植物內(nèi)生源產(chǎn)普魯蘭酶細(xì)菌的篩選及其酶活性測定

河南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文目錄3289摘要 I26290ABSTRACT II27097第一章文獻(xiàn)綜述 3322581.1內(nèi)生菌 3147451.1.1內(nèi)生菌的多樣性 3276001.1.2植物內(nèi)生菌的作用 3324261.1.3國內(nèi)外內(nèi)生菌的研究進(jìn)展 4811.2普魯蘭酶 4267921.2.1普魯蘭酶的分類 5214841.2.2普魯蘭酶產(chǎn)生菌的種類 583771.3普魯蘭酶的應(yīng)用 670751.4普魯蘭酶國內(nèi)外的研究進(jìn)展 7106141.5實(shí)驗(yàn)研究的目的及意義 7229191.5.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?7304401.5.2實(shí)驗(yàn)意義 710102第二部分試驗(yàn)部分 919012.1材料與方法 9121782.1.1試驗(yàn)所用材料 9121782.1.2試驗(yàn)所用儀器 9184892.2試驗(yàn)方法 9203382.2.1培養(yǎng)基的配制 9309602.2.2材料的采集處理 10263452.2.3內(nèi)生菌的培養(yǎng) 1096822.2.4劃線純化 10138362.2.5保種 11102822.2.6保種細(xì)菌的劃線培養(yǎng) 1131642.2.7酶活性鑒定 1118762.2.8菌株的鑒定 1123097第三部分結(jié)果與分析 1399403.1試驗(yàn)所用產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離 13325293.2菌株WKX11的產(chǎn)普魯蘭酶活性測定 13210843.3菌株WKX11的鑒定 14168723.3.1菌株WKX11的形態(tài)特征 14324253.3.2WKX11菌株的生理生化鑒定 1538783.3.3菌株ZXYG5的16SrDNA分析 1637433討論 1711728參考文獻(xiàn) 199754致謝 20第一章文獻(xiàn)綜述1.1內(nèi)生菌內(nèi)生菌指的是一類在其生活史中存健康植物各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等等[1]。1.1.1內(nèi)生菌的多樣性經(jīng)過研究研究人員發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌廣泛存在，地球上30萬種的植物中都廣泛存在內(nèi)生菌的[1]。而且科研人員對農(nóng)作物植株內(nèi)生菌的研究種類很多種，比如甜菜、牧草、馬鈴薯、棉花、小麥、甘蔗、玉米、檸檬等等[2]。截止到現(xiàn)在文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了在各種植物內(nèi)生細(xì)菌存在于農(nóng)作物以及經(jīng)濟(jì)作物中的種類就已經(jīng)超過130種，分別屬于49個屬，其主要為土壤桿菌屬克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、甲基桿菌腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、泛菌屬、屬等[3]。1.1.2植物內(nèi)生菌的作用1.1.3國內(nèi)外內(nèi)生菌的研究進(jìn)展在國際范圍內(nèi)，植物內(nèi)生菌最大的研究特點(diǎn)就是物種范圍廣，多樣性豐富，野生資源開發(fā)利用的潛力很大。迄今為止，約有85個屬300多種植物種類中報(bào)道有內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)。在棉花、水稻、狗牙根等一些植物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)具有豐富的內(nèi)生細(xì)菌[8]。相比較其他種類微生物，中國的植物內(nèi)生菌方面的研究起步較晚。1994年，邱德有、朱至清發(fā)表了《一種云南紅豆杉內(nèi)生真菌的分離》，開啟了中國植物內(nèi)生真菌研究的先河[9，10]。1996年，劉云霞等人發(fā)表關(guān)于水稻內(nèi)生細(xì)菌巨大芽孢桿菌分布特征的相關(guān)研究[11]。21世紀(jì)以后，微生物內(nèi)生菌的研究也逐漸得到廣大科研人員的重視，得到了較快的發(fā)展。大量研究文獻(xiàn)表明，植物內(nèi)生菌是一個極為特殊的微生物生存微環(huán)境，孕育的微生物資源極為豐富，是篩選多樣性功能微生物野生資源良好的材料，如產(chǎn)淀粉酶菌株、產(chǎn)甘露聚糖酶菌株等[13]。1.2普魯蘭酶普魯蘭酶pullulanase是一類淀粉脫支酶,可以專一性得水解普魯蘭糖，劃歸淀粉酶類，這種酶可以切開支鏈淀粉分支點(diǎn)處的α-1，6-糖苷鍵，形成直鏈淀粉，與異淀粉酶相比較而言，普魯蘭酶能夠把支鏈分解，可以提高淀粉的利用率，其盡管能分解分支點(diǎn)處的α-1，6糖苷鍵，但是不能分解由兩個或者三個葡萄糖殘基形成成的側(cè)枝。普魯蘭酶的特征是分解普魯蘭糖的最終產(chǎn)物是麥芽三糖。1.2.1普魯蘭酶產(chǎn)生菌的種類普魯蘭酶生產(chǎn)菌株的類型很。不同來源的菌株及酶的特性見表一。表一不同來源的菌株以及酶的特性注：此表中數(shù)據(jù)來源于參考文獻(xiàn)。到現(xiàn)在為止，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多種能夠產(chǎn)普魯蘭酶的微生物，但是絕大部分的野生菌種由于對其所生存的環(huán)境條件要求太高，而且其產(chǎn)酶的活性太低以及其酶學(xué)的分子生物學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等，造成這些產(chǎn)普魯蘭酶的菌種沒有太大的商業(yè)利用價值。因此，到目前為止，已經(jīng)投入到工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)普魯蘭酶的菌株只有丹麥一家公司的Bacillusacidopullulyticus菌株和美國的Genencor公司的Bacillusderamificans菌株等少數(shù)的幾個菌[14]。1.3普魯蘭酶的應(yīng)用近幾年普魯蘭酶的用處十分廣泛，比如在提高淀粉的利用率方面、降低糧耗方面、提高產(chǎn)品質(zhì)量以及開發(fā)新產(chǎn)品等方面有著巨大的價值。而且，普魯蘭酶在很多行業(yè)也有很好的應(yīng)用前景，比如洗滌劑業(yè)、紡織業(yè)、醫(yī)學(xué)等行業(yè)。1.4普魯蘭酶國內(nèi)外的研究進(jìn)展近些年來，蛋白質(zhì)工程的技術(shù)手段飛速發(fā)展。所以利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)去設(shè)計(jì)加工以獲得具有高比活、以及良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的普魯蘭酶也已經(jīng)成為可能，甚至還能夠設(shè)計(jì)出具有優(yōu)質(zhì)金屬離子抗性和蛋白酶抗性。由此看來，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程進(jìn)行普魯蘭酶的各種開發(fā)將要成為未來發(fā)展的大趨勢。開始研究普魯蘭酶到現(xiàn)在已經(jīng)有很長的時間了。1961年，Bender和Wallenfels首次通過產(chǎn)氣氣桿菌（AerobacterAerogenes）的發(fā)酵獲得了普魯蘭酶，打開了研究普魯蘭酶領(lǐng)域的先河[15]。目前而言，在關(guān)于普魯蘭酶的研究大多都集中于產(chǎn)生菌的篩選，當(dāng)然也取得了一定的成效。但是如果要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的普魯蘭酶產(chǎn)生菌的菌種仍不能完全滿足工業(yè)需求。并且從上文所述可知，普魯蘭酶的應(yīng)用多為淀粉糖化工業(yè)，而糖化工藝的作用環(huán)境多為較高溫度和弱酸性，這就為研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)篩選出耐熱耐酸的普魯蘭酶產(chǎn)生菌提出了更高的要求。由于不同來源的普魯蘭酶是由不同環(huán)境下的宿主菌所產(chǎn)生的，所以其酶學(xué)活性也各有差異?？茖W(xué)家們分別對這些來源不同的普魯蘭酶進(jìn)行克隆，同事對其進(jìn)行異源性表達(dá)，研究在來源不同的普魯蘭酶在不同的環(huán)境條件下的結(jié)構(gòu)和功能。此種研究能夠進(jìn)一步的解釋普魯蘭酶結(jié)構(gòu)和功能的對應(yīng)關(guān)系[16]。1.5實(shí)驗(yàn)研究的目的及意義1.5.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^以支鏈淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)和以普魯蘭糖為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基復(fù)篩，從牡丹根、莖、葉中分離得到產(chǎn)普魯蘭酶菌株。通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡的外部形態(tài)觀察、16SrDNA序列分析，最終對本實(shí)驗(yàn)最終篩選出來的產(chǎn)普魯蘭酶的目的菌株進(jìn)行分類鑒定，并采取DNS法測定目的菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的酶活力[17]。實(shí)驗(yàn)旨在了解和掌握產(chǎn)普魯蘭酶的菌株的篩選方法過程以及其特征和所產(chǎn)的普魯蘭酶的酶活性，為其他來源的產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選分離及其酶活性測定提供了一些有益參考，并努力豐富高效產(chǎn)普魯蘭酶的菌株資源庫。1.5.2實(shí)驗(yàn)意義無論是在醫(yī)藥研究方面、分子生物學(xué)研究方面還是在農(nóng)業(yè)研究方面，產(chǎn)酶菌株的研究對這些方面的研究都有著不可估量的意義[18]；植物內(nèi)生菌的分類有很多種，其生物學(xué)作用也都不一樣，這些不同的生物學(xué)特征值得我們?nèi)ャ@研與探索；蒺藜作為我們生活中經(jīng)常遇見的植物，如果對蒺藜植株的內(nèi)生菌進(jìn)行全面的研究作為將來生物技術(shù)研究的新材料。蒺藜在我們?nèi)粘Ｄ闵钪蟹浅３Ｒ?，它本身作用也非常重要，蒺藜的體內(nèi)不僅含有豐富的化學(xué)活性物質(zhì)，蒺藜植株內(nèi)所含的內(nèi)生菌株種類非常多，所以對蒺藜植株內(nèi)的內(nèi)生菌更加深入的研究很有有必要，要更好的理論結(jié)合實(shí)踐，從而才能更好地開發(fā)投入使用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪窃讷@得單一的蒺藜植株內(nèi)生源產(chǎn)普魯蘭酶的菌株并且對其生物學(xué)特征進(jìn)行觀察記錄，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板上對篩選出來的目標(biāo)菌株并且對目標(biāo)菌株的產(chǎn)酶酶活性測定，最后經(jīng)過16SrDNA將目標(biāo)菌株測序獲得的DNA序列進(jìn)行鑒定，以確定該菌株的菌種，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫的比對，確定其系統(tǒng)發(fā)育位。第二部分試驗(yàn)部分2.1材料與方法2.1.1試驗(yàn)所用材料試驗(yàn)所用的蒺藜：采自河南科技大學(xué)周山校區(qū)。試驗(yàn)所用的固體分離培養(yǎng)基：氯化鈉4.5g，蛋白胨9.0g，瓊脂粉17.0g，酵母提取物5.0g，支鏈淀粉4.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0。試驗(yàn)所用的鑒別培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g，普魯蘭糖1.5g，酵母提取物3.0g，氯化鈉4.0g，蒸餾水1000ml，瓊脂粉17.0g，pH7.0。試驗(yàn)所用的LB種子培養(yǎng)基：蛋白胨9.0g，氯化鈉4.0g，酵母粉4.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0。試驗(yàn)所用的產(chǎn)酶培養(yǎng)基：普魯蘭糖3.0g，磷酸氫二鉀1。0g，酵母粉9.0g，磷酸二氫鉀1.0g，七水硫酸鎂0.6g，硫酸鐵0.01g，蒸餾水1000ml，pH7.0。2.1.2試驗(yàn)所用儀器錐形瓶、燒杯、涂布器、電泳槽、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、平板、玻璃棒、千分之一精度天平、接種環(huán)、蠟盤、搖床、烘箱、不同規(guī)格的移液槍、無菌操作臺、恒溫水浴鍋等。2.2試驗(yàn)方法2.2.1試驗(yàn)所用培養(yǎng)基的配制取三只100ml的錐形瓶編號，由于各種培養(yǎng)基均需要300ml，按3:10比例稱取培養(yǎng)基的中所需要的普魯蘭糖，置于小錐形瓶中后，先加入50mL蒸餾水，配成實(shí)驗(yàn)所需的溶液然后將其包好，放入滅菌鍋中高壓蒸汽滅菌，121℃，20min，滅菌后取出放入60℃烘箱。再取三個500ml的容器并且對其做好標(biāo)記，按照試驗(yàn)中所需要的不同種類的培養(yǎng)基的配方稱取所需要的試劑，最后配成250ml的培養(yǎng)液。用攪拌器攪拌，然后緩慢地加入瓊脂，然后用塞子將錐形瓶口密封，用報(bào)紙密封好。然后準(zhǔn)備50個洗凈并且烘干的培養(yǎng)皿，密封后和裝著培養(yǎng)基的錐形瓶一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃，20min。滅菌后培養(yǎng)液自然降溫，培養(yǎng)皿烘干。烘干后把酒精燈、記號筆、培養(yǎng)皿、裝有培養(yǎng)液的錐形瓶以及糖溶液放進(jìn)超凈工作臺。打開紫外燈表面殺菌15min。滅菌完成后，戴上滅菌過的橡膠手套，并且用75％酒精消毒后進(jìn)入超凈工作臺，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，注意一定要無菌條件下將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，以防止雜菌污染，然后對試驗(yàn)所需要培養(yǎng)基做好標(biāo)記，自然冷卻后，開始倒平板。2.2.2材料的采集處理將石蠟放在石棉網(wǎng)上融化。把從河南科技大學(xué)周山校區(qū)采集回來健康的蒺藜植株取根還有莖，將其剪成3～5厘米的小段，把這些蒺藜的根和莖的兩頭用已經(jīng)融化的石蠟封起來，然后用無菌水沖洗，沖洗之后將其放進(jìn)無菌操作臺內(nèi)，然后同時把本實(shí)驗(yàn)中處理材料所用的工具全部放進(jìn)超凈工作臺進(jìn)行紫外線滅菌，打開紫外燈照射滅菌15min。滅菌后戴上滅菌過的橡膠手套，用75％酒精消毒后進(jìn)入超凈工作臺中，然后剪去用石蠟處理過的蒺藜植株的根和莖的兩端，然后把蒺藜的莖還有根放進(jìn)消過毒的研缽中充分研磨成糊狀即可。2.2.3內(nèi)生菌的培養(yǎng)用50微升刻度的移液槍移取20微升糊狀的蒺藜植株的上層清液，然后打在培養(yǎng)基平板的表面，之后用三角涂布器緩慢地的在培養(yǎng)基平板上涂平。不同的培養(yǎng)基至少涂5個平板，便于日后觀察與使用，然后將其做好標(biāo)記。然后把這些培養(yǎng)基平板用干凈的自封袋密封好放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h。培養(yǎng)后將其取出來觀察培養(yǎng)的結(jié)果。2.2.4劃線純化取出培養(yǎng)基觀察其上面的菌株，經(jīng)過老師指導(dǎo)挑選出不同顏色、形狀、大小等形態(tài)特征的菌落對其進(jìn)行編號并準(zhǔn)備進(jìn)一步的把篩選出來的單菌落劃線純化。以2:10的比例按照LB種子培養(yǎng)基的配方稱取試劑，將其攪拌均勻配成培養(yǎng)液，然后倒入洗凈烘干的錐形瓶中，用塞子將瓶口密封。另外取40個已經(jīng)烘干過的的培養(yǎng)基平板用報(bào)紙密封好同錐形瓶一塊放進(jìn)高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121攝氏度，20分鐘。滅菌后將取出放入烘箱中，待培養(yǎng)液降至60℃，培養(yǎng)皿平板烘干后放進(jìn)超凈工作臺內(nèi)，打開紫外燈滅菌15min。滅菌后戴上干凈的橡皮手套，然后用75％酒精噴灑消毒后進(jìn)入超凈工作臺中。點(diǎn)燃酒精燈，將錐形瓶內(nèi)的培養(yǎng)液在酒精燈火焰附近倒進(jìn)烘干的培養(yǎng)皿平板內(nèi)，防止雜菌進(jìn)入，等到自然冷卻凝固后倒平板。將接種所用到的實(shí)驗(yàn)儀器以及滅菌后的培養(yǎng)基平板放入無菌操作臺中，打開紫外燈滅菌15min。紫外燈滅菌后，戴上手套點(diǎn)燃酒精燈，開始接種，接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒，然后把篩選出來單菌落按照編號用接種環(huán)接種到到對應(yīng)編號的平板培養(yǎng)基中劃線，完成后用自封袋密封，將平板培養(yǎng)基放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。培養(yǎng)結(jié)束后取出觀察其表面特征并且記錄拍照。2.2.5保種配制LB種子培養(yǎng)基。然后將密封好的裝有培養(yǎng)液的錐形瓶放進(jìn)高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，121℃，20min，然后將其取出放入烘箱中，到50℃左右時將其放進(jìn)提前滅菌過的無菌工作臺中。同時也把保種所需儀器也放進(jìn)無菌操作臺中。然后滅菌15min。將培養(yǎng)液在酒精燈火焰附近倒入試管中，防止空氣中的雜菌污染。接下來進(jìn)行接種，把接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒滅菌，在酒精燈火焰附近將培養(yǎng)的細(xì)菌的單菌落接種到試管中，作好記錄。接種完成后把這些試管放在搖床中培養(yǎng)1d后取出。培養(yǎng)后將搖床中的試管取出放到無菌工作臺中，同時將所用儀器以及試劑也放進(jìn)無菌工作臺中，滅菌15min。戴上滅菌過的橡膠手套進(jìn)入無菌工作臺，把酒精燈點(diǎn)燃，將試管中培養(yǎng)的菌液接到保種管中，對其編號。然后將甘油移到管中。完成后，將保種管放進(jìn)盒子中密封，做好標(biāo)記。冰箱中4℃保存。2.2.6保種細(xì)菌的劃線培養(yǎng)將保種的細(xì)菌接種到LB種子培養(yǎng)基平板中放進(jìn)很穩(wěn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48個小時，取出觀察其表面特征。注意此操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行，防止雜菌污染造成實(shí)驗(yàn)誤差。2.2.7酶活性鑒定酶活性的鑒定：按產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方稱量試劑，配制成培養(yǎng)液。高壓蒸汽滅菌后放進(jìn)無菌操作臺中，打開紫外燈滅菌15min，將培養(yǎng)液在酒精燈火焰附近倒入培養(yǎng)皿中，自然冷卻倒板后將菌落接種到培養(yǎng)基平板中，然后培養(yǎng)1～2d。2.2.8菌株的鑒定（1）應(yīng)用顯微鏡和電鏡對該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察[15]；（2）菌株的16SrDNA分析將WKX11菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37攝氏度，200轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)12個小時，獲取菌液。采用日本生產(chǎn)的TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkitVer.2.0試劑盒提取WKX11基因組DNA。16SrDNAPCR擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增體系（20μl）如下表：所需材料含量10×ExTaqPCRbuffer2μldNTP（10mmol/ml）1.6μl正、反向引物（20μm/ml）1μlDNA模板1μlExTaqDNA聚合酶0.2μl超純水13.2μl正向引物27F反向引物1501F將獲得到的DNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取相似度最高的10株菌株來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹菌株鑒定參考文獻(xiàn)進(jìn)行[17，18]。第三部分結(jié)果與分析3.1試驗(yàn)所用產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離通過用固體分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)，我獲得一株水解圈較大而且較顯著的菌株，對其編號為WKX11；將這次篩選出來的菌株WKX11通過用鑒別培養(yǎng)基的培養(yǎng)，我們更加明確的確定該菌株具有較高的講解普魯蘭糖的活性（圖1），所以我將WKX11確定為該實(shí)驗(yàn)最終所需的能夠產(chǎn)所需酶的目標(biāo)菌株。圖1WKX11在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板上的降解圈Figure1TheHydrolysiscircleofstrainWKX11inpullulanplate3.2菌株WKX11的產(chǎn)普魯蘭酶活性測定對目標(biāo)菌株的WKX11菌株產(chǎn)酶活性的測定采用DNS法[19]，結(jié)果顯示，在WKX11菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，發(fā)酵48個小時時，普魯蘭酶活性達(dá)到最高4.3U/ml，說明試驗(yàn)篩選出來的目標(biāo)菌株具有很高的產(chǎn)普魯蘭酶活性（圖2）。與類似文獻(xiàn)資料相比，不管從產(chǎn)普魯蘭酶活性還是從發(fā)酵周期來看，WKX11菌株都具有一定的優(yōu)勢，是將來研究良好的備選菌株，該菌株具備進(jìn)一步開發(fā)以及應(yīng)用能力。圖2WKX11菌株的普魯蘭酶活性Figure2TheenzymeproductionofstrainWKX113.3菌株WKX11的鑒定3.3.1菌株WKX11的形態(tài)特征WKX11菌株為桿型細(xì)菌，長1.2～3.0μm，寬0.6～1.0μm，具較小莢膜，該菌株具有運(yùn)動性。37℃條件下，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48個小時，該菌株形成的菌落接近圓形，整個菌落的邊緣不是特別的整齊，菌落的直徑大約1-3mm，表面看上去比較平滑，菌落厚度偏薄，另外，培養(yǎng)24小時候，開始出現(xiàn)紅色色素（圖3a）。運(yùn)用掃描電鏡進(jìn)行顯微觀察時，放大到4500倍，能夠清楚地觀察到菌體的形態(tài)呈桿狀，菌株的兩端呈鈍圓形；菌體的周圍還生有較多的鞭毛（圖3b）。圖3WKX11菌株的形態(tài)特征（a.菌落特征；b.掃描電鏡下的特征）Figure3ThegeneralcharacteristicsofstrainWKX11（a.Colonymorphologycharacteristics；b.ThecharacteristicsunderSEM）3.3.2WKX11菌株的生理生化鑒定WKX11菌株的生理生化測定結(jié)果表明，結(jié)果與文獻(xiàn)中腸桿菌屬（Aerobacter）的描述基本一致（表1）[17]。表1WKX11菌株的生物學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果Table1ThedeterminationresultsofphysiologicalandbiochemicalindexesofstrainWKX11測定項(xiàng)目結(jié)果測定項(xiàng)目結(jié)果革蘭染色-吲哚試驗(yàn)-接觸酶+M．R試驗(yàn)-液化明膠-硝酸鹽還原-過氧化氫酶+V．P試驗(yàn)-注：圖中“+”表示陽性；圖中“-”表示陰性。Note：“+”showpositive；“-”shownegative.3.3.3菌株ZXYG5的16SrDNA分析通過測序，獲得WKX11菌株的16SrDNA基因序列長度為1501bp，測序結(jié)果如下：將測序獲得的目標(biāo)菌株WKX11的保守序列1提交NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的blast程序進(jìn)行在線相似性比對，并選取與目標(biāo)菌株所測得的序列相似度較高的菌株序列構(gòu)建WKX11菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。由系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)菌株WKX11的16SrDNA序列的系統(tǒng)所屬得可信度很高。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株WKX11歸為氣桿菌屬Aerobacter，暫命名為AerobacteraerogenesWKX11。AerobacteraerogenesstrainP4（FJ417401）AerobacteraerogenesstrainBGSC109A1（GU936608）StrainWKX11AerobacteraerogenesstrainP161（FJ808724）Aerobactersp.strainT38（DQ642094）Aerobactersp.strainTD1（GQ355275）AerobacteraerogenesstrainWJ-1（FJ788895）Aerobacterliquefaciens(M77488)AerobactercloacaestrainDSM22T（AJ294817）Aerobactersp.strainGAM4（JX262994）AerobacteraerogenesstrainL33-1（AB548614）Aerobacterdiversumstrain（AY193888）Aerobactersp.strainGAM6（JX262993）99998399968052552圖4構(gòu)建的WKX11系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure4Thephylogenetictreebasedon16SrDNAgenesequencesofWKX113討論普魯蘭酶在有機(jī)化工和生物技術(shù)上的應(yīng)用日趨廣泛，但由于種種條件的限制，我國產(chǎn)普魯蘭酶菌的現(xiàn)狀是產(chǎn)生菌種類較少，已經(jīng)不能滿足有機(jī)化工以及生物技術(shù)的需求。所以現(xiàn)在需要尋找新型的能夠產(chǎn)所需酶的菌株。文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)普魯蘭酶菌株有很多種，但真正投入工業(yè)化生產(chǎn)的菌株卻極其少，原因主要以下兩個：一個是絕大多數(shù)產(chǎn)酶菌株是從土壤中分離獲得，而許多野生菌株并不適合發(fā)酵產(chǎn)酶；另一個是很多菌株產(chǎn)酶活性被提高的潛力有限。本研究從健康蒺藜植株的根和莖中取樣，通過固體分離培養(yǎng)基以及鑒別培養(yǎng)基，從培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選獲得了一株產(chǎn)普魯蘭酶很高的目標(biāo)菌株，我將篩選