【課件】2023屆高三生物一輪復(fù)習(xí)課件：+多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR的概念及本質(zhì)PCR技術(shù)的原理PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR技術(shù)的特點(diǎn)PCR的條件細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制的比較實(shí)驗(yàn)小結(jié)及注意事項(xiàng)練習(xí)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR

的概念及本質(zhì)

是一種體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。PCR技術(shù)的原理

在80－100℃范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性；

當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈;PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。DNA雙鏈單鏈變性（加熱95℃

）復(fù)性（緩慢冷卻55℃

）變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合DNA分子的熱變性原理PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR循環(huán)：變性→復(fù)性（退火）→延伸……PCR循環(huán)：變性→復(fù)性（退火）→延伸……PCR循環(huán)：變性→復(fù)性（退火）→延伸……PCR循環(huán)：變性→復(fù)性（退火）→延伸……從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸;DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增;PCR循環(huán)的結(jié)果PCR整個(gè)過(guò)程循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量PCR的條件模板；四種脫氧核苷酸;兩種引物;耐高溫的DNA聚合酶;緩沖溶液；嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。你能歸納得出PCR的條件嗎？

DNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來(lái)的，酶活性在100℃條件下，能保持幾個(gè)小時(shí)。而其最適溫度在72℃左右。1、耐高溫的DNA聚合酶2、引物引物長(zhǎng)度以15～30個(gè)堿基為宜，引物過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響與模板的退火效率；

兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)。

引物濃度要適宜，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)特異性也較好。引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵！使用PCR的前提是：已知目的基因(或DNA片段)兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成反應(yīng)必需的雙引物。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。PCR技術(shù)的特點(diǎn)快速、高效、靈活、易于操作循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,824體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物RNA人工合成的

DNA單鏈片段底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶普通DNA聚合酶耐高溫

DNA聚合酶反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別

PCR儀加熱使＿＿＿變性,復(fù)性使引物與模板

DNA＿＿＿,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫＿＿＿，在

＿＿＿＿＿的作用下,以＿＿＿＿＿＿＿＿為原料，

以＿＿＿為復(fù)制的起點(diǎn)，合成新鏈，如此重復(fù)改變

反應(yīng)溫度，經(jīng)＿＿＿＿＿＿＿＿＿三個(gè)階段為一個(gè)

循環(huán)，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一

倍，一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán)，最終使基因放大了

數(shù)百萬(wàn)倍。模板互補(bǔ)Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72℃實(shí)驗(yàn)小結(jié)PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭.注意事項(xiàng)1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)