趨氧性在植物病原菌青枯雷爾氏菌細(xì)胞薄膜形成及其與番茄寄主互作中的作用

趨氧性在植物病原菌青枯雷爾氏菌細(xì)胞薄膜形成及其與番茄寄主互作中的作用JianYao?andCaitilynAllen*摘要：青枯雷爾氏菌是一種土傳病原菌，造成多種植物的細(xì)菌性枯萎。青枯雷爾氏菌尋找及感染寄主植物需要趨性，所謂趨性就是遷移至更適合環(huán)境的一種能力。然而，病原菌的特殊誘導(dǎo)信號(hào)未見報(bào)道。趨氧性（或者是能量趨性）是這種趨性之一，引導(dǎo)細(xì)菌達(dá)到最佳胞內(nèi)能量水平。將青枯雷爾氏菌內(nèi)編碼趨氧性傳感器的兩個(gè)基因aer1和aer2克隆到大腸桿菌內(nèi)研究這兩個(gè)基因的功能，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在趨氧性傳感中的功能不同。采用定位突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺失其中的1個(gè)基因（aer1或aer2）或者這兩個(gè)基因同時(shí)缺失的突變體與野生菌株相比趨氧能力顯著下降；事實(shí)上aer基因突變體的趨氧性與完全喪失動(dòng)力的菌株沒有任何差別。番茄接種aer2突變體或aer1/aer2突變體的病情發(fā)展都顯著延遲。最重要的是，與野生菌株相比，aer1/aer2雙突變體快速定位番茄根部的能力顯著受損。出乎意料的是所有的非氧趨性突變體在表皮形成比野生菌株厚的多的細(xì)胞薄膜。所有這些結(jié)果顯示能量趨性對(duì)于青枯雷爾氏菌尋找定位寄主及其與寄主植物的相互作用有顯著作用。青枯雷爾氏菌是一種土傳長棒狀的β-變形菌綱的革蘭氏陰性細(xì)菌，能侵染許多重要的植物，例如土豆、煙草、番茄、香蕉和花生(30)，造成細(xì)菌性青枯病。由于該病原菌地理分布廣和寄主范圍極為寬泛（超過50個(gè)屬的植物），給全世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。青枯雷爾氏菌能在水、土壤和感病的植物組織中長期存活，借由土、水、車輛和感病植物組織傳播(30)。病原菌通過寄主根部傷口或者是自然孔（例如側(cè)根根尖）侵入寄主。一旦病原菌侵入易感寄主植物它們就在根外皮和軟組織導(dǎo)管的細(xì)胞空隙中定殖，最終沿著木質(zhì)部到達(dá)植物的上部(59)。青枯雷爾氏菌的致病性十分復(fù)雜，細(xì)菌性青枯病的許多毒力因子已經(jīng)被鑒定出來了，這些因子包括胞外多糖，幾種植物細(xì)胞壁降解酶和一些III型分泌效應(yīng)器(6,20,26,32,39)。細(xì)菌流動(dòng)性，包括鞭毛驅(qū)動(dòng)的游泳和纖毛驅(qū)動(dòng)的顫搐，這些因子對(duì)青枯雷爾氏菌的毒力都是必須的(33,56)。所有這些毒力因子都由一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)控制，使細(xì)菌適應(yīng)不同的生境。Phc（表型轉(zhuǎn)換）系統(tǒng)是這個(gè)調(diào)控網(wǎng)的中樞(51)，phc系統(tǒng)受3-羥基棕櫚酸甲酯這個(gè)鐘擺感應(yīng)分子的控制(15)。許多細(xì)菌利用某種運(yùn)動(dòng)性來感應(yīng)環(huán)境的刺激和移動(dòng)到更有利的條件下生活，這種特性被稱為趨性(7,12),，趨性也直接涉及植物-細(xì)菌之間的相互作用(13,21,22,28,29,62)。有關(guān)趨性的分子機(jī)制在大腸桿菌上已經(jīng)進(jìn)行了深入研究(55,61)，大部分真細(xì)菌都有這種特性。細(xì)胞膜相關(guān)受體（也稱為甲基接受趨化蛋白[MCPs]或者是傳感器）感應(yīng)環(huán)境刺激后做出對(duì)應(yīng)的變化。這些反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞間組氨酸激酶磷酸化（CheA），CheA與MCPs通過雙蛋白相關(guān)（CheW），CheA然后將它的磷酸部分傳給CheY，一個(gè)可傳播的細(xì)胞間反應(yīng)調(diào)控器。磷酸化了的CheY通過結(jié)合到鞭毛發(fā)動(dòng)機(jī)上改變了鞭毛自動(dòng)，結(jié)果導(dǎo)致網(wǎng)狀移動(dòng)到適宜的環(huán)境遠(yuǎn)離有害的環(huán)境(55,61)。我們原來研究發(fā)現(xiàn)番茄的根部分泌物能吸引病原菌青枯雷爾氏菌K60菌株，并且發(fā)現(xiàn)病原菌依靠趨性尋找并在寄主植物根部定殖(62)。非趨性的cheA和cheW青枯雷爾氏菌突變體的致病性下降，與野生菌株相比這些突變體在根部的定殖能力下降(62)。然而，由于這些突變菌株缺乏所有形式的趨性，我們沒有發(fā)現(xiàn)任何類型的趨性的功能，例如對(duì)特殊化合物的趨化性或者是趨氧性。趨氧性，更確切的說是能量趨性，是一種引導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞尋找并定位在哪里他們可以達(dá)到最佳的細(xì)胞內(nèi)能量水平，這種感應(yīng)是通過電子鏈傳遞達(dá)到的(58)。通常是這樣的，但不是所有情況下都能達(dá)到最佳的氧氣濃度(58)。運(yùn)動(dòng)型細(xì)菌普遍具有能量趨性，并且能量趨性在細(xì)菌的生命周期中具有重要的生態(tài)作用(1,58)。大腸桿菌的趨氧性的分子機(jī)制已進(jìn)行了深入研究，通過監(jiān)測細(xì)胞能量變化狀況發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞膜相關(guān)受體蛋白Aer和Tsr與趨氧性傳感器的作用一樣(11,18,23,27,48,49,60)。與植物相關(guān)的細(xì)菌中，研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa和惡臭假單胞菌P.putida的Aer受體蛋白在趨氧性的信號(hào)轉(zhuǎn)換方面有重要作用(31,43)，氧對(duì)固氮螺菌Azospirillumbrasilense的化學(xué)感應(yīng)蛋白在調(diào)節(jié)能量趨性和促進(jìn)根部定殖方面有重要作用(28)。雖然趨氧性行為在40多年前就在青枯雷爾氏菌上發(fā)現(xiàn)(35)，趨氧性在這個(gè)病原菌生活周期中的作用仍然未知。在本研究中，我們在青枯雷爾氏菌K60菌種中鑒定了兩個(gè)趨氧性必需受體蛋白Aer1和Aer2，這兩個(gè)蛋白的功能與大腸桿菌的趨氧性傳感器的功能相同。我們研究證實(shí)青枯雷爾氏菌的毒性和在寄主植物根部的快速定殖需要趨氧性。此外，我們發(fā)現(xiàn)趨氧性在表層細(xì)胞膜的形成中也有重要作用。這些結(jié)果顯示趨氧性行為在青枯雷爾氏菌生活史中有重要作用，可以調(diào)控病原菌在不同寄主之間轉(zhuǎn)移。材料與方法試驗(yàn)菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1，除了下述的群集平板測試中大腸桿菌用LB培養(yǎng)基于37℃下培養(yǎng)(40)。所有青枯雷爾氏菌在CPG培養(yǎng)基和TZC平板上繼代培養(yǎng)或保存(34).根據(jù)培養(yǎng)需求在培養(yǎng)基中添加抗生素安芐（大腸桿菌100μg/ml，青枯雷爾氏菌250μg/ml）、慶大霉素（15μg/ml）、卡那霉素（25μg/ml）、鏈霉素（50μg/ml）和四環(huán)素(10μg/ml)。如前所述用緩沖后的基本培養(yǎng)基（加入10mM葡萄糖）、CPG培養(yǎng)基和煙草葉（Nicotianatabacumcv.Bottomspecial）(56)來進(jìn)行青枯雷爾氏菌野生菌株和突變菌株的對(duì)比試驗(yàn)(62)。DNA重組技術(shù)粘粒、質(zhì)粒、基因組DNA的分離，以及克隆，PCR擴(kuò)增和Southern雜交都是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(8)進(jìn)行。大腸桿菌和青枯雷爾氏菌的轉(zhuǎn)化操作參照文獻(xiàn)(3)進(jìn)行。DNA序列分析在Wisconsin-Madison生物技術(shù)中心進(jìn)行。青枯雷爾氏菌UW551菌株、GMI1000菌株的基因組數(shù)據(jù)和Jellyfish3.0software(FieldScientific,Lewisburg,PA)用來研究分析DNA序列數(shù)據(jù)。分子生物學(xué)試劑購自Promega(Madison,WI)或者是Invitrogen(Carlsbad,CA)寡居核苷酸的合成來自IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA)。青枯雷爾氏菌aer1和aer2突變體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增1465bp的DNA片段（包含部分青枯雷爾氏菌K60菌株的aer1基因），所用引物：aer1-F(5′-ATGCGCGTCAACGAACCC)和aer1-R(5′-ACCAGCGTGGCGTTCTCC)，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pSTBlue-1載體構(gòu)建pSJYaer1重組質(zhì)粒。從耐慶大霉素的pUUGM載體插入aer1片段的SacII酶切位點(diǎn)后構(gòu)建pSJYaer1::Gm突變重組質(zhì)粒。采用引物aer2-F(5′-CGCATTGGAAGACCGATAG)和aer2-R(5′-ATCTGTACGACGGTGGTGGT)PCR擴(kuò)增2309bp包含K60菌株的aer2基因全長的片段，將該片段克隆入pSTBlue-1載體形成重組質(zhì)粒pSJYaer2。將耐卡那霉素的pVO155插入aer2基因平端的BglII-BstEII酶切位點(diǎn)。形成的aer2::Km重組質(zhì)粒插入pSTSM載體的EcoRI酶切位點(diǎn)，形成pSSJYaer2::Km突變重組質(zhì)粒。通過同源重組技術(shù)將aer1::Gm和aer2::Km重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入K60菌株的基因組，形成aer1突變體K770和aer2突變體K773(3)。將aer2::Km重組子采用同樣技術(shù)轉(zhuǎn)入K770突變株，形成aer1和aer2雙突變菌株K774。GFP標(biāo)記K774菌株形成K774GFP菌株(38)，從GFP標(biāo)記的K60GFP菌株的基因組Tn5::gfp38插入片段轉(zhuǎn)入K774基因組。這個(gè)Tn5::gfp38插入片段在所有菌株中的位點(diǎn)相同，前述研究發(fā)現(xiàn)該插入片段的連續(xù)表達(dá)對(duì)菌株的流動(dòng)性、趨性、毒力和生長速率沒有影響(36,60)。采用類似的方法，采用自然變換的方法將cheW突變體K760菌株的cheW::Km突變片段轉(zhuǎn)入GFP標(biāo)記的K60GFP菌株構(gòu)建K760GFP重組子(38,62).每個(gè)突變菌株等位變異的正確性通過PCR擴(kuò)增和Southern雜交證實(shí)，采用耐慶大霉素和/或卡那霉素的標(biāo)記后的aer1和/或aer2基因及其側(cè)翼部分片段作為雜交探針?；パa(bǔ)試驗(yàn)采用aer1和aer2序列作為菌落雜交的探針，研究了青枯雷爾氏菌K60菌株粘粒文庫(3)，粘粒p13-6和p18-9分別含有aer1和aer2基因的全長序列。為深入研究aer1和aer2基因的在功能，分別將去除起始密碼子ATG的1548bp（包含aer1基因全長）和1598bp（包含aer2基因全長）的兩個(gè)DNA片段分別用高保真pfuUltraDNA聚合酶（Stratagene,LaJolla,CA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，粘粒p13-6作為aer1基因PCR擴(kuò)增的模板，aer1基因擴(kuò)增的引物為aer1-F1(5′-cacgaattcCGTGTCAACGAACCCGTTAC)和aer1-R1(5′-ccaaagcttTCAGCGGAACACGCCGAC)，粘粒p18-9作為aer2基因PCR擴(kuò)增的模板，aer2基因擴(kuò)增的引物為aer2-F1(5′-tctgaattcCGAAACAACCTGCCGGTCAC)和aer2-R2(5′-tctaagcttacggcTCAAGCGCGGAACAC)。每條引物的末端加入內(nèi)切酶EcoRI或HindIII的酶切位點(diǎn)（用斜體標(biāo)示）便于進(jìn)一步的深入研究。PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI和HindIII的雙酶切，將酶切后產(chǎn)物克隆到pTrc99A質(zhì)粒的EcoRI和HindIII的酶切位點(diǎn)上構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pTJYaer1和pTJYaer2，通過序列分析驗(yàn)證重組質(zhì)粒，將這兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入趨氧性大腸桿菌突變株UU1117(11)andBT3388(63)研究基因的功能。為進(jìn)行青枯雷爾氏菌acer1和acer2突變菌株的補(bǔ)充試驗(yàn)，引入mini-Tn7轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(14)，將aer1和aer2完整的基因全長插入attTn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，位于青枯雷爾氏菌基因glmS下游25bp處。從粘粒p13-6得到一個(gè)2.3kb的片段包含aer1基因全長拷貝亞克隆入pJY-mini-Tn7T-SmΩ載體，構(gòu)建pJYTn7aer1重組質(zhì)粒。同樣來自粘粒p18-9的一個(gè)3.4kb的片段包含aer2基因全長拷貝亞克隆入pJY-mini-Tn7T-SmΩ載體和pJYTn7aer1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJYTn7aer2和pJYTn7aer1/2，在質(zhì)粒pTNS1(14)的輔助下將重組質(zhì)粒pJYTn7aer1、pJYTn7aer2和pJYTn7aer1/2通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入K770、K773和K774菌株中，形成對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)入互補(bǔ)菌株。一個(gè)空載體pJY-mini-Tn7T-SmΩ和質(zhì)粒pTNS1電轉(zhuǎn)化入K60、K770、K773和K774菌株作為陰性對(duì)照。目的菌株的篩選通過添加專用抗生素的TZC平板進(jìn)行耐鏈霉素（Smr）和感安芐（Ams）篩選。mini-Tn7轉(zhuǎn)座子及其衍生菌株采用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，驗(yàn)證所用引物glmSu(5′-GAATACCGTTACCGCGACAC)和Tn7R(5′-CAGCATAACTGGACTGATTT)。細(xì)菌行為特性試驗(yàn)大腸桿菌趨氧性和趨化性試驗(yàn)在基礎(chǔ)半固體瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行，培養(yǎng)基分別含有40mM的丁二酸鈉和1mM甘油(11)。青枯雷爾氏菌趨化性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)(62)進(jìn)行。aer基因采用leakytac啟動(dòng)子在pTrc99A質(zhì)粒中進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，沒有加入IPTG誘導(dǎo)(27)。青枯雷爾氏菌的趨氧性測定采用改進(jìn)的化學(xué)趨性測定方法進(jìn)行(54)。采用96孔槽的巢式MultiScreen-MICPlates(Millipore,Billerica,MA)進(jìn)行趨氧性測定代替單孔槽測定方法。青枯雷爾氏菌在CPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)濃度達(dá)到OD600值0.3-0.7，離心收集菌體細(xì)胞，用化學(xué)趨性緩沖液清洗2次(62)，重新懸浮，OD600達(dá)到0.01?？撞蹆?nèi)加入150μl細(xì)菌懸浮液，孔槽有頂部過濾盤，每個(gè)孔槽的底部留有8μm直徑的過濾器，孔槽加入50μl的化學(xué)趨性緩沖液并且直接接觸空氣，這樣可以使氧氣傳播入上部槽的培養(yǎng)基中，在下部孔槽和上部孔槽之間形成氧氣梯度差。上部接收過濾器槽與槽底的細(xì)菌懸浮液接觸以便于細(xì)菌在不同氧氣梯度的作用下能夠通過過濾器泳動(dòng)到上部盤中。室溫下接種30min后，上部槽和下部槽中細(xì)菌的數(shù)量通過稀釋涂TZC平板計(jì)數(shù)。趨氧性指數(shù)=遷移至上部槽中細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量/上下槽中細(xì)菌總的數(shù)量。每株細(xì)菌，在兩個(gè)槽中分別取3次試驗(yàn)的平均值為趨氧性指數(shù)。致病性測定用自然種植的易感病番茄植株(LycopersiconesculentumMill.cv.BonnyBest)來測定青枯雷爾氏菌突變株的致病性(62)。將青枯雷爾氏菌懸浮液澆灌入培養(yǎng)16d的番茄植株土壤中（終濃度為3×107CFU/g），植株置于28℃下培養(yǎng)，逐日記錄發(fā)病情況，采用0-4級(jí)病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，0=健康植株，1=1-25%的葉部萎焉，2=26-50%葉部萎焉，3=51-75%葉部萎焉，4=76-100%葉部萎焉。每處理16株番茄，4個(gè)重復(fù)。番茄幼苗根部定殖及觀察試驗(yàn)番茄種子(cv.BonnyBest)表面消毒后，栽培及生長參照文獻(xiàn)(62)，用1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替1%瓊脂培養(yǎng)基(42)，不添加任何碳源和植物激素。取5-8cm的完整幼苗根做下述試驗(yàn)。青枯雷爾氏菌懸浮液的準(zhǔn)備同趨氧性試驗(yàn)。兩株番茄幼苗的完整根部接種到5ml的K60GFP、K774GFP或K760GFP懸浮液中置于室溫下培養(yǎng)。30min后，無菌水清洗幼苗根部并用濾紙吸干。然后，切除一組幼苗的根部，用掃描電鏡鏡檢幼苗根部并拍照。切除匹配的1組幼苗根部，稱重后置于無菌水中，稀釋涂TZC平板計(jì)數(shù)粘附于根部的細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌數(shù)量與幼苗根部鮮重的比值進(jìn)行定殖統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞薄膜試驗(yàn)稍作修改采用PVC微孔板測定青枯雷爾氏菌細(xì)胞薄膜的形成(46)。收集青枯雷爾氏菌過夜培養(yǎng)液并離心，在CPG培養(yǎng)基中重懸浮，調(diào)整OD600達(dá)到0.1。每個(gè)PVC微孔中置入95μlCPG培養(yǎng)基，將5μl青枯雷爾氏菌懸浮液接種到CPG培養(yǎng)基中。微孔板用塑料包裹封住，靜置于28℃培養(yǎng)24h。水晶紫染色參照文獻(xiàn)(46)進(jìn)行細(xì)胞薄膜測定，在530nm處觀察吸光值。數(shù)據(jù)分析趨氧性指數(shù)、每天的病情指數(shù)、細(xì)菌在根部定殖數(shù)和細(xì)胞薄膜數(shù)據(jù)的采用方差(ANOVA，95%)顯著性檢驗(yàn)。在某些情況下，采用Fisher最小顯著性檢驗(yàn)法檢驗(yàn)和比較處理間差異（95%置信限）。所有統(tǒng)計(jì)分析采用MINITAB14(Minitab,StateCollege,PA)軟件。序列登陸號(hào)序列登陸號(hào)分別為EF450772和EF450771。結(jié)果青枯雷爾氏菌K60菌株有2個(gè)趨氧性傳感器青枯雷爾氏菌GMI1000和UW551菌株的基因組全序列已測定，超過20種必需的甲基接受趨化蛋白已經(jīng)被鑒定(25,50)。采用基因同源性策略，根據(jù)大腸桿菌趨氧性傳感基因Aer(EcAer)的蛋白序列(11,48)采用BLASTP程序比對(duì)(4)發(fā)現(xiàn)在青枯雷爾氏菌中2個(gè)這種必需蛋白（GMI1000中的RS03168序列和RS03711序列，UW551中的RRSL_01121序列和RRSL_01710序列）與大腸桿菌的趨氧性蛋白EcAer有極高相似性，期望值小于e?89。GMI1000中編碼RS03168的基因以及其在UW551菌株中編碼RRSL_01121的同源基因命名為aer1，GMI1000中編碼RS03711的基因以及其在UW551菌株中編碼編碼RRSL_01710的基因命名為aer2基因。青枯雷爾氏菌的aer1和aer2基因極為相似，期望值小于e?80。依據(jù)GMI1000菌株和UW551菌株的基因組序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增K60菌株的aer1和aer2基因。青枯雷爾氏菌K60菌株的基因組序列還沒有測定，但K60菌株的全序列與UW551菌株的相似度大于與GMI1000菌株（數(shù)據(jù)未顯示）。依據(jù)GMI1000和UW551菌株的序列設(shè)計(jì)引物從K60菌株中PCR擴(kuò)增aer1和aer2基因全序列。1,465-bp的和2309bp的PCR產(chǎn)物分別克隆到pSJYaer1質(zhì)粒和pSJYaer2質(zhì)粒中作為雜交探針，采用單菌落雜交的方法檢測青枯雷爾氏菌K60菌株的粘粒文庫。粘粒p13-6和p18-9分別包含青枯雷爾氏菌K60菌株的aer1和aer2基因的序列全長。aer基因進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆和序列分析。測序分析與菌株K60、UW551、GMI1000的aer1和aer2基因微共線性的這些片段(Fig.1A)(25,50)。在K60菌株中距aer1基因的5’端361bp有一個(gè)編碼異戊烯轉(zhuǎn)移酶的必需基因ipt。另一個(gè)編碼鈉離子轉(zhuǎn)移蛋白的NarK基因的位于距aer1基因3’端379bp的位置。在aer2基因的5’端有一個(gè)編碼假定蛋白的開放閱讀框和一個(gè)編碼鐵細(xì)胞互作蛋白的viuB必需基因，這兩個(gè)基因的方向相同，與aer2基因的方向相反。另一個(gè)編碼假定蛋白的開放閱讀框位于aer2基因的3’端(Fig.1A)。反推獲得的K60菌株的Aer1和Aer2蛋白的分子量分別為55.1和56.1kDa。利用SMART和DAS軟件(16,52)分析K60菌株的Aer1和Aer2蛋白的結(jié)構(gòu)，結(jié)果證實(shí)與大腸桿菌的aer1和aer2蛋白結(jié)構(gòu)相似(Fig.1B)(11,48)。大腸桿菌的Aer蛋白的PAS（作用于晝夜調(diào)節(jié)蛋白，Ah受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，single-minded蛋白）氮端特征和PAC（PAS相關(guān)氮端）結(jié)構(gòu)域需要FAD結(jié)合和氧化還原感應(yīng)(49,64)。Aer1和Aer2蛋白的膜拓?fù)鋮^(qū)域有兩個(gè)轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的Aer蛋白相似(11,48)。氮端HAMP（組氨酸磷酸酶，腺苷酸環(huán)化酶，甲基結(jié)合蛋白，蛋白磷酸酶）和MA(類化學(xué)趨性甲基受體)結(jié)構(gòu)域(Fig.1B)也與大腸桿菌的Aer蛋白類似，該結(jié)構(gòu)域形成了細(xì)菌趨化感應(yīng)傳感器，在受到刺激后傳遞信號(hào)(5,24)。青枯雷爾氏菌中Aer1和Aer2蛋白的功能與大腸桿菌的趨氧傳感器類似。為研究這兩個(gè)蛋白的功能異質(zhì)性，將青枯雷爾K60菌株的兩個(gè)aer1和aer2基因克隆到pTrc99A載體，由Ptac啟動(dòng)子啟動(dòng)，IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pTJYaer1andpTJYaer2在大腸桿菌中的表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。所有重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌具有趨化性的菌株UU1117(11)和缺失所有趨化傳感器（5個(gè)）的大腸桿菌突變株BT3388(63)。我們只所以選擇BT3388菌株是因?yàn)樵摼耆笔Я薃er和Tsr趨化傳感器。采用軟-瓊脂群集盤試驗(yàn)研究了所有轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株的行為特性。兩個(gè)質(zhì)粒pTJYaer1和pTJYaer2與含有大腸桿菌aer基因的pGH1一樣均能使aer突變菌株UU1117菌株產(chǎn)生趨氧性聚集在丁二酸鹽培養(yǎng)基中(Fig.2A)。這表明K60菌株的Aer1和Aer2蛋白與大腸桿菌的趨氧性傳感器的功能一樣。有趣的是，敲掉所有傳感器的BT3338菌株在轉(zhuǎn)入pTJYaer1質(zhì)粒后在甘油培養(yǎng)基上的趨性反應(yīng)比轉(zhuǎn)入pTJYaer2質(zhì)?；騪GH1強(qiáng)烈(Fig.2B)。這種更強(qiáng)烈的趨性反應(yīng)揭示了Aer1蛋白的改變大腸桿菌的能量趨性的作用更大。青枯雷爾氏菌缺失aer1基因或aer2基因的突變體，或者是這兩個(gè)基因都缺失的突變體都不再有趨氧性為進(jìn)一步深入研究青枯雷爾氏菌的Aer1和Aer2蛋白的功能。我們構(gòu)建了3個(gè)定位的青枯雷爾氏菌K60菌株aer突變體。青枯雷爾氏菌aer1突變體K770、青枯雷爾氏菌aer2突變體K773是通過在aer1和aer2基因的開放閱讀框內(nèi)插入慶大霉素和卡那霉素抗性基因產(chǎn)生的(Fig.1A)，這兩個(gè)突變體又組合到一起構(gòu)建了aer1和aer2雙基因突變體K774菌株。所有菌株與親本菌株K60菌株一樣均能在CPG培養(yǎng)基、緩沖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BMM培養(yǎng)基中加入10mM葡萄糖或蘋果酸鹽）和寄主植物（煙草葉）中正常生長（數(shù)據(jù)未顯示）。3株突變體在顯微鏡下菌能正常泳動(dòng)，在平板上對(duì)蘋果酸鹽均有化學(xué)趨性，這表明這些突變體的主要流動(dòng)功能以及一般的化學(xué)趨性沒有任何變化（數(shù)據(jù)未顯示）。趨氧性與氧氣濃度的梯度關(guān)系用聚集化學(xué)趨性板方法進(jìn)行了測試。在這30分鐘的試驗(yàn)中，8.1%的野生菌株K60細(xì)胞移動(dòng)到氧濃度較高的盤內(nèi)，而氧濃度較高的盤內(nèi)的aer1突變株K770細(xì)胞含量顯著少于野生菌株（3.4%），aer2突變株K773的含量更低（1.2%），aer1/2雙突變株K774的含量最低（0.7%）(Fig.3B)。這個(gè)結(jié)果顯示Aer1和Aer2蛋白在青枯雷爾氏菌中的功能就是趨氧性傳感器。此外，K770和K774之間的氧趨性能力存在顯著差異，但是K773菌株和K774菌株之間沒有顯著差異(Fig.3A)，這表明Aer2蛋白在引導(dǎo)青枯雷爾氏菌菌株到達(dá)適宜的氧狀況中發(fā)揮的作用比Aer1蛋白大。完整拷貝的aer1或aer2基因插入attTn7位點(diǎn)可以完全恢復(fù)K770和K773突變株的趨氧性能力(Fig.3B)。但是，采用相同的方法的互補(bǔ)試驗(yàn)卻未能完全恢復(fù)K774菌株的趨氧性能力，但互補(bǔ)試驗(yàn)處理后菌株的趨氧性指數(shù)也由0.98%顯著提高到5.1%(Fig.3B)。青枯雷爾氏菌aer2突變株顯著延遲了番茄青枯病的發(fā)展我們以前的研究發(fā)現(xiàn)移動(dòng)趨性在青枯病早期的擴(kuò)展中發(fā)揮了重要作用(62)。然而，由于所有的非趨性菌株研究都把全部的趨性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑損壞，這些研究無法鑒定特異類型的趨性功能，例如趨氧性。為鑒定趨氧性在青枯病發(fā)展中的作用，我們在番茄敏感寄主上開展了兩類毒力試驗(yàn)。在自然的土壤滲透試驗(yàn)中，要求細(xì)菌從土壤中尋找定位并侵染寄主植物，野生菌株K60在接種14天后的平均病情指數(shù)為3.84，這比aer1突變株K770（3.68）、aer2突變株K773（3.55）和aer1/2雙突變株K774（3.68）都高一些，但差異不顯著(Fig.4)。但是，在接種后5到7天病情進(jìn)展曲線的整體形狀卻有所不同，K773和K774菌株都缺失了Aer2功能蛋白，造成的病情嚴(yán)重度顯著低于野生親本菌株(P<0.05[ANOVA])(Fig.4)。然而突變株K770與野生親本菌株K60在任何時(shí)間點(diǎn)都不存在顯著差異(Fig.4)。這個(gè)結(jié)果表明在這個(gè)試驗(yàn)中是Aer2蛋白促進(jìn)青枯病的快速發(fā)展，不是Aer1蛋白，有可能因?yàn)橼呇跣栽诓≡趯ふ叶ㄎ患闹髦参锔砍跏茧A段具有重要作用（見下述試驗(yàn)）。相反，在切柄接種試驗(yàn)中，這些菌株直接侵入番茄木質(zhì)部組織中在任何時(shí)間段內(nèi)都不存在顯著差異（數(shù)據(jù)未顯示），這與我們先前預(yù)料的趨性在青枯雷爾氏菌直接侵入植物后不是致病性發(fā)展的必須因素是相一致的(62)。Aer1/aer2突變株不能迅速尋找定位并聚集到番茄幼苗根部采用綠色熒光蛋白GFP電轉(zhuǎn)化青枯雷爾氏菌aer1/aer2突變株K774，K774GFP菌株是通過將具有很好標(biāo)記功能能持續(xù)表達(dá)的Tn5::gfp重組子導(dǎo)入K774菌株基因組。這讓我們可以通過熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察青枯雷爾氏菌熒光標(biāo)記細(xì)胞與番茄幼苗根部的相互作用。主要結(jié)果見圖Fig.5AtoC。接種30min后寄主根部表面檢測到的青枯雷爾氏菌更接近野生的菌株K60GFP細(xì)胞(Fig.5A)的數(shù)量比非趨氧性菌株K774GFP(Fig.5B)或完全喪失趨性的菌株K760GFP細(xì)胞(Fig.5C).數(shù)量更多。細(xì)菌細(xì)胞喜歡聚集在根冠后延伸區(qū)以及根尖部位。看上去K774GFP菌株細(xì)胞在番茄根部表面的定殖比完全喪失趨性的菌株K760GFP細(xì)胞更好一些，但在顯微鏡鏡檢數(shù)量差異不顯著。在接種30min后，直接沖洗計(jì)數(shù)附著在植物根部的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)野生K60GFP細(xì)胞的數(shù)量顯著高于aer1/aer2突變株K774GFP菌株和完全喪失趨性的突變菌株K760GFP菌株細(xì)胞的數(shù)量(Fig.5D)。這些結(jié)果表明趨氧性有利于青枯雷爾氏菌在寄主根部快速尋找定位和定殖。更重要的是，非趨氧性突變株K774GFP菌株和完全喪失趨性的突變株K760GFP菌株(Fig.5D)的差異表明還有其它類型的趨性也有助于病原菌這種尋找定位和定殖的行為特性。Aer1和aer2基因影響表層細(xì)胞薄膜的形成我們觀察發(fā)現(xiàn)在攪動(dòng)下能在CPG培養(yǎng)基中時(shí)常出現(xiàn)K770、K773、K774菌株細(xì)胞團(tuán)。顯微鏡研究揭示這些細(xì)胞聚集物與其它細(xì)菌系統(tǒng)的細(xì)胞薄膜類似(17)。我們采用標(biāo)準(zhǔn)PVC微孔板測試研究青枯雷爾氏菌細(xì)胞薄膜形成中趨氧性的作用。青枯雷爾氏菌接種CPG培養(yǎng)基靜置于28°C下培養(yǎng)24h，細(xì)胞薄膜帶在氣液表層形成(Fig.6A)。有趣的是，青枯雷爾氏菌非趨氧性突變株K773和k774、非趨性突變株K760和不動(dòng)的突變株K701的細(xì)胞薄膜的形成量顯著高于野生菌株K60(Fig.6)。然而，以缺乏IV型纖毛細(xì)胞薄膜形成量很少的突變株pilQ(36)為對(duì)照，盡管aer1突變株K770菌株的細(xì)胞薄膜的形成量高于野生菌株K60，但通過Fisher最小顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者無顯著差異(Fig.6B)。討論趨性在青枯雷爾氏菌生活史中具有重要的作用(62)，但在特殊類型的趨性的功能，例如趨氧性的功能方面還是未知的。我們鑒定和研究了青枯雷爾氏菌K60菌株的兩個(gè)同源Aer蛋白。兩個(gè)青枯雷爾氏菌的Aer蛋白的結(jié)構(gòu)域(Fig.1B)與大腸桿菌能量趨性蛋白類似(11,23,48,60)。青枯雷爾氏菌的Aer1和Aer2蛋白都能恢復(fù)大腸桿菌aer突變體的趨氧性(Fig.2A)。然而，Aer1蛋白在甘油培養(yǎng)基上對(duì)完全喪失趨性的大腸桿菌突變體的功能恢復(fù)方面比Aer2蛋白以及大腸桿菌Aer蛋白更好，這說明在這種條件下Aer1蛋白比Aer2或大腸桿菌Aer蛋白具有更好的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(Fig.2B)。這種差別也許是因?yàn)锳er1蛋白在大腸桿菌中更穩(wěn)定些，在甘油能源存在的情況下對(duì)氧濃度變化更敏感些。野生K60菌株比能動(dòng)的aer突變體細(xì)胞遷移到高氧濃度區(qū)域的頻率顯著提高，這與先前報(bào)道的青枯雷爾氏菌具有趨氧性是相一致的(35)。由于不管是既沒有移動(dòng)性也沒有趨性的cheWK760突變株還是不動(dòng)的fliC突變體K701菌株都能移動(dòng)到氧濃度相當(dāng)高的位置，這是因?yàn)檫@種遷移行為不是隨機(jī)游泳或者是簡單的傳播(Fig.3A)。有趣的是，aer1突變體K770比aer2突變體K773的趨氧性更高一些(Fig.3A)，說明兩種Aer蛋白對(duì)趨氧性行為的作用是不同的。轉(zhuǎn)入野生菌株的趨氧性基因可以恢復(fù)aer1、aer2和aer1/aer2突變株的趨氧能力，但不能完全恢復(fù)aer2突變株的趨氧性(Fig.3B)?；蛟S是由于aer2基因由Tn7轉(zhuǎn)座子重組后插入的位點(diǎn)在att位點(diǎn)而不是它在基因組中原來的位點(diǎn)造成Aer2蛋白表達(dá)的水平與野生菌株有差別，另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌內(nèi)Aer蛋白的準(zhǔn)確表達(dá)對(duì)于正常功能具有重要作用。我們采用更適宜的聚集盤方法來測定青枯雷爾氏菌的趨氧性而不是傳統(tǒng)的毛細(xì)管趨氧性測試方法(48)，氣泡測試法以及軟瓊脂聚集盤測試法都不能準(zhǔn)確測試青枯雷爾氏菌的趨氧性（數(shù)據(jù)未顯示）。青枯雷爾氏菌在毛細(xì)管試驗(yàn)中未能形成明顯的趨氧性條帶，在氣泡附近也不能聚集，事實(shí)上，青枯雷爾氏菌對(duì)不同氧梯度的明顯反應(yīng)通過改變行為特性，例如細(xì)胞泳動(dòng)速度加快或者是泳動(dòng)細(xì)胞比例的增加來體現(xiàn)的（數(shù)據(jù)未顯示）。我們的研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌聚集在離毛細(xì)管開口幾毫米的地方和軟瓊脂次管的下層，說明細(xì)菌喜歡中濃度的氧而不是高濃度氧。這或許與它們適于在植物根圍和木質(zhì)部組織定殖有一定關(guān)系。事實(shí)說明青枯雷爾氏菌的Aer1和Aer2蛋白具有趨氧性功能，aer1/aer2突變體缺乏趨氧性功能，這說明在這些條件下這兩個(gè)基因是唯有的兩個(gè)青枯雷爾氏菌趨氧性功能基因。然而，由于在青枯雷爾氏菌GMI1000和UW551菌株的基因組中有超過20種基因編碼類化學(xué)趨性蛋白(25,50)，或許在不同條件下也有其它基因有趨氧性轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。在細(xì)菌A.brasilense基因組最近新鑒定了一個(gè)趨氧性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，青枯雷爾氏菌的Tlp1基因（GMI1000菌株中的RS00467和UW551菌株中的RRSL_03970）與該基因是同源基因(28)，青枯雷爾氏菌的基因組中還有大腸桿菌中的Tsr基因的同源基因，其功能也與趨氧性轉(zhuǎn)導(dǎo)相同(48)。采用具有生物學(xué)代表性的澆灌土壤接種法測試發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌aer2和aer1/aer2突變株能延遲敏感番茄植株發(fā)病(Fig.4)。但在切柄接種試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)這種情況（數(shù)據(jù)未顯示）。這與我們先前的試驗(yàn)相一致，一旦細(xì)菌進(jìn)入寄主植物導(dǎo)管系統(tǒng)，病情發(fā)展不再需要趨性移動(dòng)。致病性的變化不是由于長勢差，因?yàn)橥蛔冎闗773和K774菌株在合成培養(yǎng)基上和植物體內(nèi)的長勢和野生菌株K60一樣好（數(shù)據(jù)未顯示）。我們推測在感應(yīng)能量最佳狀況的引導(dǎo)下青枯雷爾氏菌到達(dá)營養(yǎng)外滲的根部，例如延伸區(qū)，在這個(gè)區(qū)域我們在顯微鏡下觀察到細(xì)菌快速聚集的情況，或者是到達(dá)次級(jí)的根孔，這些地方都是病原菌初始侵入的地方(19)。然而，在類似的試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)完全喪失趨性的cheA或者是cheW突變體比aer2突變株的致病性更低(62)。這表明除趨氧性之外至少還有一種趨性引導(dǎo)青枯雷爾氏菌到達(dá)植物根部和寄主內(nèi)適宜定殖的地方?？紤]到基因組中編碼的必需蛋白的數(shù)量相當(dāng)多，看上去病原菌已經(jīng)形成整套的綜合區(qū)分和對(duì)復(fù)雜的環(huán)境信號(hào)做出反應(yīng)的機(jī)制。在微生物與寄主植物、環(huán)境之間相互作用中趨氧性可能的生態(tài)功能我們已經(jīng)深入討論過(2,58)，生防菌A.brasilense在小麥根部的有效附著和定殖都需要能量趨性(28)。為更好的理解青枯雷爾氏菌趨氧性的潛在功能在病原菌早期在尋找定位并定殖寄主根部的作用，我們采用GFP標(biāo)記追蹤青枯雷爾氏菌。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞接種到番茄幼苗根部，在30min內(nèi)青枯雷爾氏菌野生菌株細(xì)胞在根表層大量聚集。青枯雷爾氏菌aer1/aer2突變株K774并沒有顯示出這種行為特性，盡管K774菌株在尋找寄主根部的能力方面比完全喪失趨性的K760菌株要好些(Fig.5A)。看來我們觀察到的aer2突變株的致病性下降是由于該菌株缺乏在發(fā)病早期階段尋找和定殖的能力。細(xì)胞薄膜就是聚集的微生物嵌入大量的胞外多聚體并且彼此吸附在表皮形成的膜，因此形成整套的適應(yīng)環(huán)境變動(dòng)的行為方式(17,41)。許多植物相關(guān)的細(xì)菌形成組織狀的細(xì)胞薄膜與有生命的或無生命的環(huán)境互作(17,41)。盡管感覺細(xì)胞薄膜在青枯雷爾氏菌-寄主互作中有重要作用(41)，這方面的研究很少(33)。我們已經(jīng)觀察到青枯雷爾氏菌在番茄幼苗根部表層形成細(xì)胞薄膜狀聚集物(62)，我們推測在植物內(nèi)部，細(xì)胞薄膜有助于病原菌停留在木質(zhì)部導(dǎo)管壁上并且從木質(zhì)部流液中汲取營養(yǎng)。然而，影響細(xì)胞薄膜在這種生物中形成的因素未知。我們發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌野生型菌株K60在PVC盤的液-氣界面形成細(xì)胞薄膜(Fig.6A)與青枯雷爾氏菌AW1菌株(33)以及另一個(gè)植物相關(guān)細(xì)菌熒光假單胞菌P.fluorescens(46)形成物類似。有趣的是，青枯雷爾氏菌趨氧性突變株形成的細(xì)胞薄膜比野生菌株K60厚(Fig.6Aand6B)。這個(gè)結(jié)果是未預(yù)料到的，由于不運(yùn)動(dòng)和無趨性的的銅綠假單胞菌P.aeruginosa突變株的細(xì)胞薄膜形成受損(36,45)。非趨氧性菌株（能運(yùn)動(dòng)和保留一般趨性）形成的細(xì)胞薄膜表型與哪些完全不能運(yùn)動(dòng)或完全喪失趨性的菌株沒有任何區(qū)別，表明這些突變株細(xì)胞薄膜厚與缺乏趨氧性有關(guān)，野生菌株利用趨氧性來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的形成。由于青枯雷爾氏菌是微量需氧的生物，我們推測在液-氣界面厚細(xì)胞薄膜的形成是由于毒力作用導(dǎo)致在這個(gè)區(qū)域形成高濃度氧造成的。趨氧性可能導(dǎo)致大量的野生細(xì)菌細(xì)胞避開液-氣界面，被引導(dǎo)到這兒的細(xì)菌細(xì)胞形成細(xì)胞薄膜阻止更高濃度氧的形成。趨氧性突變株，這些菌株不能感應(yīng)和阻止高濃度氧，這導(dǎo)致細(xì)胞薄膜形成更厚?？赡茉谶@個(gè)病原菌自然棲息地，趨氧性行為是一種典型的浮游細(xì)胞特性而不是鉚釘細(xì)胞薄膜細(xì)胞的特性。此外，還需要試驗(yàn)觀察野生菌株及非趨氧性突變株的植物細(xì)胞薄膜的形成。許多有關(guān)青枯雷爾氏菌趨氧性的問題還有待研究。青枯雷爾氏菌的Aer1和Aer2蛋白是否還有其它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能？青枯雷爾氏菌是如何調(diào)控趨氧性相關(guān)基因的表達(dá)？是什么因子在植物根部或寄主體內(nèi)引發(fā)趨氧性轉(zhuǎn)導(dǎo)？趨氧性在表層細(xì)胞薄膜的形成中有什么作用？我們的試驗(yàn)結(jié)果表明趨氧性/能量趨性有助于青枯雷爾氏菌在復(fù)雜和難于理解的根表層和寄主植物體內(nèi)的成功導(dǎo)航。參考文獻(xiàn)Alexandre,G.,S.Greer-Phillips,andI.B.Zhulin.2021.Ecologicalroleofenergytaxisinmicroorganisms.FEMSMicrobiol.Rev.28:113-126.[PubMed].Alexandre,G.,S.E.Greer,andI.B.Zhulin.2021.EnergytaxisisthedominantbehaviorinAzospirillumbrasilense.J.Bacteriol.182:6042-6048.[PubMed].Allen,C.,Y.Huang,andL.Sequeira.1991.CloningofgenesaffectingpolygalacturonaseproductioninPseudomonassolanacearum.Mol.Plant-MicrobeInteract.4:147-154.Altschul,S.F.,T.L.Madden,A.A.Schaffer,J.Zhang,Z.Zhang,W.Miller,andD.J.Lipman.2021.GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.25:3389-3402.[PubMed].Aravind,L.,andC.P.Ponting.2021.Thecytoplasmichelicallinkerdomainofreceptorhistidinekinaseandmethyl-acceptingproteinsiscommontomanyprokaryoticsignallingproteins.FEMSMicrobiol.Lett.176:111-116.[HYPERLINK"/redirect3.cgi?&&au