LC-MSGC-MS聯(lián)用技術(shù)在天然藥物化學(xué)中應(yīng)用

主要內(nèi)容1.高效液相色譜（HPLC）2.質(zhì)譜（ＭＳ）３．核磁共振（ＮＭＲ）４．ＬＣ－ＭＳ在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用４.１定性分析４.１.１混合物中已知化合物的結(jié)構(gòu)分析４.１.２混合物中未知成分結(jié)構(gòu)分析４.２定量分析５.ＬＣ－ＮＭＲ在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用６.ＬＣ－ＮＭＲ－ＭＳ的應(yīng)用７．LC-MS和LC-NMR的應(yīng)用前景第一頁，共26頁。1高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)第二頁，共26頁。1.1高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展：高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)的產(chǎn)生。薄殼型填料，柱效僅每米1000~3000塔板數(shù)5~10μm球型和無定型微粒硅膠，每米5~6萬理論塔板數(shù)高度均勻甚至單分散1~3μm硅膠基質(zhì)球形填料，達(dá)15~30萬理論塔板/m。新型分離模式和方法不斷增加第三頁，共26頁。1.2高效液相色譜法分類1根據(jù)分離原理（1）吸附色譜(adsorptionChromatography)（2）

分配色譜(partitionChromatography)（3）

離子交換色譜(ion-ExchangeChromatography)（4）體積排阻色譜(sizeExclusionChromatography)2根據(jù)固定相和液體流動(dòng)相相對(duì)極性的差別（1）正相色譜（固定相>流動(dòng)相）（2）反相色譜（固定相<流動(dòng)相）第四頁，共26頁。1.3高效液相色譜儀現(xiàn)代高效液相色譜使用3~10μm柱填料，為達(dá)到適用的流動(dòng)相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復(fù)雜和昂貴。1,2,3,--流動(dòng)相溶劑儲(chǔ)器；4,5,6,--過濾器；7—溶劑比例調(diào)節(jié)閥和混合室；8—輸液泵；9—脈動(dòng)阻尼器；10—放空閥；11—過濾器；12—反壓控制器；13—進(jìn)樣閥；14—色譜柱；15—檢測器。第五頁，共26頁。第六頁，共26頁。1.3.1流動(dòng)相貯器和溶劑處理系統(tǒng)現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個(gè)流動(dòng)相儲(chǔ)液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個(gè)儲(chǔ)瓶容積500~2000mL。儲(chǔ)液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動(dòng)時(shí)易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。儲(chǔ)器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲(chǔ)液器的溶劑導(dǎo)管入口處裝有過濾器，以進(jìn)一步除去溶劑中灰塵或微粒殘?jiān)?，防止損壞泵、進(jìn)樣閥或堵塞色譜柱。第七頁，共26頁。1.3.2高壓泵系統(tǒng)通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液壓；輸出無脈動(dòng)恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒有爆炸危險(xiǎn)，因?yàn)橐后w的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復(fù)柱塞泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點(diǎn)。第八頁，共26頁。1.3.3進(jìn)樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。進(jìn)樣閥第九頁，共26頁。1.3.4高效液相色譜柱色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。第十頁，共26頁。

（1)色譜柱類型按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類型。(2)保護(hù)柱一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長使用壽命。(3)柱恒溫器對(duì)色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。第十一頁，共26頁。(4)柱填充技術(shù)根據(jù)填料粒徑大小采用干法或濕法裝柱。粒徑大于20μm，采用類似氣相色譜的干法裝柱，實(shí)際上這種方法己很少使用。目前大多數(shù)采用10μm以下填料，以稱為等密度勻漿濕法裝柱。注:1.高壓泵，2.壓力表，3.排空氣閥，4.勻漿罐，5.色譜柱，6.加壓介質(zhì)瓶，7.廢液杯。第十二頁，共26頁。1.3.5液相色譜檢測器在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。常用的檢測器有:l.光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極管陣列檢測器，紅外吸收檢測器2.熒光檢測器3.示差折光率檢測器4.蒸發(fā)光散射檢測器5.電化學(xué)檢測器第十三頁，共26頁。2質(zhì)譜

質(zhì)譜：指把帶電荷的分子或經(jīng)一定方式裂解形成的碎片離子按照核質(zhì)比（m/z）大小排列而成的圖譜。特點(diǎn)與用途①靈敏度高（10-11g）；②分析速度快1~幾秒③測定對(duì)象廣，氣體、液體、固體。用途：①求精確分子量②鑒定化合物③推斷結(jié)構(gòu)④測Cl、Br等原子數(shù)第十四頁，共26頁。2.1質(zhì)譜儀產(chǎn)生離子流m/z1樣品導(dǎo)入系統(tǒng)：被分析的試樣通過進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)入質(zhì)譜儀，使試樣在不被破壞的情況下進(jìn)入離子源。2離子源：分為電離室和加速室。試樣在電離室被電離，在電離室出口，對(duì)離子施加一個(gè)加速電壓，使電離的粒子進(jìn)入質(zhì)量分析儀。主要的離子源：電子轟擊源（EI）：化學(xué)電離源（CI）：快原子轟擊離子源（FAB）：基質(zhì)輔助激光解析電離源（MALDI）大氣電壓源（API）：數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十五頁，共26頁。3質(zhì)量分析儀：為質(zhì)譜儀的核心，可以把不同荷質(zhì)比的離子分開。4檢測器：檢測各種質(zhì)荷比的離子，不同類型的檢測器檢測的原理不同5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集、存儲(chǔ)、處理、打印、檢索等。第十六頁，共26頁。2.2質(zhì)譜中的主要離子一、分子離子：

①奇數(shù)個(gè)電子M

-e

M·+②譜圖最右端③確定分子量二、碎片離子:①“·+”含奇數(shù)e②或“+”含偶數(shù)e③+電荷標(biāo)在上方④不確定時(shí)“·+”或“”第十七頁，共26頁。2.3質(zhì)譜中的裂解類型陽離子的裂解類型1.單純開裂①均裂：若R1>R2②異裂：第十八頁，共26頁。③半異裂最易失電子的是雜原子

n電子>π電子>電子(C-C>C-H)失電子能力第十九頁，共26頁。質(zhì)譜中的裂解類型2重排開裂（重排離子更穩(wěn)定）麥?zhǔn)现嘏牛河胁伙柡椭行腃=X(X=O,N,S,C)有γ氫，能轉(zhuǎn)移到X原子上，脫掉一個(gè)中性分子第二十頁，共26頁。3核磁共振最早美國兩所大學(xué)1945年同時(shí)發(fā)現(xiàn)NMR哈佛的Purcell和Pound發(fā)現(xiàn)石臘質(zhì)子有NMR現(xiàn)象斯坦福大學(xué)的Bloch和Honson發(fā)現(xiàn)H2O中質(zhì)子有NMRPurcell和Bloch因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1953年第一臺(tái)儀器商品化，當(dāng)時(shí)僅30MHZ至今50多年中，這門學(xué)科共12位科學(xué)家獲諾貝爾獎(jiǎng)第二十一頁，共26頁。核磁共振波譜的產(chǎn)生第二十二頁，共26頁。磁鐵：提供穩(wěn)定的高強(qiáng)度磁場

H掃場線圈：附加磁場，可調(diào)節(jié)

D接收線圈：產(chǎn)生感應(yīng)電流

R照射線圈：與外磁場H0垂直，有60兆，90兆；兆數(shù)越高，圖譜越精密。注：三個(gè)線圈互相垂直，互不干擾。第二十三頁，共26頁。4ＬＣ－ＭＳ在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用