-thawcycle當(dāng)前38頁(yè)，總共95頁(yè)。驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求

1．特異性（專(zhuān)屬性）—避免干擾

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍—覆蓋所有濃度范圍

3．準(zhǔn)確度—與實(shí)際狀況相符

4．精密度—結(jié)果可重現(xiàn)

5．定量限—達(dá)到峰濃度的1/10～1/20 6．穩(wěn)定性—確保所有樣品準(zhǔn)確測(cè)定

7．提取回收率—確保檢測(cè)的靈敏度當(dāng)前39頁(yè)，總共95頁(yè)。一、方法特異性(專(zhuān)屬性或選擇性)

方法的特異性(specificity)

—又稱專(zhuān)屬性或?qū)Ｒ恍裕ǔＥc選擇性(selectivity)互用

—系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力，通常表示所檢測(cè)的信號(hào)(響應(yīng))系屬于待測(cè)藥物所特有 選擇性—包括將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

特異性—函蓋二者，以驗(yàn)證所測(cè)定的物質(zhì)與待測(cè)藥物的同一性特異性用于考察方法的抗干擾程度。如果特異性不佳，方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性都將受到影響。因此確保特異性是建立和驗(yàn)證一個(gè)分析方法的第一步。

當(dāng)前40頁(yè)，總共95頁(yè)。1.內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

比較—待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）

—

空白生物基質(zhì)

—

模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對(duì)照品）的檢測(cè)信號(hào)

—如HPLC色譜峰的tR、n和拖尾因子（T）是否一致，以及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的分離度（R） 確證—內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾考察一個(gè)分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)：當(dāng)前41頁(yè)，總共95頁(yè)。2.代謝產(chǎn)物的干擾

比較模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào) 如HPLC中藥物色譜峰的tR、n和T是否一致，〔或改變色譜條件(色譜柱)再比較〕，以及與代謝產(chǎn)物的R，來(lái)確證代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾。

結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測(cè)定 －通過(guò)HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性

對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定 －采用LC-LC-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后，考察其干擾情況。當(dāng)前42頁(yè)，總共95頁(yè)。

對(duì)于色譜法至少要考察6個(gè)不同個(gè)體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖，以反映分析方法的特異性。對(duì)于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測(cè)法（LC-MS、LC-MS-MS）應(yīng)注意考察分析過(guò)程中的介質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

當(dāng)前43頁(yè)，總共95頁(yè)。3.伍用藥物的干擾

TDM時(shí)

—還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物的干擾 通過(guò)比較待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生物樣品的檢測(cè)信號(hào) 如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致

來(lái)確證同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的干擾情況當(dāng)前44頁(yè)，總共95頁(yè)。4.與參比方法的相關(guān)性

除上述方法外，有時(shí)還可使用參比方法對(duì)照法。 參比方法一般選用特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法。如在TDM中使用UV(或RIA)時(shí),可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X);擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y)

用最小二乘法計(jì)算回歸方程Y＝a＋bX(坐標(biāo)標(biāo)度相等)、相關(guān)系數(shù)(r)—表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性，若r≠1，表示擬定方法為非線性，如RIA中抗血清滴度選擇不當(dāng)當(dāng)前45頁(yè)，總共95頁(yè)。4.與參比方法的相關(guān)性

Y＝a＋bX

截距(a)—表示擬定方法受到恒定干擾的程度—內(nèi)源性物質(zhì)(UV)

斜率(b)—表示擬定方法受到比例干擾的程度—標(biāo)記抗原不純(RIA)

與參比方法的相關(guān)性比較，除顯示分析方法的特異性外，還反映分析方法的準(zhǔn)確度。

—斜率b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性

若參比方法準(zhǔn)確度良好，且截距a≈0,則擬定方法的準(zhǔn)確度(回收率)為100b(%)當(dāng)前46頁(yè)，總共95頁(yè)。二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）—

校正（calibrationcurve）or工作（workingcurve）

—指生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)（峰面積或峰高）的相關(guān)性（呈比例的程度）

—通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)

—除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式

—常用的回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權(quán)最小二乘法（weightedleastsquares） 線性范圍（linearrang）—標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間

—在此線性范圍內(nèi)，模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度當(dāng)前47頁(yè)，總共95頁(yè)。二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(續(xù))

標(biāo)準(zhǔn)曲線—用模擬生物樣品建立

—線性范圍(不包括零點(diǎn))應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度

—不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備當(dāng)前48頁(yè)，總共95頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立過(guò)程：標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制加權(quán)最小二乘法限度要求當(dāng)前49頁(yè)，總共95頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法

1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)－對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品 溶劑—水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑） 濃度—模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上 加入量為生物樣品總體積的2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實(shí)際樣品存在較大差異。難溶性藥物，濃度較低—應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì)結(jié)晶？否則,在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻

當(dāng)前50頁(yè)，總共95頁(yè)。

至少含5～8個(gè)濃度點(diǎn)(不包括零點(diǎn)，即空白)

—可覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常數(shù)約為2)

若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5

設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1(個(gè)體差異)當(dāng)前51頁(yè)，總共95頁(yè)。2、內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)物質(zhì)－對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品或化學(xué)試劑適宜的溶劑－甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度－與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的中間濃度相當(dāng)如：某標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40μg/ml

在這里，加內(nèi)標(biāo)溶液時(shí)并沒(méi)有象標(biāo)準(zhǔn)溶液那樣要求加入量為生物樣品總體積的2%以下，為什么？當(dāng)前52頁(yè)，總共95頁(yè)。3.標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備

空白生物基質(zhì)(如血漿)—加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品的最高濃度應(yīng)高于生物體用藥后的達(dá)峰濃度，最低濃度應(yīng)低于Cmax的10％～5％。目的—涵蓋 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時(shí)造成的損失？

——①先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液②再加入空白生物基質(zhì) ③渦旋混勻

①②③當(dāng)前53頁(yè)，總共95頁(yè)。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高)或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量,y)對(duì)模擬血藥濃度(自變量,x)

—求得回歸方程(y＝a＋bx)及其相關(guān)系數(shù)()

在一組由至少7個(gè)濃度(不包括零點(diǎn))構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，至多可有2個(gè)濃度點(diǎn)數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如： （1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問(wèn)題；（3）顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線

—其余應(yīng)有至少5個(gè)濃度點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上當(dāng)前54頁(yè)，總共95頁(yè)。5.加權(quán)最小二乘法

普通最小二乘法—每個(gè)濃度點(diǎn)絕對(duì)誤差(yi－yi’)賦予同等的重要性

若標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達(dá)102)

—低濃度區(qū)的計(jì)算值相對(duì)誤差過(guò)大，難以滿足規(guī)定要求。加權(quán)最小二乘法—回歸計(jì)算時(shí)增加一個(gè)權(quán)重因子(w)

—各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對(duì)離差平方和達(dá)到最小式中，wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個(gè)濃度點(diǎn)的權(quán)重因子當(dāng)前55頁(yè)，總共95頁(yè)。1）回歸方程(y=a+bx)參數(shù)的計(jì)算

現(xiàn)在有專(zhuān)業(yè)軟件當(dāng)前56頁(yè)，總共95頁(yè)。2）權(quán)重因子的選擇

選擇加權(quán)因子時(shí)—兼顧考慮曲線上高、中、低各濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度，賦予低濃度點(diǎn)以更大的權(quán)重 在實(shí)際工作中的一般方法 （1）當(dāng)wi=1/(yi’)2時(shí)，則 （2）而yi與xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2

當(dāng)高濃度點(diǎn)測(cè)量值的準(zhǔn)確度下降過(guò)大 低濃度點(diǎn)權(quán)重過(guò)大，降低低濃度點(diǎn)的權(quán)重，wi=k/xi當(dāng)前57頁(yè)，總共95頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求

—標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個(gè)濃度(通常為5～8個(gè)濃度,不包括零點(diǎn))—最高濃度應(yīng)高于用藥后生物體內(nèi)藥物的達(dá)峰濃度(Cmax)，最低濃度應(yīng)為方法的LOQ(非LOD)，并應(yīng)低于Cmax的10％～5％（1/10-1/20）—若標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍較寬，可分為高低兩個(gè)濃度區(qū)間(每個(gè)區(qū)間不少于5個(gè)濃度)，分別加權(quán)回歸—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200—相關(guān)系數(shù)要求≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方法)—回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b≥1使之具有較高的靈敏度--與坐標(biāo)的標(biāo)度選擇有關(guān)在藥代動(dòng)力學(xué)或生物利用度研究中：當(dāng)前58頁(yè)，總共95頁(yè)。三、準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度(accuracy)—系指用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度 理論上應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定，但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的。所以，通常使用模擬生物樣品測(cè)定，以測(cè)得的濃度與添加的理論濃度比較計(jì)算求得。 一般用相對(duì)回收率(relativerecovery，RR)或相對(duì)誤差(relativeerror，RE)表示當(dāng)前59頁(yè)，總共95頁(yè)。1.測(cè)定法

取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控(qualitycontrol，QC)樣品

—高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3個(gè)濃度

—每一濃度至少5個(gè)樣本

—與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測(cè)定、計(jì)算，每個(gè)樣品分析測(cè)定1次，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得的濃度當(dāng)前60頁(yè)，總共95頁(yè)。2.結(jié)果計(jì)算與限度要求

計(jì)算

—測(cè)定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對(duì)回收率 相對(duì)誤差 限度要求

—相對(duì)回收率應(yīng)在85%～115%(LOQ附近80%～120%)

—RE在±15%(LOQ附近為±20%)當(dāng)前61頁(yè)，總共95頁(yè)。四、精密度

方法精密度(precision)

—系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的偏離程度

—表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility)

—反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)之一 理論上，精密度應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定。但實(shí)際上生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml)

—使用模擬生物樣品測(cè)定，且通常與方法準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)同時(shí)進(jìn)行，如日內(nèi)精密度即可使用方法準(zhǔn)確度的測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算。當(dāng)前62頁(yè)，總共95頁(yè)。1.表示方法

方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，SD)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= =在體內(nèi)藥物分析中，方法精密度一般用RSD表示。當(dāng)前63頁(yè)，總共95頁(yè)。

批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD系指在同一分析批內(nèi)測(cè)定結(jié)果之間的RSD。一個(gè)分析批通常在一個(gè)工作日內(nèi)完成，又稱為日內(nèi)(within-day)RSD。

無(wú)論是藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)或治療藥物監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)，通常在一個(gè)工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析。在不同工作日之間的實(shí)驗(yàn)條件有可能發(fā)生微小變化，對(duì)分析結(jié)果有可能產(chǎn)生影響。所以，方法精密度除要考察批內(nèi)RSD外，同時(shí)還有考察批間RSD。

批間(between-run或inter-assay)RSD系指在不同分析批的測(cè)定結(jié)果之間的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日內(nèi)完成，又稱為日間(between-day，day-to-day)RSD。當(dāng)前64頁(yè)，總共95頁(yè)。2.測(cè)定法—分別測(cè)定法(Ⅰ)

取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品，并分析測(cè)定批內(nèi)RSD：一個(gè)工作日內(nèi)完成，隨行制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度5～6個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度的RSD批間RSD：在至少5個(gè)工作日內(nèi)完成，每一工作日內(nèi)完成一個(gè)分析批的測(cè)定。每一分析批內(nèi)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度1個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3個(gè)濃度(每一濃度5～6個(gè)分析批數(shù)據(jù))的RSD當(dāng)前65頁(yè)，總共95頁(yè)。2.測(cè)定法

若實(shí)際樣品測(cè)定所用的分析批次少于5批，也可進(jìn)行3個(gè)批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為5～6個(gè)樣本)—采用多次分析的方差分析法 批間RSD=

批內(nèi)RSD= =批內(nèi)與批間RSD當(dāng)前66頁(yè)，總共95頁(yè)。3.限度要求

在藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究中

對(duì)g/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)≤10% ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)≤15%

在LOQ附近RSD應(yīng)≤20%。

當(dāng)前67頁(yè)，總共95頁(yè)。五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ)

—系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測(cè)定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度(sensitivity)

—標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)(最低濃度點(diǎn)≥LOQ)

要求—應(yīng)能滿足測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的10％～5％

—準(zhǔn)確度在80%～120%(或RE在±20%的范圍內(nèi))

—RSD≤20%當(dāng)前68頁(yè)，總共95頁(yè)。最低檢測(cè)限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下識(shí)別生物樣品中藥物的最低濃度，一般認(rèn)為信噪比（S/N）≥3，信號(hào)可被檢測(cè)，故以S/N＝3時(shí)的樣品濃度作為L(zhǎng)OD。

LOQ的檢測(cè)信號(hào)至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作為L(zhǎng)OQ的估計(jì)值。當(dāng)前69頁(yè)，總共95頁(yè)。LODTestS/N＝3當(dāng)前70頁(yè)，總共95頁(yè)。六、穩(wěn)定性

生物樣品量較大時(shí)，在一個(gè)工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析；有時(shí)樣品需進(jìn)行復(fù)測(cè)。因此生物樣品及其預(yù)處理后的殘?jiān)蛉芤旱姆€(wěn)定性就顯得尤為重要。需要對(duì)樣品的存放條件和時(shí)間進(jìn)行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠

方法穩(wěn)定性

生物樣品的穩(wěn)定性穩(wěn)定性當(dāng)前71頁(yè)，總共95頁(yè)。（一）方法穩(wěn)定性：首先考察待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)、衍生化試劑）或其分析溶液在實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度、光照及暴露空氣等條件下的穩(wěn)定性；在分析方法的建立時(shí)要考慮模擬生物樣品的預(yù)處理過(guò)程（提取、凈化及相轉(zhuǎn)移）及待測(cè)物（蒸干后的殘?jiān)捌淙芤海┰谑覝鼗虮渲写娣诺姆€(wěn)定性。當(dāng)前72頁(yè)，總共95頁(yè)。短期穩(wěn)定性：主要考察模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及凍－融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性（二）生物樣品的穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性：主要考察生物樣品長(zhǎng)期冰凍（－20℃或－80℃）后的穩(wěn)定性，考察期限從生物樣品的采集到分析完畢的整個(gè)時(shí)間區(qū)間。當(dāng)前73頁(yè)，總共95頁(yè)。測(cè)定方法與要求1、取高、中、低三個(gè)濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時(shí)間后，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，平均值應(yīng)為零時(shí)測(cè)定的±5％以內(nèi)（經(jīng)衍生化處理±15％以內(nèi)）。若考察時(shí)間大于1天，則應(yīng)與新制QC樣品比較，若考察時(shí)間很長(zhǎng)，可與在液氮中保存的樣品在相同條件下的測(cè)定值比較2、穩(wěn)定性期限要求室溫下存放一般僅考察1個(gè)工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中－數(shù)個(gè)工作日（或數(shù)星期、數(shù)月）當(dāng)前74頁(yè)，總共95頁(yè)。七、萃取回收率（Extactionrecovvvery）

從生物樣品基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值與加入的標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值的百分比即為分析物的萃取回收率。也可以說(shuō)是將供試生物樣品中分析物萃取出來(lái)供分析的比例。

應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度的萃取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)當(dāng)前75頁(yè)，總共95頁(yè)。1.測(cè)定法

取空白生物基質(zhì)(如血漿)，制備高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品(每一濃度至少5個(gè)樣品)，每個(gè)樣品分析測(cè)定1次 另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w積，同法測(cè)定

AT—經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測(cè)信號(hào)或比值(內(nèi)標(biāo)法) AS—未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)信號(hào)或比值(內(nèi)標(biāo)法)當(dāng)前76頁(yè)，總共95頁(yè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)1、要考察是內(nèi)源性物質(zhì)還是提取方法對(duì)提取回收率產(chǎn)生影響2、測(cè)定回收率時(shí)，如采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)應(yīng)在提取之后，溶劑蒸發(fā)之前加入3、采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，應(yīng)同時(shí)測(cè)定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率，只需配制一個(gè)中間濃度的QC樣品5份，同法測(cè)定。當(dāng)前77頁(yè)，總共95頁(yè)。2.限度要求在生物利用度或TDM時(shí)高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)≥70%高、中濃度的RSD應(yīng)≤15%低濃度的RSD應(yīng)≤20%內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率應(yīng)≥50%（RSD≤15%)當(dāng)前78頁(yè)，總共95頁(yè)。

（1）方法準(zhǔn)確度(或相對(duì)回收率，relativerecovery)

（2）萃取回收率(絕對(duì)回收率，absoluterecovery)萃取回收率與相對(duì)回收率的比較：（1）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過(guò)程造成的藥物的程度損失（2）相對(duì)回收率主要用來(lái)考察測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計(jì)算生物樣品中藥物濃度當(dāng)前79頁(yè)，總共95頁(yè)。有時(shí)，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水性藥物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。

解決辦法：表面硅烷化處理或加入可降低吸附的試劑如異丙醇、異戊醇、乙二胺等。當(dāng)前80頁(yè)，總共95頁(yè)。八、質(zhì)量控制1、質(zhì)控樣品（QualitycontrolQC）：是指將已知量的待測(cè)藥物加入到空白生物基質(zhì)中配制的模擬生物樣品，用于整個(gè)分析過(guò)程中的質(zhì)量控制，一般配制高、中、低三個(gè)濃度的樣品

分析方法建立并通過(guò)驗(yàn)證后，方可進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)定，此時(shí)仍需對(duì)分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控！

質(zhì)控樣品池由不負(fù)責(zé)生物樣品測(cè)試的人員（推薦由獨(dú)立的人員）在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)制備，并與實(shí)際生物樣品在相同條件下儲(chǔ)存當(dāng)前81頁(yè)，總共95頁(yè)。2、質(zhì)量控制（1）測(cè)定法：在測(cè)定過(guò)程中，每批生物樣品都應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行間隔以高→低或低→高測(cè)定高、中、低至少3個(gè)濃度的6個(gè)QC樣品（2）限度要求：6個(gè)QC樣品中至少4個(gè)的測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度在各自正常濃度80％～120％，RSD≤20%，允許有2個(gè)QC樣品超出各自的±20％當(dāng)前82頁(yè)，總共95頁(yè)。

由于生物基質(zhì)中存在內(nèi)源性的該物質(zhì)，難以測(cè)定方法的LOQ和準(zhǔn)確度，此時(shí)可通過(guò)以下方法制備空白生物基質(zhì)：1、對(duì)生物基質(zhì)進(jìn)行處理---活性炭濾過(guò)、透析2、使用不含內(nèi)源性物質(zhì)的生物基質(zhì)—周期性變化的內(nèi)源性物質(zhì)如某些激素。3、使用替代基質(zhì)—如兔血漿、人血清蛋白、緩沖液九、生物樣品測(cè)定中其它情況（一）作為外源性藥物使用的內(nèi)源性物質(zhì)的測(cè)定當(dāng)前83頁(yè)，總共95頁(yè)。出現(xiàn)以下情況時(shí)，分析方法需進(jìn)行再評(píng)價(jià)或交互驗(yàn)證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法－樣品的前處理方法改變后需要對(duì)效能指標(biāo)進(jìn)行重新考察2、改變生物基質(zhì)不同物種的同種生物基質(zhì)（大鼠血漿人血漿）、同一物種的不同生物基質(zhì)（血漿血清）、甚至使用相同基質(zhì)而使用不同抗凝劑等。（二）方法的再評(píng)價(jià)或交互驗(yàn)證：當(dāng)前84頁(yè)，總共95頁(yè)。（三）實(shí)際濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理：1、濃度高于定量上限－取樣品用空白基質(zhì)稀釋?zhuān)瑫r(shí)制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋后測(cè)定，以確認(rèn)稀釋的有效性。2、濃度低于LOQ－增加生物樣品的體積，使測(cè)定液的濃度高于LOQ。應(yīng)在相同條件下制備QC樣品和增加體積后的空白生物基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，以確認(rèn)方法的準(zhǔn)確度、精密度和特異性符合要求。當(dāng)前85頁(yè)，總共95頁(yè)。第四節(jié)體內(nèi)藥物分析方法

應(yīng)用示例

第三代喹諾酮類(lèi)廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究

一、文獻(xiàn)調(diào)研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。

當(dāng)前86頁(yè)，總共95頁(yè)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)吸收過(guò)程—空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%～70%Cmax—口服500mg后平均Cmax為2.4～2.6mg/LTmax—1～2hT1/2—血中T1/2約為4h，腎功能減退時(shí)稍有延長(zhǎng)至6h蛋白結(jié)合率—20%～40%代謝—口服給藥24h內(nèi)，40%～50%原形、15%代謝物經(jīng)腎排出當(dāng)前87頁(yè)，總共95頁(yè)。體內(nèi)分析方法

RP-HPLC

色譜柱—ODS色譜柱 流動(dòng)相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液