聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、PCR的定義在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR技術(shù)的創(chuàng)建Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三KaryB.Mullis（1944－）第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三二、PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopied第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR技術(shù)原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCRproduct第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR儀第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三四、PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5ul

（Mg2+）1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulHome第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三五、PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三六、PCR的類型及應(yīng)用1、PCR的類型反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)：RNA的反轉(zhuǎn)錄與PCR的聯(lián)合應(yīng)用原位PCR技術(shù)：在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，不需要提取DNA實(shí)時(shí)PCR技術(shù)：進(jìn)行DNA的定量分析筑巢PCR彩色PCR多重PCR不對(duì)稱PCR共享引物PCR差異顯示PCR錨定PCR重組PCR第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三2、PCR的應(yīng)用研究

-基因克隆、測(cè)序、分析突變?cè)\斷

-細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)、診斷人類基因組工程

-遺傳圖譜的構(gòu)建、測(cè)序、表達(dá)圖譜法醫(yī)

-犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤檢測(cè)其他……第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別、親子鑒定1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。有時(shí)犯罪物證量很少，不足以用來進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三什么是“DNA指紋技術(shù)”？世界上除同卵雙生外，幾乎沒有指紋一模一樣的兩個(gè)人，所以指紋可以用來鑒別身份。研究表明，每個(gè)人的DNA