2015年實驗三間接ELISA

一、基本原理

它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。第一頁，共19頁。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）第二頁，共19頁。酶標抗體技術(shù)的基本程序1、將酶分子與抗原或抗體分子共價結(jié)合2、將酶標抗體(抗抗體)與吸附于固相載體上的抗原(抗體)發(fā)生特異性結(jié)合，并洗下未結(jié)合的物質(zhì)3、滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解過程中由另外的供氫體提供氫離子，使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。因而，可根據(jù)底物溶液的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)。第三頁，共19頁。間接ELISA間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。第四頁，共19頁。底物顯色反應(yīng)抗原包被一抗反應(yīng)二抗反應(yīng)基本流程結(jié)果測定第五頁，共19頁。一、抗原包被固相載體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類第六頁，共19頁。包被條件

包被液 pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第七頁，共19頁。二、封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。第八頁，共19頁。三、洗滌

在板式ELISA中，常用的洗滌液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。第九頁，共19頁。四、一抗反應(yīng)

常用抗體：血清、單抗、體液等，常用封閉液稀釋后使用。第十頁，共19頁。

酶標記的抗抗體是ELISA中關(guān)鍵的試劑。常用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體。用封閉液稀釋后使用。（2000-8000倍稀釋）五、二抗反應(yīng)

第十一頁，共19頁。六、底物反應(yīng)HRP的底物：四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，H2O2為受氫體。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。第十二頁，共19頁。七、

結(jié)果判斷

ELISA檢測儀，讀每孔的OD值。A.陽性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準。B.標本/陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值大于等于2。第十三頁，共19頁。豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒用于檢測豬血清中抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗體，評價PCV2疫苗的免疫效果和感染豬的血清學(xué)診斷。第十四頁，共19頁。PCV編碼蛋白電鏡下觀察PCV病毒粒子ORF3：凋亡相關(guān)蛋白，與病毒的體內(nèi)外致病力相關(guān)ORF1：編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白Rep和Rep’

，促進PCV

的復(fù)制OR